Wir beschreiben ein ex vivo isoliertes funktionierendes Rattenherzprotokoll, um Strategien zur Erhaltung des Spenderherzens zu testen. In diesem Artikel wird das Protokoll für die Verwendung in der statischen Kühllagerung von Nagetierspenderherzen beschrieben. Das Protokoll kann aber auch für Spenderherzen verwendet werden, die nach einer Spende nach Kreislauftod und Hirntod gewonnen wurden.
Die Optimierung von Lösungen zur Erhaltung des Spenderherzens hat eine Schlüsselrolle bei der Reduzierung von Ischämie-Reperfusionsschäden bei Spenderherzen während der Organentnahme, des Transports und der Transplantation gespielt. Frühere Arbeiten aus unserem Labor haben gezeigt, dass die Zugabe von Glyceryltrinitrat und Erythropoietin zu Lösungen zur Erhaltung des Spenderherzens die Wiederherstellung der Herzfunktion nach längerer Kühllagerung und bei der Spende nach dem Bluttod von Herzen signifikant verbessern kann. Dieses Supplementierungsprotokoll wurde im klinischen Einsatz in Transplantationseinheiten in Australien, Belgien und dem Vereinigten Königreich implementiert. Hier skizzieren wir ein Protokoll zum Testen von Supplementierungsstrategien unter Verwendung eines ex vivo isolierten funktionierenden Rattenherz-Perfusionskreislaufs (IWRH). Mit dieser Methode können Supplementierungsstrategien im Zusammenhang mit längerer kalter statischer Lagerung, Spende nach Hirntod und Spende nach Kreislauftod und Spenderherzerhaltung getestet werden. Die Wiederherstellung der kardialen Funktionsfähigkeit, gemessen anhand des Aortenflusses, des Koronarflusses, des Herzzeitvolumens, des Pulsdrucks und der Herzfrequenz, kann verwendet werden, um festzustellen, ob eine bestimmte Konservierungsstrategie die Ischämie-Reperfusionsverletzung des Spenderherzens minimieren kann.
Der Erfolg einer Herztransplantation kann stark von der Konservierungsmethode des Spenderherzens beeinflusst werden. Spenderherzen sind während des gesamten Prozesses der Organentnahme, des Transports und der Transplantation ischämischen Beleidigungen ausgesetzt. Das Ausmaß der ischämischen Schädigung des Spenderorgans kann durch die Auswahl einer geeigneten Strategie zur Erhaltung des Spenderherzens gemildert werden. Die kalte statische Lagerung (CSS) ist nach wie vor die praktikabelste und gebräuchlichste Methode zur Konservierung des Spenderherzens. CSS ist jedoch nicht unbedingt die beste Option für alle Herzspendewege. Zum Beispiel werden Herzen, die über den Spendenweg nach dem Kreislauftod (DCD) gewonnen wurden, mit Hilfe der normothermen maschinellen Perfusion erhalten und auf Lebensfähigkeit untersucht, während Herzen, die über den Spendenweg nach dem Hirntod (DBD) gewonnen wurden, mit CSS oder hypothermischer maschineller Perfusion konserviert werden können. Eine weitere wichtige Determinante für die verwendete Konservierungsstrategie ist die Menge an warmer Ischämie (bei DCD) oder kalter Ischämie (bei DBD), der das Herz während der Organbeschaffung und des Transports ausgesetzt ist.
Viele Zentren verwenden eine zusätzliche pharmakologische Supplementierung der Herzkonservierungslösung, um die ischämische Toleranz zu erhöhen und die Herzfunktion nach der Transplantation zu verbessern. Nagetierstudien aus unserem Labor zeigten, dass die Supplementierung von Kardioplegie mit Erythropoietin und Glyceryltrinitrat in der Lage war, die kardiale Funktionserholung nach längerer Kältelagerung des Spenderherzens signifikant zu verbessern 1,2. Diese Studien wurden dann zu Schweinestudien zur Erhaltung des Spenderherzens weiterentwickelt und lieferten die präklinische Grundlage, die zum Einbau von Erythropoietin und Glyceryltrinitrat in die Kardioplegielösung von Herzen führte, die über einen DCD-Weg unter Verwendung der normothermen maschinellen Perfusion gewonnen wurde 3,4,5. Derzeit wird die Supplementierung mit Erythropoietin und Glyceryltrinitrat auch in australischen Transplantationseinheiten für klinische DBD-Herzentnahmen mit CSS eingesetzt. Das übergeordnete Ziel des unten beschriebenen Perfusionsprotokolls für isoliertes funktionierendes Rattenherz (IWRH) besteht darin, Strategien zur Erhaltung des Spenderherzens in einer Laborumgebung zu testen und ihre Wirksamkeit bei der Erhaltung der Herzfunktion des Spenderherzens nach der Reperfusion zu testen. Das beschriebene isolierte funktionierende Rattenherzprotokoll wird seit über zwei Jahrzehnten in unserem Labor verwendet und hat sich beim Screening auf potenzielle Nahrungsergänzungsmittel und/oder Strategien, die den Erhalt des Spenderherzens verbessern können, als äußerst nützlich erwiesen 2,7,8,9.
Angesichts der Empfindlichkeit der Ausgangsfunktion des Herzens muss darauf geachtet werden, dass das Perfusionspräparat sauber und mit kompatiblen Komponenten ausgestattet bleibt. So muss zum Beispiel der richtige PVC-Schlauch verwendet werden. Einige Schlauchmaterialien, wie z. B. Silikon, können zu einer geringeren Aortenströmung und Kontraktilität beitragen, was auf den Sauerstoffverlust über die Schläuche zurückzuführen sein kann. Es gibt zwar isolierte funktionierende Ratte…
The authors have nothing to disclose.
Die hier beschriebenen Studien wurden durch Zuschüsse finanziert, die P.S. Macdonald vom National Health and Medical Research Council Australia, der St. Vincent’s Clinic Foundation und dem NSW Health Cardiovascular Research Capacity Senior Investigator Grant gewährt wurden.
1.5 mL colorless Eppendorff tube, 1000 per box | Bio Strategy Pty Ltd | 0030.125.150 | |
15 mL cent/tubes (S) Sleeve/25 PP ctn/500 | Sigma-aldrich Pty Ltd | CLS430791-500ea | |
BP Transducer/Cable kit | ADInstruments | MLT1199 | Data Acquisition |
Bridge Amp | ADInstruments | FE221 | Data Acquisition |
Carbogen 555G2 | BOC | BOC002 | |
Checktemp1 thermometer | Hanna Instruments | HI98509 | Rig Construction |
Clamp Pinch 1/4-7/16 PK 12 | Thomas Scientific | 2848Y40 | Rig Construction |
Clamp W/Extension Stem Med. | Thomas Scientific | 8847T08 | Rig Construction |
Clamp W/Extension Stem Sm. | Thomas Scientific | 8847T02 | Rig Construction |
Clips, Vessel, 60 g Pressure | Coherent Scientific | 14121 | Surgical Equipment |
Closed Connector | Thomas Scientific | 8847E25 | Rig Construction |
Covidien Sofsilk 2-0 black precut 45 cm box of 24 | Specialist Medical Supplies | S195 | Surgical consumables |
Custom Made 250 mL Jacketed Degasser | Custom Blown Glassware Pty Ltd | N/A | Rig Construction |
Custom Made 750 mL Reservoir | Custom Blown Glassware Pty Ltd | N/A | Rig Construction |
D-(+)-Glucose Anhydrous SigmaUltra | Sigma-aldrich Pty Ltd | G7528-1Kg | To make Krebs Buffer |
Dual Channel Console | ADInstruments | TS402 | Data Acquisition |
Erlenmyer flasks 2 L | |||
Filter Microfibre type GF/C glass fibre 47 mm, 100 | Bio-strategy Pty Ltd | 1822047 | |
Forceps, 15 cm, 0.3 mm, CRVD | Coherent Scientific | 14114 | Surgical Equipment |
Four Prong Clamps with 9 mm x 115 mm long arm for holding 2-70 mm diam objects. Vinyl coated | Met-App Australia Pty Ltd | 1352 | Rig Construction |
Heater Circulator. Digital Solid State Control. (1020 Watts/240 Volts) | Thermoline Scientific | TU3 | Rig Construction |
Heparin 5000 U/5 mL box 50 Pfizer 02112115 | Clffird Hallam Healthcare Pty Ltd | 1258693 | Drugs |
Ilium Xylazil 20 Inj 50 mL | Cenvet Australia Pty Ltd | X5010 | Anaesthetic |
Johns Hopkins Bulldog Clamp | Coherent Scientific | CS-WPI-14117 | |
Ketamine 100 mg/50 mL | Provet (NSW) Pty Ltd | KETAI1 | Anaesthetic |
Magnesium Sulphate heptahydrate AR 500 g Chemsupply | Bio Strategy Pty Ltd | MA048-500g | To make Krebs Buffer |
Male/Female Hinged Adapter | Thomas Scientific | 8847V08 | Rig Construction |
Masterflex L/S Easy-Load Head for Precision Tubing, PPS, CRS Rotor | John Morris | 1015164 | Rig Construction |
Metzenbaum scissors, 11.5 cm curved | Coherent Scientific | WPI-501748 | Surgical Equipment |
Metzenbaum scissors, 14.5 cm straight | Coherent Scientific | WPI-501252 | Surgical Equipment |
Mounting Hardware F/2-HEADS SS | John Morris | 1014414 | Mounting screws for pump heads |
Open-sided connector | Thomas Scientific | 8847E05 | Rig Construction |
Paraformadehyde | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Sample processing |
Potassium Chloride (AnalaR NORMAPUR) 500 g | VWR Chemicals | 26764.26 | To make Krebs Buffer |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich Pty Ltd | P5379-500g | To make Krebs Buffer |
Powerlab 2/26, 2 channel recorder + Labchart software | ADInstruments | ML826 | Computer Hardware and Software |
Precision XN Inline Flowsensor, 3.2 mm (1/8")ID ME4PXN-KR37 XF | ADInstruments | ME4PXN | Rig Construction |
Scalpel with handle disposable #11 pkt/10 | BSN Medical (Aust) Pty Ltd | 73252-36 | |
Silicone Gasket for Swinnex 47 mm 5/PK | Merck Millipore | SX0004701 | Rig Construction |
Silicone O-Ring 5-329 10/PK | Merck Millipore | XX1104707 | Rig Construction |
Single Buret Clamp | Thomas Scientific | 8847T32 | Rig Construction |
Slip-on inlet Filter pore size 10 µm (bubbler) | Sigma-aldrich | 59277 | Rig Construction |
Sm. 360 Rotation Connector | Thomas Scientific | 8847E35 | Rig Construction |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich Pty Ltd | S6297 – 250g | To make Krebs Buffer |
Swinnex Filter Holder, 47 mm | Merck Millipore | SX0004700 | Rig Construction |
syringes 1 mL box/100 | Becton Dickinson Pty Ltd | 302100 | |
Three Prong Clamps with 9 mm diameter x 125 mm long arm and twin screw for holding 5-80 mm | Met-App Australia Pty Ltd | 1356 | Rig Construction |
Tubing Flowmeter Module TS410 | ADInstruments | TS410 | Data Acquisition |
Tubing PVC 6.35 mm ID x 9.52 mm OD 50ft Roll 15.24m, clear , DEHP phthalate free, food grade meets REAC | Thermo Fisher | NAL 8701-0600 | Rig Construction |
Tubing PVC 7.94mm ID x 11.1mm OD 50ft Roll 15.24 m, clear , DEHP phthalate free, food grade meets REAC | Thermo Fisher | NAL 8701-0900 | Rig Construction |
Tubing PVC 9.52 mm ID x 12.7 mm OD 100ft Roll | Thermo Fisher | NAL 8701-4120 | Rig Construction |
Vannas scissors, 8.5 cm, Straight, 7 mm Blades | Coherent Scientific | WPI-500-086 | Surgical Equipment |
Water Bath 30 Litre with Suspended Tray | Thermoline Scientific | TLWB-30 | Rig Construction |