Generazione e analisi di immagini istologiche ad alto parametro con la citometria a flusso istodinamico

L’infiammazione guidata dalle cellule del sistema immunitario e dalle cellule gliali può contribuire a disturbi cronici del SNC in cui ogni popolazione può promuovere l’attività dell’altra ^1,2,3. Capire come il sistema immunitario interagisce con questi elementi del SNC per promuovere l’infiammazione del SNC è attualmente un argomento di grande interesse ed è stato notevolmente facilitato da tecniche ad alto parametro come il sequenziamento dell’RNA a singola cellula. Attraverso il sequenziamento dell’RNA a singola cellula, abbiamo scoperto che esiste un’ampia comunicazione tra le cellule gliali e il sistema immunitario in diversi disturbi del SNC ^4,5,6. Capire come queste interazioni stanno influenzando questi disturbi sarà fondamentale per chiarire la biologia di queste malattie.

Un problema con le analisi di sequenziamento di singole cellule è che queste tecniche richiedono che il tessuto venga distrutto per ottenere singole cellule o nuclei, con conseguente perdita completa di informazioni spaziali. Sapere dove si trova una cellula in un tessuto è fondamentale per comprendere il ruolo della cellula nel guidare l’infiammazione. Ad esempio, le cellule immunitarie come le cellule B possono concentrarsi nel SNC durante la neuroinfiammazione; tuttavia, raramente entrano nel parenchima del SNC e si concentrano invece nelle barriere^{SNC 7}. Data la loro localizzazione, è improbabile che queste cellule contribuiscano all’infiammazione del SNC interagendo fisicamente con le cellule gliali nel parenchima del SNC, suggerendo che qualsiasi interazione che potrebbero avere con le cellule gliali si verificherebbe attraverso fattori secrenti. Inoltre, la patologia che si verifica nei disturbi del SNC ha spesso una struttura ^8,9 tale che la localizzazione di una cellula nel tessuto potrebbe determinare in modo critico se sta contribuendo attivamente al disturbo o è uno spettatore. Pertanto, l’uso dell’orientamento spaziale per valutare il ruolo di una cellula nella patologia è essenziale.

Lo studio delle cellule nei tessuti è stato in genere realizzato utilizzando l’immunoistochimica o la microscopia a fluorescenza immunitaria. Un problema con queste tecniche è che in genere possono visualizzare solo fino a quattro parametri contemporaneamente. Questo è un grosso limite a queste tecniche, poiché sappiamo dalla citometria a flusso e dalle analisi di sequenziamento dell’RNA a singola cellula che molte popolazioni cellulari richiedono due o più parametri per la loro identificazione; Inoltre, il numero di parametri richiesti aumenta in genere quando si cercano sottoinsiemi specifici di un tipo di cella¹⁰. Pertanto, non è pratico utilizzare tecniche di imaging standard per studiare come sottogruppi di cellule possono interagire all’interno di un tessuto.

Questo problema è stato parzialmente superato attraverso nuovi metodi ad alto parametro in grado di conservare le informazioni spaziali, come il sequenziamento spaziale dell’RNA¹¹ e la citometria di massa per imaging¹². Sebbene queste tecniche siano preziose, presentano diversi problemi, come la non essere ampiamente disponibili, la riduzione dei dati tridimensionali in due dimensioni e la richiesta di una notevole esperienza per l’esecuzione. Un’altra tecnica nota come colorazione sequenziale, in cui i tessuti vengono colorati con una serie di anticorpi seguita dall’inattivazione della precedente serie di anticorpi prima di colorare con un’altra serie di anticorpi, può ottenere un’istologia ad alto parametro senza la necessità di attrezzature specializzate o competenze 13,14,15. Tuttavia, la colorazione sequenziale può essere estremamente laboriosa e richiede una grande quantità di tempo di microscopia, il che può essere poco pratico per i laboratori che non possiedono un microscopio personale. Pertanto, c’è bisogno di tecniche in grado di espandere il numero di parametri fluorescenti che possono essere visualizzati contemporaneamente su microscopi ampiamente disponibili e in modo tempestivo.

Una volta acquisiti i dati ad alto parametro, sorge un altro problema: è improbabile che i metodi convenzionali di analisi delle immagini riescano ad analizzare con successo i dati. Tecniche come il conteggio manuale o la soglia sono praticabili solo se l’analisi consiste in un singolo parametro o se più marcatori hanno la stessa localizzazione in cui vengono contati solo i segnali sovrapposti. Questa limitazione rende l’analisi tradizionale inadeguata per lavorare con set di dati ad alto parametro. L’analisi di successo di questi set di dati è stata ottenuta segmentando singole cellule da immagini istologiche e quindi conducendo strategie di gating simili alla citometria a flusso per identificare i tipi di cellule^16,17. Tuttavia, un altro problema che influisce su queste analisi è che funzionano solo per set di dati in cui tutte le cellule di interesse sono fisicamente separate l’una dall’altra, poiché queste tecniche non impiegano metodi in grado di separare accuratamente le cellule che sono in contatto fisico. Pertanto, è necessario un metodo più recente in grado di condurre analisi di singole cellule su sezioni istologiche anche se le cellule sono in contatto fisico.

In questo articolo viene descritto un semplice protocollo chiamato citometria a istoflusso che è stato precedentemente introdotto¹⁸ che espande il numero di parametri fluorescenti che possono essere visualizzati contemporaneamente utilizzando microscopi ampiamente disponibili. Questo protocollo funziona colorando i tessuti con coloranti spettralmente sovrapposti e quindi utilizzando la compensazione spettrale per rimuovere il sanguinamento dai canali sovrapposti per ottenere singole colorazioni chiare. Per facilitare l’analisi di immagini istologiche ad alto parametro, viene descritta una pipeline di analisi dettagliata che estrae singole cellule da sezioni di tessuto allo scopo di smistare le cellule in popolazioni distinte utilizzando strategie di gating simili alla citometria a flusso. Questo protocollo funziona nei tessuti in cui le cellule sono diffusamente presenti e nei tessuti in cui le cellule sono strettamente compattate insieme, rendendo questa tecnica versatile per lo studio di tessuti come il SNC sia nell’omeostasi che nella neuroinfiammazione. La citometria a istoflusso è, quindi, una tecnica utile per studiare le interazioni tra tipi di cellule complesse che richiedono più marcatori cellulari per definire le cellule mantenendo le informazioni spaziali.