Imágenes de calcio in vivo de células granulosas en el giro dentado del hipocampo en ratones

Estudios previos encontraron que el hipocampo es una estructura cerebral esencial para procesar y recuperar recuerdos ^1,2. Desde la década de 1950, los circuitos neuronales del hipocampo en roedores han sido un foco en el estudio de la formación, almacenamiento y^{recuperación de la} memoria. Las estructuras anatómicas dentro del hipocampo incluyen las subregiones del giro dentado (DG), CA1, CA2, CA3, CA4 y subículo⁴. Existen conexiones bidireccionales complejas entre estas subregiones, de las cuales DG, CA1 y CA3 forman un circuito trisináptico prominente que consta de células granulosas y células piramidales⁵. Este circuito recibe su entrada primaria de la corteza entorrinal (EC) y ha sido un modelo clásico para estudiar la plasticidad sináptica. Las investigaciones previas in vivo sobre la función del hipocampo se han concentrado principalmente en el CA1 ^6,7 debido a su fácil acceso. Si bien las neuronas CA1 desempeñan un papel importante en la formación, consolidación y recuperación de la memoria, particularmente en las células de lugar para la memoria espacial, otras subregiones del hipocampo también son vitales ^8,9. En particular, estudios recientes han puesto de relieve las funciones de la DG en la formación de la memoria. Se ha informado de que las células de lugar en DG son más estables que las de CA1¹⁰, y sus actividades reflejan información específica del contexto¹¹. Además, el marcaje dependiente de la actividad de las células granulosas DG puede reactivarse para inducir comportamientos relacionados con la memoria¹². Por lo tanto, para obtener una comprensión más profunda de la codificación de la información en DG, es crucial investigar las actividades de la subregión de DG mientras el animal lleva a cabo tareas dependientes de la memoria.

Los estudios previos de las actividades de DG han utilizado principalmente la electrofisiología in vivo ¹³. Sin embargo, esta técnica tiene algunos inconvenientes: en primer lugar, en las grabaciones eléctricas, puede ser difícil identificar directamente los distintos tipos de células que generan la señal. Las señales registradas provienen tanto de células inhibidoras como excitadoras. Por lo tanto, se requieren más métodos de procesamiento de datos para separar estos dos tipos de células. Además, es difícil combinar otra información de tipo de célula, como los subgrupos específicos de la proyección o el etiquetado dependiente de la actividad, con registros eléctricos. Además, debido a la morfología anatómica de la DG, los electrodos de registro a menudo se implantan en una dirección ortogonal, lo que limita en gran medida el número de neuronas que se pueden registrar. Por lo tanto, es difícil que los registros eléctricos logren monitorear cientos de neuronas individuales de la estructura DG en el mismo animal¹⁴.

Una técnica complementaria para registrar las actividades neuronales en DG es el uso de imágenes de calcio in vivo ¹⁵. Los iones de calcio son fundamentales para los procesos de señalización celular en los organismos, desempeñando un papel crucial en muchas funciones fisiológicas, especialmente dentro del sistema nervioso de los mamíferos. Cuando las neuronas están activas, la concentración de calcio intracelular aumenta rápidamente, lo que refleja la naturaleza dinámica de la actividad neuronal y la transmisión de señales. Por lo tanto, el registro de los cambios en tiempo real en los niveles de calcio intracelular en las neuronas proporciona información importante sobre los mecanismos de codificación neuronal.

La tecnología de imágenes de calcio utiliza tintes fluorescentes especializados o indicadores de calcio modificados genéticamente (GECI) para monitorear las concentraciones de iones de calcio en las neuronas mediante la detección de cambios en la intensidad de la fluorescencia, que luego se pueden capturar a través^{de imágenes} microscópicas. Comúnmente, se emplea la familia GCaMP de genes indicadores de calcio, que comprende secuencias de proteína fluorescente verde (GFP), calmodulina y polipéptidos M13. GCaMP puede emitir fluorescencia verde cuando se une a los iones de calcio¹⁷, lo que permite registrar las fluctuaciones en la fluorescencia verde a través de imágenes¹⁸. Además, para obtener imágenes claras de la región del cerebro objetivo, se suele implantar una lente de índice de gradiente (lente GRIN) sobre la región de interés. La lente GRIN permite obtener imágenes de la región profunda del cerebro a la que no se puede acceder directamente desde la superficie.

Esta técnica es relativamente fácil de combinar con otras herramientas genéticas para etiquetar diferentes tipos de células. Además, como el plano de imagen es paralelo a la orientación de las células en DG, cientos de neuronas son accesibles para la obtención de imágenes con cada cirugía exitosa. En este trabajo presentamos un protocolo quirúrgico completo y detallado para la obtención de imágenes de calcio in vivo en el giro dentado en ratones (Figura 1). El procedimiento implica dos operaciones principales. La primera es inyectar el virus AAV-CaMKIIα-GCaMP6f en el DG. La segunda operación consiste en implantar una lente GRIN sobre el lugar de la inyección del virus. Estos dos procedimientos se llevan a cabo en la misma sesión. Después de la recuperación de estas cirugías, el siguiente paso es verificar la calidad de las imágenes con microscopios miniaturizados (miniscopios). Si el campo de imagen tiene cientos de células activas, el procedimiento posterior es fijar la placa base del miniscopio al cráneo del ratón con cemento dental; A continuación, el ratón se puede utilizar para experimentos de imagen. También presentamos una línea de preprocesamiento basada en MATLAB para agilizar el análisis de los datos de calcio recopilados.