1. Erzeugung von MSC-mito-GFP- und ARPE19-mito-RFP-Zelllinien ZellkulturHINWEIS: Als Beispiel werden hier nur MSCs verwendet.Kulturieren Sie humane MSCs in einer 6-Well-Platte in hMSC-Medium mit 1 % Penicillin und Streptomycin (siehe Materialtabelle), bis die Zelldichte 80 %-90 % erreicht. Wechseln Sie je nach Dichte des Zellwachstums das Medium alle 2-3 Tage.Entfernen Sie das ursprüngliche Medium und waschen Sie die Zellen einmal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) (siehe Materialtabelle). 1 ml des Trypsin-EDTA-DPBS-Gemisches (0,05 % Trypsin-EDTA: 0,25 % Trypsin-EDTA verdünnt mit DPBS im Verhältnis 1:5; siehe Materialtabelle) zugeben und 3-4 min (abhängig von den Zellen) in einem 37 °C Inkubator inkubieren.HINWEIS: Beobachten Sie den Zellverdau unter einem Mikroskop und stoppen Sie den Verdau, wenn die meisten Zellen abgerundet und abgelöst sind. Klopfen Sie vorsichtig auf die 6-Well-Platte, um die an der Oberfläche haftenden Zellen zu lösen, und fügen Sie dann 1 ml frisches vollständiges Medium hinzu, um die Verdauung zu beenden. Resuspendieren Sie alle Zellen vorsichtig mit einer Pipettenpistole und überführen Sie anschließend alle gesammelten Zellen in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 × g für 5 min. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen durch Zugabe von 1 ml frischem Medium. Nehmen Sie 10 μl Zellsuspension für die Zellzählung ein. Achtzehn bis 24 Stunden vor der lentiviralen Transfektion werden MSC-Zellen mit einer Dichte von 1 × 105 Zellen pro Well in 6-Well-Platten ausgesät, wobei sichergestellt wird, dass die Zelldichte zum Zeitpunkt der Transfektion etwa 50 % beträgt. Transfektion des LentivirusHINWEIS: Alle Vorgänge im Zusammenhang mit der lentiviralen Transfektion müssen in einer Biosicherheitswerkbank durchgeführt werden.Ersetzen Sie das ursprüngliche Medium am nächsten Tag durch 2 mL frisches Medium und fügen Sie 25 μl Lentivirus-Suspension (5,00 E+08 TU/ml) mit Adjuvantien hinzu, gefolgt von einer Inkubation bei 37 °C.HINWEIS: Die Verpackung des Lentivirus wurde von einem Unternehmen unter Verwendung des Plasmids Mito-GFP (pCT-Mito-copGFP) (siehe Materialtabelle und ergänzende Abbildung S1) durchgeführt. Nach 6 Stunden Inkubation ist das virushaltige Medium durch 2 ml frisches Medium zu ersetzen. Inkubieren Sie weiter und wechseln Sie das Medium einmal täglich.HINWEIS: Eine signifikante mitochondriale Fluoreszenzexpression wird bei MSCs 48 h nach der Transfektion beobachtet, wobei eine weitere Verstärkung zum Zeitpunkt von 72 h erkennbar ist. Screenen Sie erfolgreich transfizierte Zellen, indem Sie das Kulturmedium 2 Tage nach der Transfektion mit Puromycin (1 μg/ml) ergänzen. Gleichzeitig wird eine äquivalente Konzentration von Puromycin zu mesenchymalen Stammzellen ohne virale Transfektion als Kontrolle hinzugefügt.HINWEIS: Der mito-GFP-Virusvektor wurde so entwickelt, dass er das Puromycin-Resistenzgen enthält. Wechseln Sie das Medium täglich mit der Einführung von Puromycin (1 μg/ml). Stoppen Sie die Puromycin-Zugabe bei nahezu vollständigem Zelltod in der Kontrollgruppe.HINWEIS: Das Medium enthält diese Konzentration von Puromycin nicht. Die Zugabe von Puromycin ist nur erforderlich, wenn das Medium in eine 6-Well-Platte gegeben wird. Fahren Sie mit der Kultivierung ohne Puromycin fort, bis die Zellen passageiert und eingefroren sind. Nennen Sie diesen Zelltyp MSC-mito-GFP.HINWEIS: ARPE19-Zellen wurden aus der ATCC-Zellbank gewonnen und in DMEM/F12 kultiviert, die 10 % FBS und 1 % Penicillin und Streptomycin enthielten (siehe Materialtabelle), und die Methoden ihres Verdaus und ihrer Passage sind die gleichen wie bei MSCs. Das Plasmid Mito-RFP wurde von einem Unternehmen aus Mito-GFP modifiziert. Schließlich nannten wir die erfolgreich transfizierten Zellen ARPE19-mito-RFP. 2. Direkte Co-Kultur von MSC- und ARPE19-Zellen HINWEIS: In diesem Co-Kultursystem dienen MSC-mito-GFP-Zellen als Spenderzellen, während ARPE19-mito-RFP-Zellen als Empfängerzellen fungieren. Um zwischen Spender- und Empfängerzellen zu unterscheiden, haben wir Empfängerzellen verfolgt. Markieren Sie ARPE19-mito-RFP-Zellen mit CellTrace Violet (siehe Materialtabelle) in der zytoplasmatischen Membran.HINWEIS: Die Anregung und Emission des Farbstoffs CellTrace violett beträgt 405 nm bzw. 450 nm.Bereiten Sie eine CellTrace Violet (siehe Materialtabelle) Stammlösung vor, indem Sie 20 μl Dimethylsulfoxid (DMSO) in ein Fläschchen mit CellTrace Violet Reagenz geben und unmittelbar vor der Verwendung gut mischen. Züchten Sie die ARPE19-mito-RFP-Zellen auf die gewünschte Dichte von 80%-90%. Verdünnen Sie die CellTrace Violet Stammlösung in vorgewärmtem (37 °C) DPBS auf die gewünschte Arbeitskonzentration (1:1.000). Das ist die Ladelösung.HINWEIS: Die Verdünnung von CellTrace Violet muss mit DPBS durchgeführt werden und kann nicht durch Kulturmedium ersetzt werden, da dies zu sehr schlechten Färbeergebnissen führt. Entfernen Sie das Nährmedium und ersetzen Sie es durch 1 ml Ladelösung. Inkubieren Sie die Zellen 10 Minuten lang bei 37 °C.HINWEIS: Wenn die Bedingungen es zulassen, kann die Färbung nach 5 Minuten unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet werden. Die Färbung kann beendet werden, sobald die gewünschten Ergebnisse erreicht sind, da einige Zellen möglicherweise nicht in der Lage sind, eine längere Exposition gegenüber DPBS zu vertragen. Entfernen Sie die Ladelösung, waschen Sie die Zellen 2x mit DPBS und ersetzen Sie sie durch 2 mL frisches vollständiges Medium. Inkubieren Sie die Zellen nach der Färbung mindestens 10 Minuten lang, damit das CellTrace Violet einer Acetathydrolyse unterzogen werden kann.HINWEIS: Dieser Schritt ist notwendig, damit die Zellen in ihren optimalen Zustand zurückkehren und nachfolgende Experimente nicht beeinträchtigt werden. Bereiten Sie eine 24-Well-Platte vor, indem Sie 50 μl DPBS in jede Vertiefung geben. Anschließend das Deckglas (mit einem angegebenen Durchmesser von 15 mm) (siehe Materialtabelle) in die Platte einsetzen und 1 min einwirken lassen. Entfernen Sie das DPBS aus den Vertiefungen und verwenden Sie Unterdruck, um sicherzustellen, dass sich der Abdeckschieber nahe am Boden der Schale befindet. Trypsinisieren Sie Spender-MSCs und Empfänger-ARPE19-Zellen wie in Schritt 1.1.1 beschrieben. Zellzählung10 μl Zellsuspension zur Zählung auf eine Zählplatte geben.HINWEIS: Wenn die Dichte der Zellen zu hoch ist, können sie 10-fach mit Medium verdünnt werden und dann wie oben beschrieben vorgehen. 10.000 MSCs und 10.000 ARPE19-Zellen in 500 μl Medium pro Well einer 24-Well-Platte aussäen. Mischen Sie die Zellen gut, bevor Sie sie auf die 24-Well-Platte geben. Siehe die unten gezeigten Berechnungen bei einer MSC-Zahl von A/ml und einer ARPE19-Zellzahl von B/ml.HINWEIS: Für 4 Wells sind 40.000 MSCs und 40.000 ARPE19-Zellen in 2 ml Medium erforderlich.Volumen der MSC-Suspension (C) mit 40.000 MSC = 40.000/A μlVolumen der ARPE19-Suspension (D) mit 40.000 MSC = 40.000/B μLFüllen Sie das Volumen auf 2 mL mit 2 – (C + D) mL Medium auf. Beobachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop, schütteln Sie die Platte, bis die Zellen gleichmäßig verteilt sind, und inkubieren Sie sie dann 24 Stunden lang in der Kultur. 3. Indirekte Co-Kultur von MSC- und ARPE19-Zellen in einem Transwell-System Führen Sie Zellkultur, Markierung, Verdau und Zählung durch, wie in den Schritten 2.1 bis 2.4.1 beschrieben. Keimen Sie 20.000 ARPE19-Zellen in 1 ml Medium pro Well einer 24-Well-Platte.HINWEIS: In diesem Experiment haben wir ARPE19-Zellen ohne markierte Mitochondrien verwendet. Setzen Sie den Einsatz in die Vertiefung ein, in die die Zelle ausgesät wurde. 10.000 MSCs in 100 μl Medium in der oberen Zellkammer pro Vertiefung aussäen. Wiederholen Sie Schritt 2.5. 4. Färbung des Zytoskeletts HINWEIS: Während des gesamten Experiments vor Licht schützen. Entfernen Sie das Medium von den 24-Well-Platten. Waschen Sie alle Zellen einmal mit 500 μl/Vertiefung 4 % Polyformaldehyd (PFA), fügen Sie 500 μl frisches 4 % PFA hinzu und fixieren Sie die Proben für 20 Minuten.HINWEIS: Die Einschübe des Transwell-Systems werden verworfen.HINWEIS: Da Nanoröhren sehr zerbrechlich sind, haben wir die Zellen direkt mit 4 % PFA anstelle von DPBS gewaschen, um die Retention intakter Nanoröhren zu maximieren. Entfernen Sie das Fixiermittel und waschen Sie die Proben 3 x 10 min lang mit DPBS. 500 μl/Vertiefung Blockierungslösung bestehend aus 0,5 % Triton X-100 (siehe Materialtabelle) und 4 % Rinderserumalbumin (BSA) (siehe Materialtabelle) zugeben und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie die Blockierlösung und waschen Sie die Proben 3 x 10 min lang mit DPBS. Herstellung der Phalloidin-Färbelösung (siehe Materialtabelle)HINWEIS: Die Anregung und Emission von Phalloidin beträgt 650 nm bzw. 668 nm.Bereiten Sie Stammlösungen vor, indem Sie den Inhalt des Fläschchens in 150 μl wasserfreiem DMSO auflösen, um eine 400-fache Stammlösung zu erhalten. Bereiten Sie die Färbelösung vor, indem Sie die 400-fache Lagerlösung mit DPBS auf 1-fach verdünnen. Dies ist die Phalloidin-Färbelösung. 200 μl Phalloidin-Färbelösung in jede Vertiefung geben und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Die Färbelösung zurückgewinnen und die Probe 3 x 10 min mit DPBS waschen.HINWEIS: Wenn Sie die Zellen mit DPBS waschen, ist es besser, die Platte auf einem Schüttler zu belassen. Nehmen Sie das Deckglas mit einer Spritzennadel heraus und lassen Sie es an der Luft trocknen.HINWEIS: Der optimale Zustand ist einer, in dem keine sichtbare Flüssigkeit auf dem Deckglas zu sehen ist, das Glas aber auch nicht trocken ist. Tragen Sie eine kleine Menge Eindeckmittel (siehe Materialtabelle) auf den Objektträger auf und drehen Sie das Deckglas auf dem Objektträger vorsichtig um, um sicherzustellen, dass das Medium die gesamte Oberfläche gleichmäßig bedeckt. Versiegeln Sie die Ränder mit Nagellack.HINWEIS: Warten Sie einige Minuten, bis der Nagellack ausgetrocknet ist. Nehmen Sie umgehend ein konfokales Bild auf oder übertragen Sie es in eine Slice-Box und lagern Sie es für kurze Zeit bei 4 °C.HINWEIS: Die ideale Lagerzeit beträgt 2 Wochen. Wird diese Zeit überschritten, kann sich der Abbildungseffekt verschlechtern. 5. Konfokale Bildgebung HINWEIS: Die konfokale Bildgebung wird gemäß der Bedienungsanleitung durchgeführt und kann je nach Mikroskop variieren. Hier geben wir nur einige der wichtigsten Schritte an. Starten Sie das konfokale Mikroskop und öffnen Sie vier Laserkanäle (405, 488, 561, 640) gemäß Bedienungsanleitung. Greifen Sie auf die Software am Computer zu und führen Sie vorläufige Parametrierungen der Software durch.Fügen Sie die Fluoreszenzkanäle CF-405, CF-488, CF-561 und CF-640 im Bereich Prozessmanagement hinzu. Stellen Sie die Belichtungszeit jedes Fluoreszenzkanals auf 200 ms ein und stellen Sie die Verstärkungsintensität in der Kamerasteuerung auf 2 ein. Stellen Sie den Laser/LED-Combiner auf einen Wert von 80 ein. Manipulieren Sie das externe Bedienfeld des Mikroskops, um das Objektiv auf eine 20-fache Vergrößerung einzustellen und sicherzustellen, dass das Objektiv auf der niedrigsten Einstellung positioniert ist. Positionieren Sie die Schiene in umgekehrter Ausrichtung auf dem Trägertisch. Aktivieren Sie den 405-nm-Laser und manipulieren Sie den Fokus mit den groben und feinen Fokussierspiralen. Beobachten Sie die Probe unter dem Okular, bis blau fluoreszierende Zellen sichtbar sind. Wählen Sie Live Imaging in der Software-Oberfläche des Computers, wechseln Sie zum CF-405-Kanal und stellen Sie die Feinfokus-Helix neu ein, bis ein deutliches Bild der Zellen mit blauer Fluoreszenz auf dem Computerbildschirm sichtbar ist. Stellen Sie das Objektiv auf 40-fache Vergrößerung und Übergang zum CF-640-Kanal ein und stellen Sie dann den Fokus vorsichtig ein, bis eine deutliche zelluläre Mikrofilamentstruktur sichtbar ist. Beibehaltung einer konstanten Brennweite, sequentieller Übergang zu den Kanälen CF-405, CF-488 und CF-561 und Änderung der Parameter für die optimale Belichtungszeit, Verstärkungsintensität und Laser /LED-Combiner für die Bildgebung innerhalb jedes Kanals nach Bedarf. Aktivieren Sie die Funktion Z-Bildstapel und definieren Sie den Anfangs- und Endpunkt der Z-Achse, indem Sie die Brennweite manipulieren, um ein Bild mit Tiefe mit der Z-Achse aufzunehmen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Start im Bereich Prozessmanagement , um ein Foto aufzunehmen. Wählen Sie 10 Sichtfelder nach dem Zufallsprinzip für jedes Segment aus.HINWEIS: Es sollte keine Überlappung zwischen zwei beliebigen Sichtfeldern geben. Aktivieren Sie die Zeitrafferfunktion, indem Sie eine Gesamtbilddauer von 24 h und ein Fotointervall von 5 min nach Identifizierung des gewünschten Sichtfeldes angeben.HINWEIS: Um eine Zeitraffersequenz aufzunehmen, ist es notwendig, die Zellen in einer Schale mit Glasboden zu inokulieren und sie in einer belüfteten Box mit 5 % CO2 -Gas zu positionieren. Speichern und exportieren Sie alle Bilder.HINWEIS: Um die Untersuchung von TNT und mitochondrialem Transfer zu verbessern, wurde superhochauflösende Bildgebung eingesetzt. Die hochauflösende Bildgebung wurde mit kommerzialisierter HIS-SIM durchgeführt, die als HIS-SIM (High Intelligent and Sensitive SIM) bezeichnet wurde und von einem Unternehmen bereitgestellt wurde. Die Bilder wurden mit einem 100x/1,5 NA Ölimmersionsobjektiv aufgenommen. 6. Datenanalyse Für die statistische Analyse jedes Bildes quantifizieren Sie die Gesamtzahl der Zellen, die Anzahl der Nanoröhren, die Anzahl der Violett-positiven ARPE19-Mito-RFE-Zellen, die Anzahl der Violett-positiven Zellen mit grüner Fluoreszenz (entspricht der Anzahl der ARPE19-Zellen mit mitochondrialem Transfer von MSCs) und die Anzahl der violett-negativen Zellen mit roter Fluoreszenz (entspricht der Anzahl der MSC-Zellen mit mitochondrialem Transfer von ARPE19-Zellen).Um die TNT-Bildung zu quantifizieren, berechnen Sie das Verhältnis der Anzahl der interzellulären Nanoröhren zur Gesamtzahl der Zellen. Berechnen Sie die mitochondriale Transferrate als das Verhältnis der Anzahl der violett-positiven Zellen mit grüner Fluoreszenz zur Gesamtzahl der violett-positiven Zellen (entspricht dem mitochondrialen Transfer von MSCs zu ARPE19-Zellen) oder dem Verhältnis der Anzahl der violett-negativen Zellen mit roter Fluoreszenz zur Gesamtzahl der violett-negativen Zellen (entspricht dem mitochondrialen Transfer von ARPE19-Zellen zu MSCs).