In Vivo: Calcium Imaging of Granule cells in the dentate gyrus of hippocampus in mice(생쥐의 해마 치열계에 있는 과립 세포의 In vivo 칼슘 이미징)

이전 연구에 따르면 해마는 기억을 처리하고 검색하는 데 필수적인 뇌 구조입니다 ^1,2. 1950년대 이래로 설치류의 해마의 신경회로는 기억 형성, 저장 및 회수를 연구하는 데 초점이 되어 왔다³. 해마 내의 해부학적 구조에는 치상이랑(DG), CA1, CA2, CA3, CA4 및 subiculum⁴의 하위 영역이 포함됩니다. 이러한 하위 영역들 사이에는 복잡한 양방향 연결이 존재하며, 그 중 DG, CA1 및 CA3는 과립 세포와 피라미드 세포로 구성된 두드러진 삼시냅스 회로를 형성합니다⁵. 이 회로는 내측 피질(entorhinal cortex, EC)로부터 주요 입력을 받으며 시냅스 가소성(synaptic plasticity)을 연구하기 위한 고전적인 모델이었습니다. 이전의 생체 내 연구는 해마 기능에 대한 연구가 대부분 CA1 ^6,7에 집중되어 있었는데, 이는 접근이 용이하기 때문입니다. CA1 뉴런은 기억 형성, 통합 및 검색, 특히 공간 기억을 위한 장소 세포에서 중요한 역할을 하지만 해마의 다른 하위 영역도 중요합니다 ^8,9. 특히 최근 연구에서는 DG가 기억 형성에 미치는 영향을 강조하고 있다. DG의 장소 셀은 CA1(¹⁰)의 장소셀보다 더 안정적인 것으로 보고되었으며, 이들의 활동은 상황별 정보(context-specific information)¹¹를 반영한다. 또한, DG 과립 세포의 활동 의존적 표지는 기억 관련 행동을 유도하기 위해 재활성화될 수 있다¹². 따라서 DG의 정보 코딩에 대한 더 깊은 이해를 얻으려면 동물이 메모리 의존적 작업을 수행하는 동안 DG 하위 영역의 활동을 조사하는 것이 중요합니다.

당뇨병 활성에 대한 선행 연구는 주로 in vivo electrophysiology를 사용하였다¹³. 그러나, 이 기술에는 몇 가지 단점이 있다: 첫째, 전기적 기록에서, 신호를 생성하는 다양한 유형의 세포를 직접 식별하기 어려울 수 있다. 기록된 신호는 억제성 세포와 흥분성 세포 모두에서 나옵니다. 따라서 이 두 가지 세포 유형을 분리하기 위해 추가 데이터 처리 방법이 필요합니다. 더욱이, 투영 특이적 소그룹 또는 활동 의존적 라벨링과 같은 다른 세포 유형 정보를 전기 기록과 결합하는 것은 어렵습니다. 또한 DG의 해부학적 형태로 인해 기록 전극이 직교 방향으로 이식되는 경우가 많아 기록할 수 있는 뉴런의 수가 크게 제한됩니다. 따라서, 전기적 기록이 동일한 동물(¹⁴)의 DG 구조로부터 수백 개의 개별 뉴런을 모니터링하는 것은 어렵다.

DG에서 뉴런 활동을 기록하는 보완적인 기술은 in vivo calcium imaging¹⁵을 사용하는 것이다. 칼슘 이온은 유기체의 세포 신호 전달 과정에 필수적이며, 특히 포유류 신경계 내에서 많은 생리적 기능에서 중요한 역할을 합니다. 뉴런이 활동할 때 세포 내 칼슘 농도가 급격히 증가하여 뉴런 활동과 신호 전달의 역동적인 특성을 반영합니다. 따라서 뉴런의 세포 내 칼슘 농도의 실시간 변화를 기록하면 신경 코딩 메커니즘에 대한 중요한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

칼슘 이미징 기술은 특수 형광 염료 또는 유전자 조작 칼슘 지표(GECI)를 사용하여 형광 강도의 변화를 감지하여 뉴런의 칼슘 이온 농도를 모니터링한 다음 현미경 이미징을 통해 캡처할 수 있습니다¹⁶. 일반적으로 녹색 형광 단백질(GFP), 칼모듈린 및 M13 폴리펩티드 서열로 구성된 GCaMP 계열의 칼슘 지시자 유전자가 사용됩니다. GCaMP는 칼슘 이온⁽¹⁷)에 결합할 때 녹색 형광을 방출할 수 있으므로 이미징¹⁸을 통해 녹색 형광의 변동을 기록할 수 있습니다. 또한 표적 뇌 영역의 선명한 이미지를 얻기 위해 일반적으로 GRIN 렌즈(Gradient Index Lens)를 관심 영역 위에 이식합니다. GRIN 렌즈는 표면에서 직접 접근할 수 없는 뇌 심부 영역을 이미징할 수 있습니다.

이 기술은 다른 세포 유형을 표지하기 위해 다른 유전 도구와 결합하기가 비교적 쉽습니다. 또한, 이미징 평면이 DG의 세포 방향과 평행하기 때문에 성공적인 수술을 받을 때마다 수백 개의 뉴런에 접근할 수 있습니다. 이 연구에서는 생쥐의 치상이랑에서 생체 내 칼슘 이미징을 위한 완전하고 상세한 수술 프로토콜을 제시합니다(그림 1). 이 절차에는 두 가지 주요 작업이 포함됩니다. 첫 번째는 AAV-CaMKIIα-GCaMP6f 바이러스를 DG에 주입하는 것입니다. 두 번째 수술은 바이러스 주입 부위 위에 GRIN 렌즈를 이식하는 것입니다. 이 두 가지 절차는 같은 자리에서 수행됩니다. 이러한 수술에서 회복 후 다음 단계는 소형 현미경 (miniscope)으로 이미징 품질을 확인하는 것입니다. 이미징 필드에 수백 개의 활성 세포가 있는 경우 후속 절차는 치과용 시멘트를 사용하여 미니스코프 베이스 플레이트를 마우스 두개골에 부착하는 것입니다. 그런 다음 마우스를 이미징 실험에 사용할 수 있습니다. 또한 수집된 칼슘 데이터의 분석을 간소화하기 위한 MATLAB 기반 전처리 파이프라인도 제공합니다.