Summary

Profilierung des luminalen pH-Werts in dreidimensionalen gastrointestinalen Organoiden mit Hilfe von Mikroelektroden

Published: July 05, 2024
doi:

Summary

Das vorliegende Protokoll beschreibt pH-Messungen in aus menschlichem Gewebe gewonnenen Magenorganoiden unter Verwendung von Mikroelektroden zur raumzeitlichen Charakterisierung der intraluminalen Physiologie.

Abstract

Die Optimierung und detaillierte Charakterisierung von gastrointestinalen Organoidmodellen erfordert fortschrittliche Methoden zur Analyse ihrer luminalen Umgebungen. In dieser Arbeit wird eine hochgradig reproduzierbare Methode zur präzisen Messung des pH-Werts in der Lumina von menschlichen 3D-Magenorganoiden mittels mikromanipulatorgesteuerter Mikroelektroden vorgestellt. Die pH-Mikroelektroden sind im Handel erhältlich und bestehen aus abgeschrägten Glasspitzen mit einem Durchmesser von 25 μm. Für Messungen wird die pH-Mikroelektrode in das Lumen eines Organoids (>200 μm) vorgeschoben, das in Matrigel suspendiert ist, während eine Referenzelektrode in der Kulturplatte im umgebenden Medium eingetaucht ist.

Durch die Verwendung solcher Mikroelektroden zur Profilierung von Organoiden, die aus dem menschlichen Magenkörper stammen, zeigen wir, dass der luminale pH-Wert in jeder Kulturvertiefung bei ~7,7 ± 0,037 relativ konstant ist und dass kontinuierliche Messungen von mindestens 15 Minuten durchgeführt werden können. Bei einigen größeren Organoiden zeigten die Messungen einen pH-Gradienten zwischen der Epitheloberfläche und dem Lumen, was darauf hindeutet, dass pH-Messungen in Organoiden mit hoher räumlicher Auflösung durchgeführt werden können. In einer früheren Studie wurden Mikroelektroden erfolgreich zur Messung der luminalen Sauerstoffkonzentration in Organoiden eingesetzt, was die Vielseitigkeit dieser Methode für Organoidanalysen demonstriert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll ein wichtiges Werkzeug für die funktionelle Charakterisierung des komplexen luminalen Raums innerhalb von 3D-Organoiden darstellt.

Introduction

Organoide – multizelluläre Miniaturstrukturen, die aus Stammzellen gewonnen werden – haben unsere Fähigkeit, die menschliche Physiologie zu untersuchen, revolutioniert und beginnen, Tiermodelle zu ersetzen, selbst in regulatorischen Umgebungen1. Seit der Erstbeschreibung von Darmorganoiden durch Sato et al. im Jahr 2009 ist die Organoid-Technologie immens populär geworden2. Eine große Anzahl von Studien hat die zelluläre Zusammensetzung und Funktion von Organoidmodellen sehr detailliert charakterisiert 3,4,5,6. Der luminale Raum dieser multizellulären 3D-Strukturen ist jedoch weitgehend undefiniert 7,8. Das Lumen ist der zentrale Hohlraum von Organoiden, die aus Schleimhautgeweben gewonnen werden und von den apikalen Anteilen polarisierter Epithelzellen umgeben sind. Da zelluläre Sekretion und Absorption überwiegend an der apikalen Epitheloberfläche stattfinden, wird die luminale Mikroumgebung von Organoiden durch diese wichtigen physiologischen Prozesse gesteuert. Die derzeit verwendeten Organoidmodelle zeigen Variationen in den Signalmustern der Zellen, der Gesamtstammzelle, den Gradienten der Metabolitenkonzentration und den Umweltbedingungen9. Das Verständnis der organoiden luminalen Physiologie ist daher für die genaue Modellierung der Organfunktion und -pathologie notwendig. Leider behindert die relative Unzugänglichkeit des Lumens die funktionelle Analyse der luminalen Physiologie in 3D-Organoidenerheblich 10.

Die Fähigkeit, pH-Profile zu untersuchen, ist besonders wichtig im Magen, der dafür berüchtigt ist, den steilsten Protonengradienten im Körper zu haben, der von etwa 1-3 im Lumen bis nahezu neutral am Epithelreicht 11,12,13. Es gibt nach wie vor eine erhebliche Lücke in unserem Verständnis der mikroskaligen Aufrechterhaltung des pH-Gradienten des Magens und der Bedeutung von Organoidmodellen bei der Rekapitulation dieses dynamischen Milieus über die Magenschleimschicht. Traditionelle Ansätze zur Analyse des pH-Werts von Organoiden beinhalten die Verwendung von pH-empfindlichen Farbstoffen, bei denen es sich um fluoreszierende oder kolorimetrische Indikatoren handeln kann. McCracken et al. verwendeten eine luminale Injektion von SNARF-5F – einem ratiometrischen pH-Indikator – in Organoide, um einen Abfall des luminalen pH-Werts als Reaktion auf die Histaminbehandlung zu analysieren. Solche Farbstoffe können in die Nährmedien eingearbeitet werden, was eine nicht-invasive Überwachung des pH-Werts in Echtzeit ermöglicht. pH-empfindliche Farbstoffe erfordern nicht nur komplexe Kalibrierschritte, die zu einer schlechten Zuverlässigkeit und Genauigkeit bei Messungen beitragen, sondern solche Farbstoffe neigen auch dazu, innerhalb spezifischer Nachweisbereiche zu arbeiten, die möglicherweise nicht repräsentativ für den gesamten pH-Bereich innerhalb der interessierenden Mikroumgebung sind14,15. Es könnte jedoch als sinnvoll angesehen werden, Indikatorfarbstoffe für Bestätigungsversuche zu verwenden. Optische Nanosensoren, die fluoreszierende optodenbasierte pH-Sensoransätze verwenden, wurden ebenfalls entwickelt. Solche Sensortechniken erfordern jedoch mikroskopische Bildgebung und sind auch anfällig für Photobleichung, Phototoxizität sowie Bildgebungsverzerrungen16,17. Darüber hinaus haben Brooks et al. 3D-gedruckte Multiwell-Platten mit Mikroelektroden entwickelt, auf denen Organoide plattiert werden können18. Dieser Ansatz erlaubt jedoch keine Messungen direkt im Inneren des Organoid-Lumens.

Elektrodenbasierte pH-Messungen können im Vergleich zu anderen Methoden eine verbesserte Genauigkeit erreichen und eine Echtzeit-pH-Überwachung ermöglichen. Darüber hinaus ermöglichen pH-Elektroden, die an Mikromanipulatoren montiert sind, eine überlegene räumliche Auflösung von pH-Messungen, da die genaue Position der Elektrodenspitze fein gesteuert werden kann. Dies ermöglicht eine höchstmögliche Flexibilität und Reproduzierbarkeit bei der Analyse von Organoidmodellen. Bei den hier verwendeten Elektroden handelt es sich um miniaturisierte pH-Mikroelektroden, die auf der Grundlage der Diffusion von Protonen durch selektives pH-Glas arbeiten, das einen dünnen Platindraht umgibt. Die Mikroelektrode wird mit einer externen Ag-AgCl-Referenzelektrode verbunden und anschließend mit einem hochohmigen Millivolt-Messgerät verbunden. Das elektrische Potential zwischen den beiden Elektrodenspitzen, wenn es in dieselbe Lösung getaucht wird, spiegelt den pH-Wert der Lösung19 wider. Solche Microprofiling-Systeme wurden bei der metabolischen Analyse von Biofilmen20,21, planktonischen Algen22, menschlichen Sputumproben23 und sogar in mesenchymalen Stammzell-Sphäroiden24 eingesetzt. Sowohl unser Labor als auch Murphy et al. haben zuvor mikromanipulatorgesteuerte O2 -Mikroelektroden verwendet, um die Sauerstoffkonzentrationen in den luminalen Räumen von Organoiden zu bewerten. Murphy et al. kombinierten diese Methode mit mathematischer Modellierung, um einen Sauerstoffgradienten innerhalb ihrer Sphäroide aufzudecken. Unsere Gruppe war in der Lage, einen reduzierten luminalen Sauerstoffgehalt in gewebeabgeleiteten Magenorganoiden im Vergleich zur umgebenden extrazellulären Matrixzu finden 25.

Hier stellen wir eine detaillierte Methode für die manuelle Mikroelektrodenprofilierung des luminalen pH-Werts in Organoiden des sphärischen Gastrointestinaltrakts vor, die ein verbessertes physiologisches Verständnis ihrer komplexen luminalen Mikroumgebung ermöglicht. Wir gehen davon aus, dass diese Technik der Erforschung der Physiologie von Organoiden durch hochauflösende Echtzeitmessungen des pH-Werts auf der Mikroskala eine neue Dimension hinzufügen wird. Darüber hinaus könnte das folgende Protokoll leicht für die Analyse von O2, N2O, H2, NO, H2S, Redox und Temperatur in verschiedenen Arten von Organoidmodellen angepasst werden. Physiologisches Profiling dient als wertvolles Instrument zur Optimierung der Bedingungen von Organoidkulturen, um In-vivo-Umgebungen besser nachzuahmen und dadurch die Relevanz und den Nutzen von Organoidmodellen in der biomedizinischen Forschung zu erhöhen.

Protocol

Dieses Protokoll erfordert 3D-Organoide mit einem Durchmesser von mindestens 200 μm, die ein ausgeprägtes Lumen haben und in eine künstliche extrazelluläre Matrix (ECM, z. B. Matrigel) eingebettet sind. Humanes Magengewebe für die Organoid-Gewinnung wurde mit Genehmigung des Institutional Review Board der Montana State University und mit Einverständniserklärung von Patienten gewonnen, die sich bei Bozeman Health einer oberen Endoskopie unterziehen (Protokoll # 2023-48-FCR, zu D.B.) oder als befreite Proben des gan…

Representative Results

Die Sekretion von Säure ist eine entscheidende Funktion des menschlichen Magens. Inwieweit die Säuresekretion in Organoiden modelliert werden kann, ist jedoch noch umstritten 6,32,33,34. Aus diesem Grund haben wir das oben beschriebene Protokoll entwickelt, um die Säureproduktion in Magenorganoiden genau zu messen. Insbesondere verwendeten wir nicht stimulierte Organoide aus adulten Stammzel…

Discussion

Der eingeschränkte Zugang zum luminalen Raum von Organoiden hat unser Verständnis der physiologischen Dynamik dieser Mikroumgebung stark eingeschränkt. Ein zuverlässiges Werkzeug für funktionelle Analysen der luminalen Physiologie wird unsere Fähigkeit erweitern, Organoide als In-vitro-Modelle für die Physiologie, Pharmakologie und Krankheitsforschung zu nutzen. Organoide sind hochgradig abstimmbare, physiologisch relevante Modelle mit dem zusätzlichen Potenzial, die genetische Variabilität innerhalb de…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken Dr. Ellen Lauchnor, Dr. Phil Stewart und Bengisu Kilic für ihre bisherige Arbeit und Unterstützung bei den O2 -Mikrosensoren; Andy Sebrell für die Ausbildung in Organoidkultur und Mikromanipulation; Lexi Burcham für die Unterstützung bei der Organoidkultur, der Medienvorbereitung, der Datenaufzeichnung und der Organisation; und Dr. Susy Kohout für allgemeine Ratschläge in Elektrophysiologie. Wir danken Dr. Heidi Smith für ihre Unterstützung bei der Bildgebung und danken der Center for Biofilm Engineering Bioimaging Facility an der Montana State University, die durch Mittel des National Science Foundation MRI Program (2018562), des M.J. Murdock Charitable Trust (202016116), des US-Verteidigungsministeriums (77369LSRIP & W911NF1910288) und der Montana Nanotechnology Facility (ein NNCI-Mitglied, unterstützt durch den NSF Grant ECCS-2025391) unterstützt wird.

Besonderer Dank gilt dem gesamten Unisense-Team, das diese Arbeit möglich gemacht hat, insbesondere Dr. Andrew Cerskus, Dr. Laura Woods, Dr. Lars Larsen, Dr. Tage Dalsgaard, Dr. Line Daugaard, Dr. Karen Maegaard und Mette Gammelgaard. Die Finanzierung unserer Studie erfolgte durch die National Institutes of Health Grants R01 GM13140801 (D.B., R.B.) und UL1 TR002319 (K.N.L.) sowie einen Research Expansion Award des Montana State University Office for Research and Economic Development (D.B.). Abbildung 1A wurde mit BioRender erstellt.

Materials

3 M KCl Unisense
5 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, Sterile CellTreat 229091B
10 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, Sterile CellTreat 229092B
15 mL Centrifuge Tube – Foam Rack, Sterile CellTreat 229412
24 Well Tissue Culture Plate, Sterile CellTreat 229124
25 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, Sterile CellTreat 229093B
35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated MatTek P35G-1.5-20-C
50 mL Centrifuge Tube – Foam Rack, Sterile CellTreat 229422
70% Ethanol BP82031GAL BP82031GAL
70 μm Cell Strainer, Individually Wrapped, Sterile CellTreat 229483 
1,000 µL Extended Length Low Retention Pipette Tips, Racked, Sterile CellTreat 229037
Amphotericin B (Fungizone) Solution HyClone Laboratories, Inc SV30078.01
Biosafety Cabinet Nuaire  NU-425-600 Class II Type A/B3
Bovine Serum Albumin Fisher Bioreagents BP1605-100
Cell recovery solution Corning 354253 Cell dissociation solution
DMEM/F-12 (Advanced DMEM) Gibco 12-491-015
Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM) Fisher Scientific 15017CV
Fetal Bovine Serum HyClone Laboratories, Inc SH30088
G418 Sulfate Corning 30-234-CR
Gentamycin sulfate IBI Scientific IB02030
HEPES, Free Acid Cytiva SH30237.01
HP Pavillion 2-in-1 14" Laptop Intel Core i3 HP M03840-001
Hydrochloric acid Fisher Scientific A144C-212
Incubator Fisher Scientific 11676604
iPhone 12 camera Apple
L-glutamine Cytiva SH3003401
Large Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply Fisher Scientific 34133
M 205 FA Stereomicroscope Leica
Matrigel Membrane Matrix 354234 Corning CB-40234
MC-1 UniMotor Controller Unisense
Methyl red
MM33 Micromanipulator Marzhauser Wetzlar 61-42-113-0000 Right handed
MS-15 Motorized Stage Unisense
Nanoject-II Drummond 3-000-204 nanoliter autoinjector
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15-140-148
pH Microelectrodes Unisense 50-109158, 25-203452, 25-205272, 25-111626, 25-109160 SensorTrace software is not compatible with Apple computers
Reference Electrode Unisense REF-RM-001652 SensorTrace software is not compatible with Apple computers
SB 431542 Tocris Bioscience 16-141-0
Smartphone Camera Adapter Gosky
Specifications Laboratory Stand LS Unisense LS-009238
Trypsin-EDTA 0.025%, phenol red Gibco 25-200-056
UniAmp Unisense 11632
United Biosystems Inc MINI CELL SCRAPERS 200/PK Fisher MCS-200
Y-27632 dihydrochloride Tocris Bioscience 12-541-0
µSensor Calibration Kit Unisense/ Mettler Toledo 51-305-070, 51-302-069 pH 4.01 and 9.21, 20 mL packets

Referenzen

  1. Zhang, N., et al. Tissue spatial omics dissects organoid biomimicry. GEN Biotechnology. 2 (5), 372-383 (2023).
  2. Sato, T., et al. Single lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  3. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  4. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3d organoid systems. Trends Mol Med. 23 (5), 393-410 (2017).
  5. Achberger, K., et al. Merging organoid and organ-on-a-chip technology to generate complex multi-layer tissue models in a human retina-on-a-chip platform. Elife. 8, e46188 (2019).
  6. Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
  7. Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nat Cell Biol. 18 (3), 246-254 (2016).
  8. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  9. Davies, J. A., Davies, J. A., Lawrence, M. L. . Organoids and Mini-organs. , 3-40 (2018).
  10. Ambrosini, Y. M., et al. Recapitulation of the accessible interface of biopsy-derived canine intestinal organoids to study epithelial-luminal interactions. PLoS One. 15 (4), e0231423 (2020).
  11. Williams, S. E., Turnberg, L. A. Demonstration of a pH gradient across mucus adherent to rabbit gastric mucosa: Evidence for a ‘mucus-bicarbonate’ barrier. Gut. 22 (2), 94-96 (1981).
  12. Schubert, M. L. Gastric secretion. Curr Opin Gastroenterol. 20 (6), 519-525 (2004).
  13. Celli, J. P., et al. Rheology of gastric mucin exhibits a pH-dependent sol−gel transition. Biomacromolecules. 8 (5), 1580-1586 (2007).
  14. Takeshita, Y., et al. Assessment of pH-dependent errors in spectrophotometric pH measurements of seawater. Marine Chemistry. 223, 103801 (2020).
  15. Mccracken, K. W., et al. Wnt/β-catenin promotes gastric fundus specification in mice and humans. Nature. 541 (7636), 182-187 (2017).
  16. Larsen, M., Borisov, S. M., Grunwald, B., Klimant, I., Glud, R. N. A simple and inexpensive high resolution color ratiometric planar optode imaging approach: Application to oxygen and ph sensing. Limnology and Oceanography: Methods. 9 (9), 348-360 (2011).
  17. Jewell, M. P., Galyean, A. A., Kirk Harris, J., Zemanick, E. T., Cash, K. J. Luminescent nanosensors for ratiometric monitoring of three-dimensional oxygen gradients in laboratory and clinical pseudomonas aeruginosa biofilms. Appl Environ Microbiol. 85 (20), e01116-e01119 (2019).
  18. Brooks, E. L., Hussain, K. K., Kotecha, K., Abdalla, A., Patel, B. A. Three-dimensional-printed electrochemical multiwell plates for monitoring food intolerance from intestinal organoids. ACS Sens. 8 (2), 712-720 (2023).
  19. pH and reference electrode manual. Unisense Available from: https://unisense.com/wp-content/uploads/2023/05/2023.05-pH-and-ref-sensor-manual.pdf (2023)
  20. Villahermosa, D., Corzo, A., Garcia-Robledo, E., Gonzalez, J. M., Papaspyrou, S. Kinetics of indigenous nitrate reducing sulfide oxidizing activity in microaerophilic wastewater biofilms. PLoS One. 11 (2), 0149096 (2016).
  21. Pabst, B., Pitts, B., Lauchnor, E., Stewart, P. S. Gel-entrapped staphylococcus aureus bacteria as models of biofilm infection exhibit growth in dense aggregates, oxygen limitation, antibiotic tolerance, and heterogeneous gene expression. Antimicrob Agents Chemother. 60 (10), 6294-6301 (2016).
  22. Ploug, H., Stolte, W., Epping, E. H. G., Jørgensen, B. B. Diffusive boundary layers, photosynthesis, and respiration of the colony-forming plankton algae, phaeocystis sp. Limnology and Oceanography. 44 (8), 1949-1958 (1999).
  23. Kolpen, M., et al. Nitrous oxide production in sputum from cystic fibrosis patients with chronic pseudomonas aeruginosa lung infection. PLoS One. 9 (1), 84353 (2014).
  24. Murphy, K. C., et al. Measurement of oxygen tension within mesenchymal stem cell spheroids. J R Soc Interface. 14 (127), 20160851 (2017).
  25. Sebrell, T. A., et al. A novel gastric spheroid co-culture model reveals chemokine-dependent recruitment of human dendritic cells to the gastric epithelium. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 8 (1), 157-171 (2019).
  26. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nat Protoc. 8 (12), 2471-2482 (2013).
  27. Takase, Y., Fujishima, K., Takahashi, T. The 3d culturing of organoids from murine intestinal crypts and a single stem cell for organoid research. J Vis Exp. (194), e65219 (2023).
  28. Cherne, M. D., et al. A synthetic hydrogel, vitrogel((r)) organoid-3, improves immune cell-epithelial interactions in a tissue chip co-culture model of human gastric organoids and dendritic cells. Front Pharmacol. 12, 707891 (2021).
  29. Sebrell, T. A., et al. Live imaging analysis of human gastric epithelial spheroids reveals spontaneous rupture, rotation and fusion events. Cell Tissue Res. 371 (2), 293-307 (2018).
  30. Sensortrace suite user manual. 3.3. Unisense Available from: https://unisense.com/wp-content/uploads/2021/10/SensorTrace-Suite-Manual.pdf (2023)
  31. Microprofiling system user manual. Unisense Available from: https://unisense.com/wp-content/uploads/2021/09/2023.11-MicroProfiling-System-2.pdf (2023)
  32. Wolffling, S., et al. Egf and bmps govern differentiation and patterning in human gastric glands. Gastroenterology. 161 (2), 623-636 (2021).
  33. Boccellato, F., et al. Polarised epithelial monolayers of the gastric mucosa reveal insights into mucosal homeostasis and defence against infection. Gut. 68 (3), 400-413 (2019).
  34. Mccracken, K. W., et al. Modelling human development and disease in pluripotent stem-cell-derived gastric organoids. Nature. 516 (7531), 400-404 (2014).
  35. Schumacher, M. A., et al. The use of murine-derived fundic organoids in studies of gastric physiology. J Physiol. 593 (8), 1809-1827 (2015).
  36. . Unisense Available from: https://unisense.com/products/ph-microelectrode/ (2024)
  37. Mccracken, K. W., et al. Wnt/beta-catenin promotes gastric fundus specification in mice and humans. Nature. 541 (7636), 182-187 (2017).
  38. Schreiber, S., et al. In situ measurement of ph in the secreting canaliculus of the gastric parietal cell and adjacent structures. Cell Tissue Res. 329 (2), 313-320 (2007).
  39. Xu, H., Li, J., Chen, H., Wang, C., Ghishan, F. K. Nhe8 plays important roles in gastric mucosal protection. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304 (3), G257-G261 (2013).
  40. Gawenis, L. R., et al. Impaired gastric acid secretion in mice with a targeted disruption of the nhe4 na+/h+ exchanger. J Biol Chem. 280 (13), 12781-12789 (2005).
  41. Lewis, O. L., Keener, J. P., Fogelson, A. L. A physics-based model for maintenance of the ph gradient in the gastric mucus layer. Am J Physiol-Gastrointest Liver Physiol. 313 (6), G599-G612 (2017).
  42. Okkelman, I. A., Neto, N., Papkovsky, D. B., Monaghan, M. G., Dmitriev, R. I. A deeper understanding of intestinal organoid metabolism revealed by combining fluorescence lifetime imaging microscopy (flim) and extracellular flux analyses. Redox Biol. 30, 101420 (2020).
  43. Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Curr Protoc Immunol. 130 (1), e106 (2020).
  44. Guimera, X., et al. A minimally invasive microsensor specially designed for simultaneous dissolved oxygen and ph biofilm profiling. Sensors (Basel). 19 (21), 4747 (2019).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Lyon, K., Bansil, R., Bimczok, D. Profiling Luminal pH in Three-Dimensional Gastrointestinal Organoids Using Microelectrodes. J. Vis. Exp. (209), e66900, doi:10.3791/66900 (2024).

View Video