Isolierung von mononukleären Zellen des humanen peripheren Blutes aus Buffy Coats durch immunmagnetische Hochdurchsatz-Bead-Trennung

Humane PBMCs sind vielseitige Zelltypen, die für zahlreiche Assays verwendet werden. Der Isolationsdurchsatz ist jedoch in vielen Laboratorien, einschließlich Biobanken, oft eine Einschränkung¹⁶. Zuvor hatte die NSW Health Statewide Biobank PBMCs mit der Dichtegradientenmethode isoliert. Die Automatisierung der Methode zur Trennung von Dichtegradienten zur Erhöhung der Verarbeitungskapazität wurde untersucht, aber es wurden Hindernisse für die Implementierung identifiziert, einschließlich (i) der Kosten für einen vollständig zu automatisierenden Liquid-Handler mit einer Zentrifugationseinheit, mit der zusätzlichen Anforderung einer HEPA-Einheit zur Herstellung eines sterilen Produkts, (ii) geschultem Personal für die Programmierung und (iii) Zeitaufwand für Protokolltests. Daher wurden in dieser Studie alternative Methoden untersucht und das kommerziell erhältliche humane PBMC-Kit identifiziert, das für die manuelle und automatisierte Verarbeitung verwendet werden könnte. Die Sterilität ist gewährleistet, da die für die Verarbeitung erforderliche Ausrüstung in eine Standard-biologische Sicherheitswerkbank (Länge 1,2 m) passt. In diesem Dokument werden Änderungen an dem vom Hersteller empfohlenen Protokoll¹⁴ beschrieben, um die Effizienz zu steigern und die Reagenzienkosten zu senken, ohne die Qualität zu beeinträchtigen. Darüber hinaus wurde das Protokoll des Herstellers erweitert, um detaillierte Schritte zu Biobank-Proben für zukünftige Forschungen zu beschreiben, einschließlich Vollblut (Schritt 1.2), Plasma (Schritt 2.2) und Erythrozyten (Schritt 2.5), die aus dem ursprünglichen Blutröhrchen aliquotiert werden, sowie Zellzählung und Kryokonservierung.

In dieser Studie wurden drei PBMC-Isolationsprotokolle verglichen: Dichtegradiententrennung, manuelle und automatisierte Bead-basierte Isolierung. Es wurden Änderungen am manuellen Bead-basierten Protokoll des Herstellers vorgenommen, einschließlich der Entfernung der Buffy-Coat-Verdünnung vor der PBMC-Isolierung und der Eliminierung der Notwendigkeit eines Break-Offs für Zentrifugen, so dass die Prüfärzte einem anpassungsfähigen, kostengünstigen PBMC-Isolationsprotokoll mit hohem Durchsatz folgen können. Zunächst wurden acht übereinstimmende Vollblutproben verwendet, um PBMCs zu isolieren und die Dichtegradiententrennung und die manuelle Bead-basierte Technik zu vergleichen. Wichtig ist, dass sich die Verteilung der Zellpopulation, die Zellviabilität und die Wiederfindung von PBMCs zwischen den beiden verglichenen Methoden nicht signifikant unterschieden, wie in Abbildung 2A-F, Abbildung 3A bzw. ergänzender Abbildung 1 gezeigt. In den repräsentativen Daten waren die Zellzahlen für die Dichtegradienten-Trennmethode unter Verwendung der Trypanblau-Ausschlussmethode höher, nicht jedoch bei Verwendung eines hämatologischen Zellanalysators. Die PBMC-Zelltypeinstellungen auf dem Zellzähler verwendeten einen Zelldurchmesserbereich von 8 bis 50 μm, und daher umfassen die Zählungen sowohl PBMCs als auch Granulozyten (ungefähr 12 bis 15 μm im Durchmesser), wenn die Trypanblau-Ausschlussmethode¹⁷ verwendet wird. Während der hämatologische Zellzähler eine höhere Spezifität aufwies als die Trypanblau-Ausschlussmethode, lagen einige Wiederfindungsberechnungen über 100 %, was die Fehlermarge des Instruments widerspiegelt (siehe Ergänzende Abbildung 1). Es wird daher empfohlen, dass die Forscher beim Vergleich der Ausbeuten aus PBMC-Isolationsprotokollen eine Kombination von Zellzähltechniken anwenden, da die meisten Techniken nicht sowohl spezifische als auch hochempfindliche differentielle Zellzählungen bieten. Darüber hinaus wurden keine Assays durchgeführt, um die funktionelle Aktivität von PBMCs zu vergleichen, die mit einer der beiden Techniken erzielt wurden, was eine Einschränkung unserer Analyse darstellt.

Als nächstes wurden die manuellen und automatisierten Bead-basierten Methoden verglichen, und es wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen PBMC-Ausbeute oder Lebensfähigkeit aus 8 übereinstimmenden Proben festgestellt (Abbildung 4A,B). Die Zellpopulationen wurden nicht einzeln verglichen, da für beide Methoden der gleiche Antikörper-Isolierungscocktail verwendet wurde. Wichtig ist, dass die Hands-on-Zeit für die Verarbeitung von 8 Proben mit dem automatisierten Protokoll von 43 Minuten auf 22 Minuten reduziert wurde (Abbildung 4C). Während der Durchsatz, die Vermeidung von Burnout durch den Techniker und die Konsistenz der Probenverarbeitung durch Automatisierung sichergestellt werden, sind die Kosten für Reagenzien und Verbrauchsmaterialien mit dem 3- bis 4-fachen höher als bei der manuellen Bead-basierten Methode. Dies geschieht nach Änderungen am Protokoll des Herstellers, um 1 ml Buffy Coat (ab einem Vollblutvolumen von 10 ml) anstelle des empfohlenen Bereichs von 2-5 ml (ab einem Vollblutvolumen von 10 ml und/oder mehr) zu verwenden. Wenn das Budget begrenzt ist, kann die Entscheidung für die manuelle Methode die Verarbeitungszeit um ~25 % verkürzen und gleichzeitig die Kosten für Reagenzien und Verbrauchsmaterialien beibehalten, die mit denen der Dichtetrennmethode vergleichbar sind. Es wird empfohlen, nicht mehr als 8 Proben gleichzeitig pro Techniker zu verarbeiten, um eine angemessene Staffelung der Proben (~30 s/Probe) innerhalb der 5-minütigen Inkubationszeiten (Schritte 3.7, 3.11 und 3.14) zu gewährleisten.

Sowohl bei den manuellen als auch bei den automatisierten Bead-basierten Methoden ist die Entfernung des Buffy-Coats ein entscheidender Schritt, um eine optimale PBMC-Isolierung zu gewährleisten. Es ist wichtig zu beachten, dass in diesem Protokoll ein Buffy Coat anstelle von Vollblut verwendet wird, da das Volumen der Reagenzien auf dem Ausgangsmaterial^{Volumen 10} basiert. Das gesamte Volumen des Buffy-Fells effektiv zu entfernen, kann eine technische Herausforderung sein. Ursprünglich wurde bei dieser Methode 0,5 ml Buffy Coat entfernt, die jedoch auf 1 ml erhöht wurde, um die Regeneration zu verbessern. Um eine angemessene und konsistente Wiederherstellung des Buffy Coat zu gewährleisten, ist es wichtig, diesen Prozess in der Protokolldokumentation und Schulung detailliert zu beschreiben. Es wird empfohlen, eine Pipettenspitze beim Ansaugen des Buffy Coats zu schwenken und dabei darauf zu achten, nicht zu viele Erythrozyten aus der darunter liegenden Schicht abzusaugen (Schritt 2.3). Es ist wichtig, den Antikörpercocktail, der unerwünschte Zellen (d. h. Granulozyten und rote Blutkörperchen) bindet, nicht zu sättigen, was sich auf die Ausbeute und Reinheit auswirken kann¹⁰. Um die bei der Extraktion des Buffy Coats angesammelten Erythrozyten zu minimieren, sollte sich die Pipettenspitze zwischen der Plasma- und der Buffy-Coat-Schicht befinden. Das Volumen des Buffy Coats kann ab 1 mL erhöht werden; Es muss jedoch darauf geachtet werden, dass nicht mehr als 10 % des gesammelten Volumens Erythrozyten enthalten. Alternativ kann ein automatisierter Liquid Handler verwendet werden, um Buffy Coats konsistent zu sammeln¹⁸. Die für die Kalibrierung und Fehlerbehebung von Liquid-Handling-Instrumentenprotokollen erforderlichen Stunden sind jedoch für die meisten Labore möglicherweise nicht durchführbar, insbesondere angesichts der Kosten.

Die Umstellung und Anwendung des auf Automatisierungsbeads basierenden Protokolls war angesichts des Ziels der NSW Health Statewide Biobank, in den nächsten 3 Jahren 23.000 PBMCs zu verarbeiten, von entscheidender Bedeutung. Hier wurde gezeigt, dass PBMCs bis zu 9 Tage nach der Entnahme aus ACD-Röhrchen isoliert werden können, mit einer durchschnittlichen Viabilität von >70%. Während die Ausbeute 24 Stunden nach der Entnahme optimal war, ist eine Verarbeitung innerhalb dieses Zeitrahmens nicht immer möglich, da möglicherweise Proben transportiert werden müssen. Es wurde gezeigt, dass PBMCs, die entweder mit der manuellen oder der automatisierten Bead-basierten Methode isoliert wurden, Ausbeuten von >3 x 10⁵ Zellen/ml Vollblut aufweisen können, wenn sie innerhalb von 4 Tagen nach der Entnahme isoliert werden, und >1 x 10⁵ Zellen/ml Vollblut, wenn sie innerhalb von 10 Tagen nach der Entnahme isoliert werden. Niedrige Zahlen für Proben über 5 Tage werden als Einschränkung dieser Analyse angegeben. Darüber hinaus wurden die Daten nicht nach Alter, Geschlecht und klinischer Anamnese der Teilnehmer getrennt, da diese Informationen nicht zur Verfügung gestellt wurden. Obwohl eine vergleichende Analyse erforderlich ist, um die Auswirkungen von Verzögerungen in den Verarbeitungszeiten für beide Methoden zu untersuchen, wurde bereits berichtet, dass Verzögerungen bei der PBMC-Isolierung mit der Dichtegradientenmethode die Zellqualität verringern und die Erythrozytenkontamination signifikant erhöhen^19,20. Darüber hinaus nehmen die Granulozytenanteile zu, wenn die Verarbeitung verzögert wird, und daher sollten Proben ähnlichen “Alters” für nachgelagerte Analysen gruppiert werden 20,21,22. Bemerkenswert ist, dass dieses Experiment unter Verwendung von Blut durchgeführt wurde, das mit saurer Zitronendextrose (d. h. Trinatriumcitrat, Zitronensäure und Dextrose) antikoaguliert wurde. Die Ausbeute und/oder der Anteil der Zelltypen können jedoch variieren, wenn andere Antikoagulanzien verwendet werden²³; Daher wird den Prüfärzten empfohlen, ein geeignetes Antikoagulans auf der Grundlage der vorgesehenen nachgeschalteten PBMC-Analysen auszuwählen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass ein Protokoll für die PBMC-Isolierung mit magnetischen Beads, das an Arbeitsabläufe mit hohem Durchsatz angepasst werden kann, detailliert beschrieben wird, um die Anforderungen an die Skalierung zu erfüllen, ohne die Lebensfähigkeit der Zellen zu beeinträchtigen. Sowohl die manuelle als auch die automatisierte Methode können optimiert werden, um durch Änderung des Start- und Resuspensionsvolumens spezifische Zellkonzentrationen zu erzeugen. Die NSW Health Statewide Biobank ist von der Extraktion von ~60 PBMCs pro Monat mit der traditionellen Dichtegradiententrenntechnik auf ~300 PBMCs pro Monat mit dieser automatisierungskompatiblen, beadbasierten Methode umgestiegen. Das nächste Ziel der Autoren ist es, die automatisierte Plattform zu nutzen, um bis zu 1200 PBMCs pro Monat zu verarbeiten und PBMCs, die sowohl durch magnetische Bead-basierte (manuelle und automatisierte) als auch durch Dichtegradiententechniken isoliert wurden, weiter zu vergleichen, um die Implementierung dieser Technik in anderen Labors mit besonderem Schwerpunkt auf Biobanken zu leiten.