Das vorliegende Protokoll beschreibt pH-Messungen in aus menschlichem Gewebe gewonnenen Magenorganoiden unter Verwendung von Mikroelektroden zur raumzeitlichen Charakterisierung der intraluminalen Physiologie.
Die Optimierung und detaillierte Charakterisierung von gastrointestinalen Organoidmodellen erfordert fortschrittliche Methoden zur Analyse ihrer luminalen Umgebungen. In dieser Arbeit wird eine hochgradig reproduzierbare Methode zur präzisen Messung des pH-Werts in der Lumina von menschlichen 3D-Magenorganoiden mittels mikromanipulatorgesteuerter Mikroelektroden vorgestellt. Die pH-Mikroelektroden sind im Handel erhältlich und bestehen aus abgeschrägten Glasspitzen mit einem Durchmesser von 25 μm. Für Messungen wird die pH-Mikroelektrode in das Lumen eines Organoids (>200 μm) vorgeschoben, das in Matrigel suspendiert ist, während eine Referenzelektrode in der Kulturplatte im umgebenden Medium eingetaucht ist.
Durch die Verwendung solcher Mikroelektroden zur Profilierung von Organoiden, die aus dem menschlichen Magenkörper stammen, zeigen wir, dass der luminale pH-Wert in jeder Kulturvertiefung bei ~7,7 ± 0,037 relativ konstant ist und dass kontinuierliche Messungen von mindestens 15 Minuten durchgeführt werden können. Bei einigen größeren Organoiden zeigten die Messungen einen pH-Gradienten zwischen der Epitheloberfläche und dem Lumen, was darauf hindeutet, dass pH-Messungen in Organoiden mit hoher räumlicher Auflösung durchgeführt werden können. In einer früheren Studie wurden Mikroelektroden erfolgreich zur Messung der luminalen Sauerstoffkonzentration in Organoiden eingesetzt, was die Vielseitigkeit dieser Methode für Organoidanalysen demonstriert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll ein wichtiges Werkzeug für die funktionelle Charakterisierung des komplexen luminalen Raums innerhalb von 3D-Organoiden darstellt.
Organoide – multizelluläre Miniaturstrukturen, die aus Stammzellen gewonnen werden – haben unsere Fähigkeit, die menschliche Physiologie zu untersuchen, revolutioniert und beginnen, Tiermodelle zu ersetzen, selbst in regulatorischen Umgebungen1. Seit der Erstbeschreibung von Darmorganoiden durch Sato et al. im Jahr 2009 ist die Organoid-Technologie immens populär geworden2. Eine große Anzahl von Studien hat die zelluläre Zusammensetzung und Funktion von Organoidmodellen sehr detailliert charakterisiert 3,4,5,6. Der luminale Raum dieser multizellulären 3D-Strukturen ist jedoch weitgehend undefiniert 7,8. Das Lumen ist der zentrale Hohlraum von Organoiden, die aus Schleimhautgeweben gewonnen werden und von den apikalen Anteilen polarisierter Epithelzellen umgeben sind. Da zelluläre Sekretion und Absorption überwiegend an der apikalen Epitheloberfläche stattfinden, wird die luminale Mikroumgebung von Organoiden durch diese wichtigen physiologischen Prozesse gesteuert. Die derzeit verwendeten Organoidmodelle zeigen Variationen in den Signalmustern der Zellen, der Gesamtstammzelle, den Gradienten der Metabolitenkonzentration und den Umweltbedingungen9. Das Verständnis der organoiden luminalen Physiologie ist daher für die genaue Modellierung der Organfunktion und -pathologie notwendig. Leider behindert die relative Unzugänglichkeit des Lumens die funktionelle Analyse der luminalen Physiologie in 3D-Organoidenerheblich 10.
Die Fähigkeit, pH-Profile zu untersuchen, ist besonders wichtig im Magen, der dafür berüchtigt ist, den steilsten Protonengradienten im Körper zu haben, der von etwa 1-3 im Lumen bis nahezu neutral am Epithelreicht 11,12,13. Es gibt nach wie vor eine erhebliche Lücke in unserem Verständnis der mikroskaligen Aufrechterhaltung des pH-Gradienten des Magens und der Bedeutung von Organoidmodellen bei der Rekapitulation dieses dynamischen Milieus über die Magenschleimschicht. Traditionelle Ansätze zur Analyse des pH-Werts von Organoiden beinhalten die Verwendung von pH-empfindlichen Farbstoffen, bei denen es sich um fluoreszierende oder kolorimetrische Indikatoren handeln kann. McCracken et al. verwendeten eine luminale Injektion von SNARF-5F – einem ratiometrischen pH-Indikator – in Organoide, um einen Abfall des luminalen pH-Werts als Reaktion auf die Histaminbehandlung zu analysieren. Solche Farbstoffe können in die Nährmedien eingearbeitet werden, was eine nicht-invasive Überwachung des pH-Werts in Echtzeit ermöglicht. pH-empfindliche Farbstoffe erfordern nicht nur komplexe Kalibrierschritte, die zu einer schlechten Zuverlässigkeit und Genauigkeit bei Messungen beitragen, sondern solche Farbstoffe neigen auch dazu, innerhalb spezifischer Nachweisbereiche zu arbeiten, die möglicherweise nicht repräsentativ für den gesamten pH-Bereich innerhalb der interessierenden Mikroumgebung sind14,15. Es könnte jedoch als sinnvoll angesehen werden, Indikatorfarbstoffe für Bestätigungsversuche zu verwenden. Optische Nanosensoren, die fluoreszierende optodenbasierte pH-Sensoransätze verwenden, wurden ebenfalls entwickelt. Solche Sensortechniken erfordern jedoch mikroskopische Bildgebung und sind auch anfällig für Photobleichung, Phototoxizität sowie Bildgebungsverzerrungen16,17. Darüber hinaus haben Brooks et al. 3D-gedruckte Multiwell-Platten mit Mikroelektroden entwickelt, auf denen Organoide plattiert werden können18. Dieser Ansatz erlaubt jedoch keine Messungen direkt im Inneren des Organoid-Lumens.
Elektrodenbasierte pH-Messungen können im Vergleich zu anderen Methoden eine verbesserte Genauigkeit erreichen und eine Echtzeit-pH-Überwachung ermöglichen. Darüber hinaus ermöglichen pH-Elektroden, die an Mikromanipulatoren montiert sind, eine überlegene räumliche Auflösung von pH-Messungen, da die genaue Position der Elektrodenspitze fein gesteuert werden kann. Dies ermöglicht eine höchstmögliche Flexibilität und Reproduzierbarkeit bei der Analyse von Organoidmodellen. Bei den hier verwendeten Elektroden handelt es sich um miniaturisierte pH-Mikroelektroden, die auf der Grundlage der Diffusion von Protonen durch selektives pH-Glas arbeiten, das einen dünnen Platindraht umgibt. Die Mikroelektrode wird mit einer externen Ag-AgCl-Referenzelektrode verbunden und anschließend mit einem hochohmigen Millivolt-Messgerät verbunden. Das elektrische Potential zwischen den beiden Elektrodenspitzen, wenn es in dieselbe Lösung getaucht wird, spiegelt den pH-Wert der Lösung19 wider. Solche Microprofiling-Systeme wurden bei der metabolischen Analyse von Biofilmen20,21, planktonischen Algen22, menschlichen Sputumproben23 und sogar in mesenchymalen Stammzell-Sphäroiden24 eingesetzt. Sowohl unser Labor als auch Murphy et al. haben zuvor mikromanipulatorgesteuerte O2 -Mikroelektroden verwendet, um die Sauerstoffkonzentrationen in den luminalen Räumen von Organoiden zu bewerten. Murphy et al. kombinierten diese Methode mit mathematischer Modellierung, um einen Sauerstoffgradienten innerhalb ihrer Sphäroide aufzudecken. Unsere Gruppe war in der Lage, einen reduzierten luminalen Sauerstoffgehalt in gewebeabgeleiteten Magenorganoiden im Vergleich zur umgebenden extrazellulären Matrixzu finden 25.
Hier stellen wir eine detaillierte Methode für die manuelle Mikroelektrodenprofilierung des luminalen pH-Werts in Organoiden des sphärischen Gastrointestinaltrakts vor, die ein verbessertes physiologisches Verständnis ihrer komplexen luminalen Mikroumgebung ermöglicht. Wir gehen davon aus, dass diese Technik der Erforschung der Physiologie von Organoiden durch hochauflösende Echtzeitmessungen des pH-Werts auf der Mikroskala eine neue Dimension hinzufügen wird. Darüber hinaus könnte das folgende Protokoll leicht für die Analyse von O2, N2O, H2, NO, H2S, Redox und Temperatur in verschiedenen Arten von Organoidmodellen angepasst werden. Physiologisches Profiling dient als wertvolles Instrument zur Optimierung der Bedingungen von Organoidkulturen, um In-vivo-Umgebungen besser nachzuahmen und dadurch die Relevanz und den Nutzen von Organoidmodellen in der biomedizinischen Forschung zu erhöhen.
Der eingeschränkte Zugang zum luminalen Raum von Organoiden hat unser Verständnis der physiologischen Dynamik dieser Mikroumgebung stark eingeschränkt. Ein zuverlässiges Werkzeug für funktionelle Analysen der luminalen Physiologie wird unsere Fähigkeit erweitern, Organoide als In-vitro-Modelle für die Physiologie, Pharmakologie und Krankheitsforschung zu nutzen. Organoide sind hochgradig abstimmbare, physiologisch relevante Modelle mit dem zusätzlichen Potenzial, die genetische Variabilität innerhalb de…
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren danken Dr. Ellen Lauchnor, Dr. Phil Stewart und Bengisu Kilic für ihre bisherige Arbeit und Unterstützung bei den O2 -Mikrosensoren; Andy Sebrell für die Ausbildung in Organoidkultur und Mikromanipulation; Lexi Burcham für die Unterstützung bei der Organoidkultur, der Medienvorbereitung, der Datenaufzeichnung und der Organisation; und Dr. Susy Kohout für allgemeine Ratschläge in Elektrophysiologie. Wir danken Dr. Heidi Smith für ihre Unterstützung bei der Bildgebung und danken der Center for Biofilm Engineering Bioimaging Facility an der Montana State University, die durch Mittel des National Science Foundation MRI Program (2018562), des M.J. Murdock Charitable Trust (202016116), des US-Verteidigungsministeriums (77369LSRIP & W911NF1910288) und der Montana Nanotechnology Facility (ein NNCI-Mitglied, unterstützt durch den NSF Grant ECCS-2025391) unterstützt wird.
Besonderer Dank gilt dem gesamten Unisense-Team, das diese Arbeit möglich gemacht hat, insbesondere Dr. Andrew Cerskus, Dr. Laura Woods, Dr. Lars Larsen, Dr. Tage Dalsgaard, Dr. Line Daugaard, Dr. Karen Maegaard und Mette Gammelgaard. Die Finanzierung unserer Studie erfolgte durch die National Institutes of Health Grants R01 GM13140801 (D.B., R.B.) und UL1 TR002319 (K.N.L.) sowie einen Research Expansion Award des Montana State University Office for Research and Economic Development (D.B.). Abbildung 1A wurde mit BioRender erstellt.
3 M KCl | Unisense | ||
5 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, Sterile | CellTreat | 229091B | |
10 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, Sterile | CellTreat | 229092B | |
15 mL Centrifuge Tube – Foam Rack, Sterile | CellTreat | 229412 | |
24 Well Tissue Culture Plate, Sterile | CellTreat | 229124 | |
25 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, Sterile | CellTreat | 229093B | |
35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
50 mL Centrifuge Tube – Foam Rack, Sterile | CellTreat | 229422 | |
70% Ethanol | BP82031GAL | BP82031GAL | |
70 μm Cell Strainer, Individually Wrapped, Sterile | CellTreat | 229483 | |
1,000 µL Extended Length Low Retention Pipette Tips, Racked, Sterile | CellTreat | 229037 | |
Amphotericin B (Fungizone) Solution | HyClone Laboratories, Inc | SV30078.01 | |
Biosafety Cabinet | Nuaire | NU-425-600 | Class II Type A/B3 |
Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP1605-100 | |
Cell recovery solution | Corning | 354253 | Cell dissociation solution |
DMEM/F-12 (Advanced DMEM) | Gibco | 12-491-015 | |
Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM) | Fisher Scientific | 15017CV | |
Fetal Bovine Serum | HyClone Laboratories, Inc | SH30088 | |
G418 Sulfate | Corning | 30-234-CR | |
Gentamycin sulfate | IBI Scientific | IB02030 | |
HEPES, Free Acid | Cytiva | SH30237.01 | |
HP Pavillion 2-in-1 14" Laptop Intel Core i3 | HP | M03840-001 | |
Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144C-212 | |
Incubator | Fisher Scientific | 11676604 | |
iPhone 12 camera | Apple | ||
L-glutamine | Cytiva | SH3003401 | |
Large Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | Fisher Scientific | 34133 | |
M 205 FA Stereomicroscope | Leica | ||
Matrigel Membrane Matrix 354234 | Corning | CB-40234 | |
MC-1 UniMotor Controller | Unisense | ||
Methyl red | |||
MM33 Micromanipulator | Marzhauser Wetzlar | 61-42-113-0000 | Right handed |
MS-15 Motorized Stage | Unisense | ||
Nanoject-II | Drummond | 3-000-204 | nanoliter autoinjector |
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15-140-148 | |
pH Microelectrodes | Unisense | 50-109158, 25-203452, 25-205272, 25-111626, 25-109160 | SensorTrace software is not compatible with Apple computers |
Reference Electrode | Unisense | REF-RM-001652 | SensorTrace software is not compatible with Apple computers |
SB 431542 | Tocris Bioscience | 16-141-0 | |
Smartphone Camera Adapter | Gosky | ||
Specifications Laboratory Stand LS | Unisense | LS-009238 | |
Trypsin-EDTA 0.025%, phenol red | Gibco | 25-200-056 | |
UniAmp | Unisense | 11632 | |
United Biosystems Inc MINI CELL SCRAPERS 200/PK | Fisher | MCS-200 | |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris Bioscience | 12-541-0 | |
µSensor Calibration Kit | Unisense/ Mettler Toledo | 51-305-070, 51-302-069 | pH 4.01 and 9.21, 20 mL packets |