Summary

Verbesserte Extraktion von niedermolekularer DNA aus Abwasser zur umfassenden Bewertung von Antibiotikaresistenzen

Published: July 19, 2024
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Summary

Hier stellen wir eine einfache Technik zur Bewertung der antimikrobiellen Resistenz in der Umwelt (AMR) vor, indem der Anteil an niedermolekularer extrazellulärer DNA erhöht wird. Eine vorherige Behandlung mit 20%-30% PEG und 1,2 M NaCl ermöglicht den Nachweis sowohl genomischer als auch horizontal übertragener AMR-Gene. Das Protokoll eignet sich für einen kitfreien Prozess mit zusätzlicher Optimierung.

Abstract

Die Umweltüberwachung gilt als wichtiges Instrument zur Bewertung der öffentlichen Gesundheit in der Zeit nach der Pandemie. Wasser, insbesondere Abwasser, hat sich als die Quelle der Wahl herauskristallisiert, um Proben von Krankheitserregern in der Umwelt zu nehmen. Abwässer aus offenen Abflüssen und kommunalen Wasseraufbereitungsanlagen sind ein Reservoir sowohl für Krankheitserreger als auch für Gene für antimikrobielle Resistenzen (AMR) und kommen häufig mit Menschen in Kontakt. Es gibt zwar viele Methoden, um AMR aus dem Wasser zu verfolgen, aber die Isolierung von qualitativ hochwertiger DNA mit hohen Ausbeuten aus heterogenen Proben bleibt eine Herausforderung. Um dies zu kompensieren, müssen die Probenvolumina oft hoch sein, was zu praktischen Einschränkungen führt. Darüber hinaus ist die Umwelt-DNA häufig fragmentiert, und die Quellen von AMR (Plasmide, Phagen, lineare DNA) bestehen aus niedermolekularer DNA. Dennoch haben sich nur wenige Extraktionsverfahren auf Methoden zur Extraktion von linearer und niedermolekularer DNA mit hoher Ausbeute konzentriert. Hier wird über eine einfache Methode zur linearen DNA-Extraktion mit hoher Ausbeute aus kleinen Abwassermengen unter Verwendung der Fällungseigenschaften von Polyethylenglykol (PEG) berichtet. Diese Studie plädiert dafür, die Gesamt-DNA-Ausbeute von Wasserproben zu erhöhen, die für metagenomische Analysen entnommen wurden, indem der Anteil der linearen DNA angereichert wird. Darüber hinaus überwindet die Verbesserung der niedermolekularen DNA das derzeitige Problem der Unterbeprobung von umweltbedingter AMR aufgrund der Fokussierung auf hochmolekulare und intrazelluläre DNA. Es wird erwartet, dass diese Methode besonders nützlich ist, wenn extrazelluläre DNA vorhanden ist, jedoch in geringen Konzentrationen, z. B. bei Abwässern aus Kläranlagen. Es sollte auch die Umweltprobenahme von AMR-Genfragmenten verbessern, die sich durch horizontalen Gentransfer ausbreiten.

Introduction

SARS-CoV-2 und seine Folgen unterstrichen die Bedeutung der Umweltüberwachung für die Überwachung und Vorhersage von Ausbrüchen von Infektionskrankheiten 1,2. Während Viruspandemien offensichtlich sind, wird die Zunahme von Antibiotikaresistenzen (AMR) oft als heimtückische Pandemie bezeichnet, die weltweit ein Hauptproblem für die öffentliche Gesundheit darstellt 3,4. Folglich besteht ein dringender Bedarf an koordinierten Strategien, um die Entwicklung und Ausbreitung von AMR zu verstehen. Gewässer sowie Abwasser können sowohl für Krankheitserreger als auch für AMR 5,6,7,8 als Speicher dienen. Gemeinsam genutzte Wasserquellen sind daher eine starke Quelle für die Übertragung von Krankheiten unter Menschen, insbesondere in Ländern mit niedrigem und mittlerem Einkommen (LMIC), in denen schlechte Hygiene und Überbevölkerung Hand in Hand gehen 9,10,11. Die Untersuchung von Wasserquellen wird seit langem eingesetzt, um die Gesundheit der Bevölkerung zu beurteilen 12,13,14. Kürzlich erwies sich das Abwasser aus städtischen Kläranlagen als guter Indikator für COVID-Fälle in der Klinik 1,2,15,16,17,18.

Im Vergleich zur Überwachung spezifischer Krankheiten stellt die Erkennung und Verfolgung von AMR in der Umwelt ein komplexeres Problem dar. Die große Anzahl der verwendeten Antibiotika, die unterschiedlichen Resistenzgene, der unterschiedliche lokale Selektionsdruck und der horizontale Gentransfer zwischen Bakterien machen es schwierig, die tatsächliche AMR-Belastung zu beurteilen und sie nach der Bewertung mit klinischen Beobachtungen zu korrelieren 19,20,21,22. Während die konzertierte Überwachung klinischer AMR von mehreren Organisationen auf der ganzen Welt durchgeführt wird 3,23,24, steckt die umweltbedingte AMR-Überwachung noch in den Kinderschuhen, wie in 19,25,26 überprüft.

In den letzten Jahren wurden verschiedene Methoden zur Verfolgung umweltbedingter AMR berichtet 5,27, die in28,29 überprüft wurden. Ausgangspunkt der meisten davon ist die Extraktion von DNA guter Qualität aus heterogenen Umweltproben, was an sich schon eine Herausforderung darstellt. Darüber hinaus ist die DNA der Umwelt in der Regel fragmentiert, da sie einer feindlichen Umgebung ausgesetzt ist. Fragmentierte extrazelluläre DNA ist seit langem als wichtiges Reservoir für AMR-Gene anerkannt (überprüft in30, 31, 32), mit dem zusätzlichen Potenzial, Bakterien über horizontalen Gentransfer zu betreten und zu verlassen. Daher ist es wichtig, dass jedes Protokoll, das darauf abzielt, die AMR-Belastung in der Umwelt zu messen, so gut wie möglich lineare und niedermolekulare DNA beprobt. Überraschenderweise wurde wenig Wert auf die Entwicklung von Methoden gelegt, die speziell für die Extraktion von linearer und niedermolekularer DNA mit hoher Ausbeute spezifisch sind: Diese Arbeit konzentriert sich darauf, diese Lücke zu schließen.

Eine gängige und einfache Methode zur Ausfällung von DNA ist die Kombination von Polyethylenglykol (PEG) und Salzen wie Natriumchlorid (NaCl)33. PEG ist ein makromolekulares Crowding-Agenzmittel, das verwendet wird, um eine größenspezifische Präzipitation von DNA-Fragmentenzu erreichen 34,35. Je niedriger die PEG-Konzentration, desto höher ist das Molekulargewicht der DNA, die effizient ausgefällt werden kann. In vielen Studien wurde PEG bei der Extraktion von DNA und RNA 1,2 in der Umwelt (zusammengefasst in Tabelle 1 17,33,36,37,38,39) entweder im letzten Schritt 33,36,37 oder zur Konzentration großer Wasserproben zur Extraktion von Viruspartikeln wie bei SARS-CoV-2 verwendet 15,40. In der aktuellen Arbeit wurde festgestellt, dass die PEG-Konzentrationen, die zuvor für DNA-Extraktionen in der Umwelt verwendet wurden (weitgehend durch virale Überwachungsprotokolle bestimmt), keine lineare DNA mit niedrigem Molekulargewicht erfassen. Daher haben sie Nachsehen bei der Probenahme kurzer DNA-Fragmente und sind ungeeignet, um den AMR-Gehalt genau zu bestimmen. In dieser Studie wurden die Eigenschaften von Polyethylenglykol und Natriumchlorid genutzt, um lineare DNA-Fragmente mit niedrigem Molekulargewicht effektiv und mit hoher Ausbeute auszufällen, was in Zukunft zu einer kostengünstigen DNA-Extraktionsmethode führen kann. Diese Methode kann verwendet werden, um den Anteil an fragmentierter und niedermolekularer DNA aus komplexen natürlichen Proben anzureichern und so ein genaueres Bild der AMR in der Umwelt zu erhalten. Mit ein wenig weiterer Verfeinerung eignet sich die Technik für eine einfache und kostengünstige Anwendung durch lokale kommunale Unternehmen und andere Regierungsbehörden, um sie mit minimaler technischer Schulung als Überwachungsinstrument zu verwenden.

Protocol

1. Probenahme von Abwasser Tauchen Sie ein 500-ml-Polypropylen-Becherglas in den offenen Abfluss oder das Reservoir der Kläranlage (STP) und sammeln Sie ~300 mL Abwasserprobe. Übertragen Sie ~250 mL der Probe in eine 250 mL Flasche aus autoklaviertem Polypropylen. Schrauben Sie den Deckel der Flasche auf und verschließen Sie ihn mit einer Plastikfolie. Bewahren Sie die Flasche aufrecht in einem geschlossenen Beutel auf. Transportieren Sie die Probe aufrecht in e…

Representative Results

Etablierung eines Protokolls für die Extraktion von DNA aus Abwasserproben mit hoher AusbeuteFür die Extraktion von hochwertiger DNA und RNA aus Wasserproben wurde eine modifizierte Version von zuvor etablierten Protokollen verwendet17. Die Proben stammten aus offenen Abflüssen sowie aus Kläranlagen in der Region Delhi-NCR in Nordindien. Nach der Vorverarbeitung mit PEG und NaCl (Abbildung 1) wurden die Proben …

Discussion

AMR ist heute eine der 10 größten Gesundheitsbedrohungen, wie von der WHO aufgeführt, und die Umweltüberwachung für AMR ist weltweit als wichtiges Instrument anerkannt. Wie in der Einleitung erwähnt, umfasst eine umfassende Aufzeichnung von umweltbedingter AMR niedermolekulare, fragmentierte und extrazelluläre DNA. Das hier beschriebene Vorverarbeitungsprotokoll mit einer hohen Konzentration von PEG in Kombination mit Salz (30 % PEG und 1,2 M NaCl) erreicht dieses Ergebnis, indem es den Anteil an niedermolekularer…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken für die finanzielle Unterstützung durch die Rockefeller Foundation (Rockefeller Foundation Grant Number 2021 HTH 018) als Teil des APSI India Teams (Alliance for Pathogen Surveillance Innovations https://data.ccmb.res.in/apsi/team/). Wir danken auch der finanziellen Unterstützung durch die Axis Bank zur Unterstützung dieser Forschung und der Trivedi School of Biosciences an der Ashoka University für Ausrüstung und andere Unterstützung.

Materials

24-seat microcentrifuge Eppendorf Centrifuge 5425 R EP5406000046
Absolute Ethanol (Emsure ACS, ISO, Reag. Ph Eur Ethanol absolute for analysis) Supelco 100983-0511
Agarose Invitrogen 16500500
Bench top refrigerated centrifuge Eppendorf Centrifuge 5920 R EP5948000131
ChemiDoc Imaging System BioRad 12003153
DNeasy PowerSoil Pro Kit Qiagen 47014
DNeasy PowerWater Pro Kit Qiagen 14900-100-NF
dNTPs (dNTP Mix 10mM Each,0.2 mL, R0191) Thermo Fisher R0191
DreamTaq DNA Polymerase, 5 U/µL + 10x DreamTaq Buffer* Thermofscientific EP0702
E-Gel 1 Kb Plus Express DNA Ladder Invitrogen 10488091
Maxiamp PCR tubes 0.2 mL Tarsons 510051
Molecular Biology Grade Water for PCR HiMedia ML065-1.5ML
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer Thermo Scientific 13400519
Parafilm Bemis S37440
PEG-8000 SRL 54866
QIAquick PCR & Gel Cleanup Kit Qiagen 28506
Qubit 4 Fluorometer (with WiFi) Thermofisher Q33238
Qubit Assay Tubes Thermofisher Q32856
Qubitt reagent kit for ds DNA, broad range Thermo Scientific Q32853 (500 assays)
Sodium Chloride HiMedia TC046M-500G
SYBR Safe DNA Gel Stain Invitrogen S33102
T100 Thermal Cycler BioRad 1861096
Thermo Cycler (ProFlex 3 x 32-well PCR System) Applied Biosystems 4484073
Wizard Genomic DNA Purification Kit Promega A1125

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Karan, J., Mandal, S., Khan, G., Arya, H., Samhita, L. Enhanced Extraction of Low-Molecular Weight DNA from Wastewater for Comprehensive Assessment of Antimicrobial Resistance . J. Vis. Exp. (209), e66899, doi:10.3791/66899 (2024).

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