In vivo calciumbeeldvorming van korrelcellen in de getande gyrus van de hippocampus bij muizen

Eerdere studies hebben aangetoond dat de hippocampus een hersenstructuur is die essentieel is voor het verwerken en ophalen van herinneringen ^1,2. Sinds de jaren 1950 zijn de neurale circuits van de hippocampus bij knaagdieren een focus geweest bij het bestuderen van geheugenvorming, opslag en ophalen³. De anatomische structuren in de hippocampus omvatten de subregio’s van dentate gyrus (DG), CA1, CA2, CA3, CA4 en subiculum⁴. Er bestaan complexe bidirectionele verbindingen tussen deze subregio’s, waarvan de DG, CA1 en CA3 een prominent trisynaptisch circuit vormen dat bestaat uit korrelcellen en piramidale cellen⁵. Dit circuit ontvangt zijn primaire input van de entorhinale cortex (EC) en is een klassiek model geweest voor het bestuderen van synaptische plasticiteit. Eerder in vivo onderzoek naar de functie van de hippocampus heeft zich vooral geconcentreerd op de CA1 ^6,7 vanwege de gemakkelijkere toegang. Hoewel CA1-neuronen een belangrijke rol spelen bij de vorming, consolidatie en ophalen van geheugen, met name in plaatscellen voor ruimtelijk geheugen, zijn andere subregio’s van de hippocampus ook van vitaal belang ^8,9. In het bijzonder hebben recente studies de functies van DG bij geheugenvorming benadrukt. Er is gemeld dat plaatscellen in DG stabieler zijn dan die in CA1¹⁰, en hun activiteiten weerspiegelen contextspecifieke informatie¹¹. Verder kan activiteitsafhankelijke labeling van DG-korrelcellen worden gereactiveerd om geheugengerelateerd gedrag te induceren¹². Om een beter begrip te krijgen van de informatiecodering in DG, is het daarom van cruciaal belang om de activiteiten van de DG-subregio te onderzoeken terwijl het dier geheugenafhankelijke taken uitvoert.

Eerdere studies van DG-activiteiten hebben meestal gebruik gemaakt van in vivo elektrofysiologie¹³. Deze techniek heeft echter enkele nadelen: ten eerste kan het bij elektrische opnames moeilijk zijn om de verschillende soorten cellen die het signaal genereren direct te identificeren. De geregistreerde signalen zijn afkomstig van zowel remmende als exciterende cellen. Daarom zijn verdere gegevensverwerkingsmethoden nodig om deze twee celtypen te scheiden. Bovendien is het moeilijk om andere informatie over het celtype, zoals projectiespecifieke subgroepen of activiteitsafhankelijke labeling, te combineren met elektrische opnames. Bovendien worden de opname-elektroden vanwege de anatomische morfologie van DG vaak in een orthogonale richting geïmplanteerd, wat het aantal neuronen dat kan worden geregistreerd aanzienlijk beperkt. Het is dus moeilijk voor elektrische opnames om honderden individuele neuronen uit de DG-structuur in hetzelfde dier te monitoren¹⁴.

Een aanvullende techniek voor het registreren van neuronactiviteiten in DG is het gebruik van in vivo calciumbeeldvorming¹⁵. Calciumionen zijn van fundamenteel belang voor cellulaire signaleringsprocessen in organismen en spelen een cruciale rol in veel fysiologische functies, vooral in het zenuwstelsel van zoogdieren. Wanneer neuronen actief zijn, neemt de intracellulaire calciumconcentratie snel toe, wat de dynamische aard van neuronale activiteit en signaaloverdracht weerspiegelt. Daarom biedt het registreren van de real-time veranderingen in intracellulaire calciumspiegels in neuronen belangrijke inzichten in de neurale coderingsmechanismen.

Calciumbeeldvormingstechnologie maakt gebruik van gespecialiseerde fluorescerende kleurstoffen of genetisch gemanipuleerde calciumindicatoren (GECI’s) om calciumionenconcentraties in neuronen te controleren door veranderingen in fluorescentie-intensiteit te detecteren, die vervolgens kunnen worden vastgelegd door middel van microscopische beeldvorming¹⁶. Gewoonlijk wordt de GCaMP-familie van calciumindicatorgenen, bestaande uit groen fluorescerend eiwit (GFP), calmoduline en M13-polypeptidesequenties, gebruikt. GCaMP kan groene fluorescentie uitzenden wanneer het zich bindt aan calciumionen¹⁷, waardoor de fluctuaties in groene fluorescentie kunnen worden geregistreerd via beeldvorming¹⁸. Om duidelijke beelden van het doelhersengebied te verkrijgen, wordt bovendien meestal een Gradient Index Lens (GRIN-lens) geïmplanteerd boven het interessegebied. De GRIN-lens maakt beeldvorming mogelijk van het diepe hersengebied dat niet direct vanaf het oppervlak toegankelijk is.

Deze techniek is relatief eenvoudig te combineren met andere genetische tools om verschillende celtypen te labelen. Bovendien, aangezien het beeldvormingsvlak parallel loopt aan de oriëntatie van de cellen in DG, zijn honderden neuronen toegankelijk voor beeldvorming bij elke succesvolle operatie. In dit werk presenteren we een compleet en gedetailleerd operatieprotocol voor in vivo calciumbeeldvorming in de gyrus dentatus bij muizen (Figuur 1). De procedure omvat twee grote operaties. De eerste is om het AAV-CaMKIIα-GCaMP6f-virus in de DG te injecteren. De tweede operatie is het implanteren van een GRIN-lens boven de injectieplaats van het virus. Deze twee procedures worden in dezelfde zitting uitgevoerd. Na herstel van deze operaties is de volgende stap het controleren van de beeldkwaliteit met geminiaturiseerde microscopen (miniscopen). Als het beeldvormingsveld honderden actieve cellen heeft, is de volgende procedure om de basisplaat van de miniscoop met tandheelkundig cement op de schedel van de muis te bevestigen; De muis kan dan worden gebruikt voor beeldvormende experimenten. We presenteren ook een op MATLAB gebaseerde voorbewerkingspijplijn voor het stroomlijnen van de analyse van de verzamelde calciumgegevens.