JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neurowissenschaften

DREAM implant: Başa sabitlenmiş ve serbest hareket eden farelerde kronik elektrofizyoloji için hafif, modüler ve uygun maliyetli bir implant sistemi

Published: July 26, 2024
doi:
10.3791/66867
, , , , , , , ,
1Donders Institute for Brain, Cognition and Behaviour,Radboud University, 23D Neuro B.V., 3Zero-Noise Lab,Ernst-Strüngmann Institute for Neuroscience

Summary

Burada, kemirgenlerde kronik elektrofizyoloji için kullanım kolaylığı, prob geri kazanımı, deneysel çok yönlülük ve davranışla uyumluluk için optimize edilmiş hafif, uygun maliyetli bir prob implant sistemi sunuyoruz.

Abstract

Kemirgenlerdeki kronik elektrofizyolojik kayıtlar, nöronal dinamikler ve bunların davranışsal önemi hakkındaki anlayışımızı önemli ölçüde geliştirmiştir. Bununla birlikte, probları kronik olarak implante etmek için mevcut yöntemler, maliyet, kullanım kolaylığı, boyut, uyarlanabilirlik ve uzun vadeli stabilite arasında dik dengeler sunar.

Bu protokol, fareler için DREAM (Dinamik, Kurtarılabilir, Ekonomik, Uyarlanabilir ve Modüler) adı verilen ve şu anda mevcut seçeneklerle ilişkili ödünleşimlerin üstesinden gelmek için tasarlanmış yeni bir kronik prob implant sistemi sunar. Sistem, basit adımlarla birleştirilebilen ve implante edilebilen ve probların geri kazanımı ve çoklu yeniden kullanımı için güvenli bir şekilde eksplante edilebilen standartlaştırılmış donanım elemanları ile hafif, modüler ve uygun maliyetli bir çözüm sunarak deneysel maliyetleri önemli ölçüde azaltır.

DREAM implant sistemi üç donanım modülünü entegre eder: (1) tüm standart silikon probları taşıyabilen ve deneycilerin 7 mm’ye kadar bir hareket mesafesi boyunca kayıt derinliğini ayarlamasına olanak tanıyan bir mikro sürücü; (2) elektrik koruması, darbe koruması ve konektör yerleşimi için bakır ağ kaplı giyilebilir bir Faraday kafesi için üç boyutlu (3D) yazdırılabilir, açık kaynaklı bir tasarım ve (3) gelişmiş hayvan refahı ve kullanım kolaylığı için minyatür bir kafa sabitleme sistemi. İlgili cerrahi protokol hız (toplam süre: 2 saat), prob güvenliği ve hayvan refahı için optimize edilmiştir.

İmplantlar, hayvanların davranış repertuarı üzerinde minimum etkiye sahipti, serbestçe hareket eden ve başa sabitlenen bağlamlarda kolayca uygulanabilirdi ve implant sonrası haftalarca veri toplama için açıkça tanımlanabilir başak dalga formları ve sağlıklı nöronal tepkiler sağladı. Enfeksiyonlar ve diğer cerrahi komplikasyonlar son derece nadirdi.

Bu nedenle, DREAM implant sistemi, farelerde kronik elektrofizyoloji için çok yönlü, uygun maliyetli bir çözümdür, hayvan refahını artırır ve etolojik olarak daha sağlam deneyler sağlar. Tasarımı, çeşitli araştırma ihtiyaçlarında deneysel prosedürleri basitleştirerek, kemirgenlerde kronik elektrofizyolojinin çok çeşitli araştırma laboratuvarlarına erişilebilirliğini artırır.

Introduction

Kronik olarak implante edilmiş silikon problara sahip elektrofizyoloji, genetik ve deneysel izlenebilirlikleri nedeniyle, özellikle farelerde, davranan hayvanlarda nöral aktivite ve bağlantıyı araştırmak için güçlü bir teknik olarak ortaya çıkmıştır1. Özellikle laminer silikon probların, kortikal sütunlar2 içindeki fonksiyonel ilişkileri tanımlamak ve büyük nöronal popülasyonların dinamiklerini daha önce imkansız olan bir şekilde davranışla ilişkilendirmek için paha biçilmez bir araç olduğu kanıtlanmıştır3.

İki tamamlayıcı yaklaşım, in vivo nöral aktiviteyi kaydetmek için mevcut altın standartlardır: iki foton mikroskobu 4,5 ve hücre dışı elektrofizyoloji6. Kayıt metodolojisinin seçimi, elde edilebilecek okumaların doğasını kısıtlar: iki foton mikroskobu, zaman içinde büyük popülasyonlarda bireysel olarak tanımlanabilir nöronların uzunlamasına çalışmaları için özellikle uygundur, ancak yüksek ekipman maliyetlerinden muzdariptir ve sağlam beyinlerdeki korteksin yüzeysel katmanlarıyla sınırlıdır. Ek olarak, ~30 Hz’lik tipik zamansal çözünürlük, devam eden nöronal dinamikleri yakalama yeteneğini sınırlar 7,8.

Buna karşılık, elektrofizyolojik kayıtlar, nöronal aktiviteyi an be an izlemek için yüksek zamansal çözünürlük (40 kHz’e kadar) sunar, türler arasında ve kortikal derinliklerde yaygın olarak uygulanabilir ve iki foton mikroskobuna kıyasla nispeten düşük maliyetli kurulumlara sahiptir. Bununla birlikte, bireysel nöronların tanımlanmasının yanı sıra nöronal popülasyonların uzunlamasına izlenmesini sağlamak zordur. Bu özellikle tel elektrotlar, örneğin tetrodlar ve akut elektrot girişleri için geçerlidir. Kayıt oturumları9 boyunca nöronları takip etme yeteneğinden yoksun olmanın yanı sıra, tekrarlanan akut eklemeler, enfeksiyon ve gliozis olasılığını artıran bir bağışıklık tepkisi11 oluşturan lokal travmaya10 neden olur. Bu, sonuçta, kaydedilen nöronal aktivitenin stabilitesini ve deney hayvanlarının yaşam beklentisini azaltır ve akut elektrofizyolojik kayıtları içeren uzunlamasına çalışmaların kapsamını sadece birkaç günle sınırlar12.

Kronik yüksek yoğunluklu silikon prob kayıtları, akut elektrofizyoloji ve iki fotonlu görüntülemenin en iyi özelliklerinden bazılarını birleştirmeyi amaçlamaktadır. İki fotonlu görüntülemeye kıyasla tek tek nöronları tanımlama konusunda yalnızca biraz daha düşük bir yetenekle oturumlar boyunca nöral popülasyon dinamiklerini izleyebilirler13. Bu kayıtlar, kaydedilen sinyallerin uzamsal yerleşiminde ve kesin zamansal çözünürlüğünde yüksek esnekliğin yanı sıra, akut kayıtlara kıyasla deney hayvanlarının daha uzun ömürlülüğünü ve refahını sağlar14. Ayrıca, akut kayıtların aksine, kronik elektrofizyoloji sadece tek bir implantasyon olayı gerektirir, bu da enfeksiyon ve doku hasarı riskini etkili bir şekilde azaltır ve hayvanlar üzerindeki stresi en aza indirir15. Toplu olarak, bu avantajlar kronik elektrofizyolojiyi sinir sisteminin organizasyonunu ve işlevini araştırmak için güçlü bir araç haline getirir.

Bununla birlikte, fareler için yaygın olarak kullanılan kronik implantasyon teknikleri, araştırmacıları davranışsal kayıtlarla uyumluluk, implant ağırlığı, implantların tekrarlanabilirliği, finansal maliyetler ve genel kullanım kolaylığı arasında önemli değiş tokuşlar yapmaya zorlamaktadır. Birçok implant protokolü, probların16 yeniden kullanımını kolaylaştırmak için tasarlanmamıştır, bu da bireysel deneylerin etkin maliyetini dik bir şekilde artırır ve böylece bazı laboratuvarların kronik elektrofizyolojiyi kullanmasını finansal olarak zorlaştırır. Ayrıca, genellikle uzmanlık ve kaynakların mevcut olmayabileceği kapsamlı şirket içi prototipleme ve tasarım çalışmaları gerektirirler.

Öte yandan, entegre implant sistemleri17 kemirgenlerde kronik elektrofizyoloji için daha yaygın olarak erişilebilir bir çözüm sunar. Bu sistemler, implant kullanımını ve cerrahi prosedürleri basitleştirmek için probu tutan bir mikro sürücüyü implantın geri kalanıyla entegre etmek üzere tasarlanmıştır. Bununla birlikte, bir kez implante edildikten sonra, bu tür sistemler çok ağır olabilir ve deneycinin bir deneyi farklı hedef koordinatlara esnek bir şekilde uyarlama yeteneğini sınırlayabilir. Genellikle, ağırlıkları daha küçük hayvanlarda implantları engeller, potansiyel olarak hayvan hareketini bozar ve strese neden olur18. Bu, kilo sınırlamalarının bu grupları etkileme olasılığı daha yüksek olduğundan, çocuk ve kadın kohortları üzerindeki araştırmaları orantısız bir şekilde etkileyebilir.

Ek olarak, tüm entegre sistemler implantasyon sonrası elektrot pozisyonlarının ayarlanmasına izin vermez. Bu önemlidir, çünkü prob yerleştirilmesine19 bağlı gliozis veya yara izi, özellikle implantasyondan sonraki ilk 48 saat içinde20, kaydedilen nöronal aktivitenin kalitesini azaltabilir. Prob yerleştirme derinliğinde yapılan mikro ayarlamalar, sinyal bütünlüğü üzerindeki bu olumsuz etkileri sınırlayabilir. Bu nedenle, yaygın olarak mikro sürücüler olarak adlandırılan mikro konumlandırma mekanizmaları, uzunlukları boyunca dağıtılmış çok sayıda elektrot içeren problarda bile faydalı olabilir.

Bu tür ödünleşimlerin üstesinden gelmek için, hafif, uygun maliyetli ve modüler bir çözüm sunarak önceki tasarımların sınırlamalarını ele alan fareler için yeni bir kronik elektrofizyoloji implant sistemi sunuyoruz. DREAM implant sistemi, bir farenin tipik vücut ağırlığının %10’undan (~2,1 g) daha hafif olacak şekilde tasarlanmıştır ve hayvan refahı ve davranış üzerinde minimum etki sağlar. DREAM implant tasarımının doğrulanması, kafatasına yük yerleştirildiğinde kemirgenlerde önemli ölçüde etkilenebilen hareket gibi davranışsal temel metrikler üzerinde minimum etki gösterir. Bu, hayvan refahını artırarak ve etolojik olarak daha sağlam deneylere izin vererek, serbestçe hareket eden ve kafası sabit hayvanları kullanan deneysel paradigmalara fayda sağlayabilir.

Sistem, 7 mm’ye kadar kayıt derinliğinin esnek bir şekilde ayarlanması için bir mikro sürücü içerir ve farklı tipteki problara ve kayıt cihazlarına uyarlanabilir, bu da araştırmacılara çeşitli deneysel uygulamalar için uygun maliyetli ve çok yönlü bir araç sağlar. Sistem, diğer sistemlere kıyasla tutarlı prob geri kazanımı sağlayan (beklenen ortalama geri kazanım oranı: prob başına yaklaşık üç güvenilir yeniden kullanım) ve bireysel deneylerin maliyetini önemli ölçüde azaltan metal bir mikro sürücü21 ile rutin olarak birleştirilir.

Tasarım, elektrofizyolojik gürültüye, mekanik darbelere ve bulaşıcı malzemelere karşı ucuz ama sağlam koruma sağlayan 3D baskılı koruyucu Faraday kafesine sahiptir ve minimum enfeksiyon oranlarından muzdarip istikrarlı ve gürültüsüz kayıtlar sağlar. Bu implante edilebilir kafes, darbelere karşı koruma ve Faraday kafesinin iletken metal ağ kaplaması için yapı sağlamak üzere tasarlanmış ‘taç’ adı verilen taç halkasından ve implante edilebilir bir amplifikatör ve/veya prob konektörü için bir montaj görevi gören taç halkasından oluşur (bkz. Şekil 1).

Son olarak, modüler implant sistemine dahil olan kafa plakaları, implanta ekstra hacim eklemeden yeni, verimli bir kafa sabitleme sistemi ile uyumlu olacak şekilde tasarlanmıştır. Mevcut diğer sistemlerin aksine, implanta yakın küçük vidaların sıkılmasını, deney düzeneğinde farelerin sabitlenmesini hızlandırmayı ve deneyci-hayvan ilişkisinin yanı sıra davranışsal uyumu iyileştirmeyi gerektirmez. Aynı zamanda, başlık plakası DREAM kronik elektrofizyoloji sisteminin diğer modüllerini oluşturmak için bir temel olarak kullanılır.

DREAM implantı için tasarım dosyaları https://github.com/zero-noise-lab/dream-implant/’da açık kaynaklı donanım olarak yayınlanmaktadır. İlerleyen bölümlerde, DREAM implant sisteminin tasarımı ve üretimi anlatılacak, bir fare modelinde başarılı bir şekilde uygulanması gösterilecek ve mevcut sistemlere kıyasla potansiyel uygulamaları ve avantajları tartışılacaktır.

Protocol

Tüm deneysel prosedürler Max Planck Topluluğu’nun kurumsal yönergelerine göre yürütülmüş ve yerel yönetimin etik komitesi tarafından onaylanmıştır (Beratende Ethikkommission nach §15 Tierschutzgesetz, Regierungspräsidium Hessen, Proje onay kodu: F149-2000). Şekil 1: İmplant tasarımı. (A) Bir prob konektörüne bağlı bir silikon prob ile bir fare kafatası üzerine bindirilmiş implantın 3D görüntüsü. Başlık plakasının merkezi açıklığı, ölçek için yaklaşık 10 mm’dir. Sürücünün yüksekliği yaklaşık 17 mm’dir. Faraday tacının dışını oluşturan bakır ağ ve ayrıca toprak/ref telleri gösterilmemiştir. (B) (A) ile aynı, bir prob konektörü yerine bir amplifikatör kartına bağlantı ile. (C) İmplantın bileşenlerini gösteren patlatılmış teknik çizimi. (D) Mikro sürücünün önceden tanımlanmış bir açıda (burada: 20°) tutarlı bir şekilde implante edilmesine izin verecek şekilde bir mikro sürücünün altına yerleştirilebilen açılı bir ara parçanın oluşturulması. (E) Entegre kafa sabitleme mekanizmasının oluşturulması, Faraday tacı ile implante edilmiş kafa plakasını çevreleyen kafa sabitleme kelepçesi ve kurulum için güvercin kuyruğu bağlantısını gösterme. (F) İmplantın entegre kafa sabitleme mekanizması kullanılarak bir koşu bandına sabitlenmiş fare kafasının görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. NOT: Bölüm 1 ve 2’de cerrahi öncesi hazırlıklar ele alınmaktadır 1. Silikon probun hazırlanması Probun yeniden kullanılması durumunda, silikon probu prob tedarikçisinin tavsiyelerine göre temizleyin. Probu enzimatik temizleyicide ( Malzeme Tablosuna bakınız) 5-10 dakika bekletin, ardından demineralize suda durulayın. Eksplantasyondan sonra bunu mümkün olduğunca çabuk yapın. (Yeniden) implantasyondan bir gün önce, dezenfeksiyon için probu en az 30 dakika boyunca% 70 etanolde bekletin. Kaydedilen sinyalin spesifikasyonları dahilinde olduklarından emin olmak için kanal empedanslarını ölçün. Neuropixels kullanım kılavuzundaki gürültü seviyelerini test etmek için protokolü izleyin22, istenen kayıt yazılımı (örn. https://open-ephys.github.io/gui-docs/User-Manual/Plugins/Acquisition-Board.html#impedance-testing) aracılığıyla empedansı ölçün ve silikon prob üreticisinden veya veri sayfasından hedef kanal empedanslarını takip edin. Empedanslar çok yüksekse, elektrot bölgelerini23 yeniden kaplamayı düşünün. 0.05″ lehim kuyruğu soketini (Malzeme Tablosuna bakın) probun topraklama (GND) kablosuna lehimleyin. Ameliyat sırasında soketi GND pinine bağlayın (sonraki adım).NOT: Bu protokolde, kullanılan headstage üzerinde GND ve REF kısa devre yaptığı için ayrı bir referans (REF) pini kullanılmaz. Bu nedenle, protokolün geri kalanında yalnızca GND pininden bahsedilecektir. Ayrı bir REF kullanılıyorsa, REF pini için aşağıdaki adımı tekrarlayın. GND pimini hazırlamak için, 0.05″ lehim kuyruğu soketinin (Malzeme Tablosuna bakın) pim tarafını, yerleştirme büyük ölçüde zahmetsiz olana kadar GND 0.05″ lehim kuyruğu soketine tekrar tekrar takın. Altın kaplama pimlerin kullanılması, bu yumuşatma adımına olan ihtiyacı azaltabilir. Bu, GND piminin ve soketinin ameliyat sırasında aşırı basınç uygulamaya gerek kalmadan kolayca bağlanabilmesini sağlayarak hayvanın yaralanma riskini ve prob hasarını azaltır. Silikon prob için implante edilebilir bir ön amplifikatör kullanılıyorsa, tedarikçinin prosedürlerini izleyerek bunları kronik implantasyon için hazırlayın. Ardından amplifikatörü/konektörü, Faraday halkasının alanını tutmak için tasarlanmış alana yapıştırmak için silikon sıva kullanarak Faraday kafesinin halkasına takın.NOT: Tedarikçinin prosedürlerini takiben kronik implantasyon için silikon prob için implante edilebilir ön amplifikatörün hazırlanması, nemin elektronik aksamlara zarar vermesini önlemek için bunların silikon veya epoksi ile kaplanmasını ve ayrıca çiftleşme kuvvetini azaltmak için amplifikatör konektörünün tekrar tekrar eşleştirilmesini içerebilir. Bu, özellikle Omnetics kullanıcıları için kullanışlıdır. 2. Mikro sürücü ve başlığın hazırlanması Mikro sürücü gövdesindeki vidayı, mikro sürücü mekiği neredeyse tamamen yukarı doğru geri çekilecek şekilde çevirin. İsteğe bağlı olarak, siyanoakrilat yapıştırıcı veya diş çimentosu ile mikro sürücünün altına açılı bir ara parça (bkz. Şekil 1D) takın, bu belirli bir eğim derecesinin kullanılmasına izin vermek için kullanılabilir, örneğinample, merkezi sulkus içindeki bir bölgede kortikal katmanlardan kayıt yaparken veya dikey olmayan bir yaklaşım gerektirebilecek derin yapılar içinde (açılı ara parça için, Malzeme Tablosuna bakınız). Mikro sürücüyü, mikro sürücü tutucusuna yatay olarak yerleştirin (Ek Şekil 1). Mikro sürücü tutucusuna, baş aşaması konektörünün yerleştirileceği mikro sürücünün üzerinde bir mesafede küçük bir parça yapışkan macun ( Malzeme Tablosuna bakın) yerleştirin. Bu mesafe, silikon probu headstage konektörüne bağlayan esnek kablonun uzunluğuna bağlıdır. Mekiğin üzerine küçük bir damla silikon alçı ( Malzeme Tablosuna bakın) yerleştirin. Silikon probu künt, yumuşak uçlu bir forseps yardımıyla ambalajından çıkarın. Bunları, standart iğne burunlu forsepsleri 3 mm çapında ısıyla daralan makaron ile kaplayarak yapın (Malzeme Tablosuna bakınız). Probu önce esnek kabloyla birlikte mikro sürücünün mekiğine yerleştirin, böylece esnek kablonun alt kenarı mikro sürücü mekiğinin alt kenarından hafifçe sarkar. Esnek kablonun alt kenarı mikro sürücü mekiğinin alt kenarıyla buluşana kadar esnek kabloyu yavaşça mikro sürücünün üst kısmına doğru çekin. Bu adım sırasında esnek kabloyu, sonunda mikro sürücüye tam olarak dikey olarak yerleştirilecek şekilde mikro sürücü mekiğinin sol kenarına doğru ittiğinizden emin olun. Bu noktada, silikon probun saplarının mikro sürücünün alt kenarını geçmediğinden (veya yalnızca minimum düzeyde) çıkıntı yapmadığından emin olun (prob saplarının tam uzunluğuna ve hedeflenen beyin alanının derinliğine bağlı olarak). Probun düşmesini önlemek için probun baş aşaması konektörünü tutucunun üst kısmındaki yapışkan macunun üzerine yerleştirin. Probu yerine sabitlemek için esnek kablo ile mekik arasına küçük bir damla siyanoakrilat yapıştırıcı ( Malzeme Tablosuna bakın) uygulamak için 27 G’lik bir şırınga iğnesi kullanın. Yapıştırıcının mikro sürücüye veya mekiğin ötesindeki esnek kablo boyunca akmadığından emin olun (Bu çok önemlidir) Esnek kablo yerine yapıştırıldıktan sonra, amplifikatörü silikon sıva kullanarak taç halkasına ( Malzeme Tablosuna bakın) takın. Ardından, esnek kabloyu amplifikatöre takın ve bağlantıyı ve kabloyu ince bir silikon sıva tabakasıyla kaplayın. 5 dakika sonra, sıva sertleştiğinde, mikrosürücüyü ve probu daha fazla kullanana kadar güvenli bir şekilde saklayın. Faraday kafesini örtmek için bakır ağ parçalarını ( Malzeme Tablosuna bakınız) açık bir çörek şeklinde kesin ( Ek Şekil 2’deki kesme modeline bakın). Bakır ağ kesimini küçük damla epoksi reçine ile Faraday kafesine sabitleyin (Malzeme Tablosuna bakınız). Bu adım için, epoksiyi diş çimentosu ile de değiştirebilirsiniz.NOT: Faraday kafesi, bir prob konektörünü veya amplifikatörü barındırmak için bir alan içerir. Bu alan, tasarım dosyasında bir X ile işaretlenmiştir ve amplifikatör/konektör için destekleyici bir tabanın yanı sıra kafesin iki bitişik jant teli arasında daha büyük bir mesafe içerir. Amplifikatör/konektör etrafında yeterli boşluk oluşturmak için, iki bitişik jant teli arasına az miktarda fazladan ağ sabitleyin ve bir çıkıntı oluşturun. Bu, amplifikatörün/konektörün daha sonra Faraday kafesine dokunmadan bu ‘cebe’ yerleştirilebilmesini sağlar. Minimum bükülme ile güvenli yapışma sağlamak için, şekli korumak ve tepenin ince tellerini desteklemek için doğrudan tepenin üzerine yerleştirilen taç halkasını kullanın. Ayrıca, kurutma sırasında tepeyi ve ağı sabitlemek için lehimleme yardımcı ellerini kullanın. Prosedür uygulanırken tacın şeklini korumakta zorlanıyorsanız, bükülmeyi önlemek için bir seferde sadece iki taç kolunu epoxy’ye tabi tutmaya çalışın. Faraday kafesinin ayrı bir topraklaması isteniyorsa, 30 mm’lik bir topraklama kablosuna küçük bir başlık pimi lehimleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız), ardından teli bakır ağ oyuğuna yapıştırmak için iletken epoksi kullanın.NOT: Laboratuvarda bu adıma uyulmamaktadır. Bu noktada, hazırlanan parçaları güvenli bir şekilde saklayın ve daha sonraki bir aşamada ameliyat yapın.NOT: Bölüm 3-6, mikro sürücünün ve başlığın implantasyonunu tartışır. 3. Cerrahi: Prob ve çalışma alanının hazırlanması Onaylanmış bir prosedürü izleyerek cerrahi aletleri sterilize edin ve cerrahi çalışma alanına yerleştirin.NOT: Bu, onaylanmış deney protokolüne bağlı olarak bir boncuk sterilizatörü, otoklavlama aletleri kullanmayı veya peroksit veya etanol ile durulamayı içerebilir. Diş çimentosunu hazırlamak için kullanılan seramik kalıbı, diş çimentosu kitindeki talimatları izleyerek bir buz kutusuna, buzdolabına veya derin dondurucuya yerleştirin (bkz. Malzeme Tablosu). Çimentonun dövülebilir olma süresini artırmak için çimento karıştırma sırasında soğutulmuş seramik kabı kullanın. Daha uzun çimentolama adımlarının gerekli olduğu durumlarda soğutulmuş bir kap kullanın. Deneyin sonunda prob yerleşiminin histolojik olarak doğrulanması isteniyorsa, mikrosürücü üzerindeki vidayı saat yönünün tersine çevirerek silikon probu ameliyattan hemen önce uzatın ve küçük bir boya damlasına batırarak proba lipofilik bir boya uygulayın (Malzeme Tablosuna bakınız). Lipofilik boyayı, ticari olarak satın alınan bir dimetil sülfoksit (DMSO) veya etanol (EtOH) seyreltilmiş stok çözeltisinden (Malzeme Tablosuna bakınız) 1-5 μM konsantrasyonda PBS gibi uygun bir tampon içinde seyrelterek hazırlayın. 4. Cerrahi: Hayvanın hazırlanması Aseptik koşullar altında 2-4 saatlik bir kemirgen cerrahisi için onaylanmış bir anestezi protokolünü izleyin. Bu, genel ve lokal anestezi, analjezi, göz merhemlerinin uygulanması ve salin enjeksiyonlarını içerebilir. Burada, enjekte edilebilir anestezi (ketamin 100 [mg / kg] / medetomidin 0.5 [mg / kg]) lokal analjezi kremi ve göz merhemi ile birlikte kullanın (Malzeme Tablosuna bakınız) ve vücut ısısını düzenlemek için hayvanı bir ısıtma yastığına yerleştirin. Hayvan tamamen uyuşturulduğunda, steril olmayan ayrı bir tıraş alanına taşıyın.Hayvanın yeterince ısıtıldığından emin olun; Örneğin, bir ısıtma yastığının üzerine yerleştirin. Kafatasının üstündeki tüyleri çıkarın. Bunu elektrikli tıraş makinesi veya epilasyon kremi ile (Malzeme Tablosuna bakınız) veya etanol kaplı bir neşterle başın üst kısmını tekrar tekrar tıraş ederek yapın. Daha sonra açıkta kalan doku ile temas etmediklerinden emin olmak için gevşek tüyleri dikkatlice çıkarın. Tüyleri almak için, örneğin etanol ve/veya sıkma bilyeli pompa ile ıslatılmış dokular kullanın. Epilasyon kremi kullanıyorsanız, bunun pamuklu çubuklar ve tuzlu su ile iyice çıkarıldığından emin olun. Traş edilmiş alanı iyot bazlı bir dezenfektan (Malzeme Tablosuna bakınız) ve pamuklu çubuklar kullanarak alkolle birçok kez dezenfekte edin, kalan gevşek tüyleri kesi bölgesinden uzaklaştırmak için başın ortasından yanlara doğru hareket ettirin. Betadin kullanarak başın üzerindeki ve çevresindeki kürkü dezenfekte edin. Bu, steril bir çalışma alanı sağlar ve cerrahi aletlerin ve malzemelerin steril olmayan kürkle temas etmesini önler. Hayvanı kulak çubukları ve burun tutucu kullanarak stereotaktik bir çerçeveye yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakın). Küçük cerrahi makas kullanarak (Malzeme Tablosuna bakınız), kafatasının üstündeki deride badem şeklinde bir açıklık açın ve lambda sütürünün hemen arkasından gözlerin arasına kadar uzanın. Hala ıslakken keserek deri altı zarını ve periosteuumu çıkarın, ardından kafatasının yüzeyindeki diş çimentosunun yapışmasını engelleyebilecek yumuşak zar dokusunu çıkarmak için kafatasını bir neşter bıçağıyla çizin. İsteğe bağlı: Kafatası zar dokusundan arındırıldıktan sonra, kısa bir süreliğine %0,5’lik ince bir peroksit tabakası uygulayın ve astarın kafatasına yapışmasını iyileştirmek için kafatasının yüzeyini pürüzlendirmeden önce su bazlı iyot dezenfektanı (örneğin Betadin) ile yıkayın. Neşterin ucu ters çevrilmiş şekilde çapraz bir desen çizerek kafatasının yüzeyini dikkatlice pürüzlendirin. Bu, diş çimentosunun daha sonra kafatasına yapışmasına yardımcı olur.NOT: Dikişlerin üzerini çok kuvvetli bir şekilde kaşımayın çünkü bu, dikişlerin yırtılmasına ve kafa içi sıvının sızmasına neden olabilir, bu da diş çimentosunun yapışmasını bozar. Neşter bıçağı ve steril pamuk tomurcukları arasında, kaslar beyinciğin üstündeki kafatasının ‘kenarına’ geri itilene kadar lambda dikişinin yanlarına bağlı boyun kaslarını nazikçe kaşımak/itmek için geçiş yapın. Bu, nöronal kayıtlarda kas gürültüsünü en aza indirmeye yardımcı olur. 1 mL’lik bir şırıngayı 27 G’lik bir iğne ile doldurun (Malzeme Tablosuna bakınız) az miktarda cerrahi siyanoakrilat yapıştırıcı ile doldurun (Malzeme Tablosuna bakınız). Ardından, üzerine küçük süper yapıştırıcı damlaları sürmek için şırıngayı kullanarak cildi kafatasının kenarlarına yapıştırın. İmplantlar için yer bırakmak için dokuyu kafatasına mümkün olduğunca düz bir şekilde yapıştırın. Bu prosedür, cilt ve kasların implantın parçalarıyla doğrudan temas etmemesini sağlar, bu da kayıtlarda kas gürültüsünü önler ve diş çimentosunun yapışmasını iyileştirir. Ekstra yapışma için kafatası boyunca diş çimentosu astarı uygulayın ve UV ışığı ile sertleştirin (Malzeme Tablosuna bakınız). Bu, diş çimentosu yapışmasını iyileştirir ve kraniyal sütürlerin sızmasını ve zamanla kraniyal-çimento bağının zayıflamasını önler. Bregma veya lambdaya göre prob implantasyonu için hedef yeri bulun ve etrafındaki kraniyotomiyi cerrahi bir işaretleyici ile ana hatlarıyla belirtin. Kafa plakasını kafatasının üzerine, kraniyotomi içinde kalacak şekilde, kraniyotominin bir tarafında mikro sürücü ve 1-2 topraklama pimi için yer olacak şekilde yerleştirin. Kafa plakasını diş çimentosu kullanarak implante edin. Diş çimentosunu belirtilen soğutulmuş seramik tabakta karıştırın (bkz. adım 3.2). Kafa plakasının her taraftan kafatasına yapıştığından ve su geçirmez bir ‘kuyu’ oluşturduğundan emin olun. Bir diş matkabı (US 1/2 HP boyutunda), GND/REF olarak kullanılacak beyin alan(lar)ı üzerine adım 1.4’te hazırlanan başlık pimlerinin genişliğinde küçük bir çapak deliği açın. Faraday kafesinin topraklanması isteniyorsa, Faraday-GND başlık pimi için Faraday kafesinin kenarına yakın bir yerde küçük bir çapak deliği daha açın.NOT: GND/REF başlık pim(ler)i için, kraniyotomiyi kafesin kenarından yeterli bir mesafeye yerleştirin, böylece başlık piminin kendisi daha sonra Faraday kafesine dokunmadan içine yerleştirilebilir. Kraniotomiyi bir şırınga ile üzerine steril salin damlatarak ve dökülmeyen mendillerle çıkararak temizleyin (bkz. Malzeme Tablosu). Tüm kan ve gevşek doku çıkana kadar tekrarlayın. Tuzlu su içinde% 0.7’lik bir agar (Malzeme Tablosuna bakınız) çözeltisi hazırlayın, hafifçe soğutun ve 1 mL’lik bir şırınga üzerinde 27 G’lik bir iğne kullanarak kraniyotomiye sokun. Önceki adımda açılan her kraniyotomiye nazikçe bir GND pimi (bkz. adım 1.3) yerleştirin. Pim(ler) her taraftan agar ile çevrili olacaktır (bkz. adım 4.17). Başlık pimlerini sabitlemek ve elektriksel izolasyon sağlamak için etrafına çimento sürün. Seramik kalıbı temizleyin ve buzdolabına/dondurucuya geri koyun. Bir diş matkabı ile, sabit hareketlerle kenarda hareket ederek daha büyük bir kraniyotominin (dairesel veya kare) ana hatlarını delin. Kraniotominin 1 mm x 1 mm ila 2 mm x 2 mm arasında olduğundan emin olun, böylece korteksi çok fazla açığa çıkarmadan kan damarlarını önlemek için probun yerleşiminde küçük ayarlamalar yapılmasına izin verin. Mümkünse, dikişlerin üzerine kraniyotomi yerleştirmekten kaçının. 20-30 sn’lik turlar halinde delin ve delme turları arasında kafatasını tuzlu su ile soğutun.NOT: Delme işlemine başlarken, mikro sürücünün ön kenarını bir işaretleyici ile işaretlemek yararlıdır, böylece delme sırasında mikro sürücü ön kenarına paralel olarak düz bir kenar oluşturulabilmesini sağlamak yararlıdır. Bu, mikrosürücüyü yerine sabitlerken kraniyotomide çimentodan kaçınma şansını artırmanın yanı sıra yapışmayı iyileştirir, kraniyotomi üzerinde mikro sürücü çıkıntısını önler ve mikro sürücüyü son kayıt yeri konumuna göre yerleştirirken daha fazla yanal manevra kabiliyeti sağlar. Birkaç ilk delme turundan sonra, kemiğin delinmiş kısmının direncini, ince forsepslerle hafifçe iterek test edin (boyut 5 veya daha ince; bkz.Kemik itildiğinde forsepsin altında ‘sıçramaya’ başlayana kadar delme turları arasında test etmeye devam edin. Bu durumda, kemiği yumuşatmak için kraniyotominin üzerine bir damla salin ekleyin, ardından delinmiş kemik parçasını nazikçe çıkarmak için forsepsleri kullanın. Kemik nazikçe çıkarılamıyorsa, kemiğin hala daha güçlü bir şekilde bağlandığı noktalara odaklanarak başka bir delme turu yapın. Genel olarak, kafatasını tamamen delinmeden önce forsepsten hafif bir basınçla çıkarmayı hedefleyin, çünkü bu tipik olarak doku hasarını en aza indirir.NOT: Dura yüzeyinin hem sıcaklıkları azaltmak için delme sırasında hem de kemik flebinin çıkarılmasının ardından düzenli olarak nemlendirildiğinden emin olun. Bu, duranın kurumasını ve nüfuz etmesinin daha zor hale gelmesini önleyerek kolay prob yerleştirme şansını artırır. Duranın nüfuz edemeyecek kadar sert olduğu kanıtlanırsa veya künt veya çok uçlu problar kullanılıyorsa, duranın 27 G’lik bir iğne ile kaldırılması ve duranın beyin yüzeyine yapışmasını önlemek için tuzlu su daldırması altında küçük bir kesi yapılarak durotomi yapılır. Kraniotomiyi dura ve beyni korumak için serin, steril tuzlu suya batırılmış hemostatik bir süngerle ( Malzeme Tablosuna bakınız) örtün. 5. Cerrahi: Prob implantasyonu Özel mikro sürücü tutucuyu (Malzeme Tablosuna bakın) stereotaktik aparatın koluna takın. Mikro sürücü, prob hazırlığından sonra mikro sürücü tutucusundan çıkarıldıysa, takılı silikon prob ile mikro sürücüyü mikro sürücü tutucusuna yerleştirin. İstenen hedef beyin bölgesine ulaşmak için stereotax kolunu gerektiği gibi açın. Taç halkasını takılı olarak yerleştirin amplifier mikro sürücü tutucusunun arkasındaki üç dikey pimin üzerine (bkz. Ek Şekil 1). Mikro sürücüyü kraniyotominin ~0.5 mm yakınına kadar indirin, ardından proba bağlı GND/REF başlık pimlerini kafatasına implante edilen ilgili GND/REF pim(ler)ine bağlamak için forseps kullanın (bkz. adım 4.14-4.15). Sürücü, kraniyotomi ve GND/REF pin yerleştirme örnekleri için Ek Şekil 3 ve Ek Şekil 4’e bakın. Yerine oturduktan sonra, daha sağlam bir bağlantı için isteğe bağlı olarak pim(ler)i bir damla iletken gümüş epoksi ( Malzeme Tablosuna bakın) ile sabitleyin. Gümüş epoksi sertleştikten sonra, bağlantının uzun süre sabit kalmasını ve çevredeki dokular ve/veya implant elemanları ile elektriksel bağlantı olmamasını sağlamak için bağlı pimleri az miktarda diş çimentosu ile kaplayın ( Malzeme Tablosuna bakınız). Hemostatik süngeri kraniotomiden çıkarın (bkz. adım 4.22). Stereotaktik kolu mikro sürücü ile kraniotominin üzerine yerleştirin.NOT: Prob geri çekilirse, mikrosürücünün, probun kraniyotominin büyük kan damarları içermeyen bir kısmına değecek şekilde yerleştirildiğinden emin olun. Gerekirse, prob şaftı hedef alandaki dura veya beyin yüzeyine temas edene kadar konumu ve açıyı ayarlayarak mikro sürücüyü indirin (bkz. adım 4.21). Diş çimentosunu belirtilen seramik tabakta karıştırın (bkz. adım 3.2) ve mikro sürücü tabanının elektroda bakmayan üç tarafına odaklanarak mikro sürücünün tabanını yerine yapıştırın. Çimentonun çıkarılabilir ‘taban’ üzerindeki mikro sürücüye temas etmediğinden emin olun (bkz. Şekil 1D).Taban ile kafatası arasındaki herhangi bir boşluğun tamamen diş çimentosu ile kaplandığından emin olun. Seramik kalıbı temizleyin ve buzdolabına/dondurucuya geri koyun. Çimentonun kürlenmesini bekleyin, yaklaşık 10-15 dakika.NOT: Mikro sürücü tabanı ile kafatası arasında küçük bir boşluk bırakılır ve çimento, onu doldurmak için en akışkan haliyle kullanılır. Çimento hafifçe kalınlaştıktan sonra, mikro sürücü tabanının duvarları ile kafatası arasındaki çimento inşa edilir. Maddenin akışı tahmin edilemez olabileceğinden ve daha büyük hacimler istenmeyen bölgelere akabileceğinden, her zaman çok küçük miktarlarda çimento kullanılır. Kraniotominin bazı kısımlarını kaplamak için tuzlu suya batırılmış az miktarda hemostatik sünger kullanılabilir. Çimento yanlışlıkla kraniyotomi üzerine akarsa, film benzeri bir kıvama girdiğinde çimentoyu forseps ile çıkarın. Silikon probu beynin üzerine indirin, prob pozisyonunu mikroskopla dikkatlice izleyin. Prob sapları beyne temas ettiğinde, probun dura/kortikal yüzeyin direncini kırmasını sağlamak için probu hızlı bir şekilde ~ 250 μm (vidanın bir tam dönüşü 282 μm’dir) indirin.Bunu görsel olarak doğrulayın. Prob kortekse girmediyse, 5 dakika bekleyin, ardından dura/korteks prob ucundan gerilim altındayken probu birkaç on mikrometre tekrar tekrar kaldırıp indirerek şaft ucuyla dura’yı aşındırmaya çalışın. Prob korteksin yüzeyini kırdıktan sonra, hedef koordinatlara ulaşılana veya prob 1000 μm’den fazla hareket edene kadar daha yavaş bir hızda (100-200 μm / dak) kademeli olarak indirin. Hedef, probun 1000 μm’den fazla hareket etmesini gerektiriyorsa, hedef koordinatlara ulaşılana kadar probu sonraki kayıt oturumları boyunca maksimum 1000 μm/oturumluk adımlarla ilerletin.NOT: Silikon probu indirirken nöronal sinyallerin izlenmesi tercih ediliyorsa bu adımı atlayın. Bunun için adımlar bölüm 7’de açıklanmıştır. Silikon elastomeri talimatlara göre hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız) ve 1 mL’lik bir şırınga kullanarak kraniyotomiye küçük bir damla damlatın (Malzeme Tablosuna bakınız). Kuruduktan sonra silikon elastomeri 50/50 kemik mumu ve mineral yağ karışımı ile kaplayın. Bu adım, probu daha da korur ve kraniyotomi üzerinde kalıntı ve kuru plazma birikimini önleyerek ekstraksiyonu daha basit ve daha güvenli hale getirir. Prob indirilirken etrafından dolaşmak kırılmaya neden olabileceğinden dikkatli olun. 6. Cerrahi: Faraday kafesinin implantasyonu Diş çimentosu tamamen katılaştığında, sürücüyü bir Alyan anahtarıyla sabitleyen yanal vidayı gevşeterek mikro sürücü tutucusunu gevşetin (bkz. Ek Şekil 1). Mikro sürücünün serbest durması için tutucuyu nazikçe ~1 cm geri çekin, ancak prob amplifikatörü/konektörü esnek kabloyu germeden implant tutucuya sabit kalır. Önceden yapılmış taç ve Faraday ağını, kafesi açıklıkta gererek ve mikro sürücü ve Flex kablosunun üzerine yatay olarak yerleştirerek kafa plakasının etrafına yerleştirin, ardından diş çimentosu ile kafa plakasına sabitleyin.NOT: İmplantı kontaminasyondan korumak için Faraday kafesi ile kafatası arasındaki tüm boşlukları diş çimentosu ile kapattığınızdan emin olun. Prob konektörü/başlığı ile Faraday taç halkasını ( Malzeme Tablosuna bakın) taç üzerine yerleştirin, prob için entegre tutucuyu hizalayın ampyükseltici/konektör Faraday tacı üzerinde girintili bir ‘X’ ile işaretlenmiş alanla hizalayın (bkz. adım 2.13). Halkayı, her bir jant teli halkası bağlantısında küçük bir damla siyanoakrilat yapıştırıcı veya diş çimentosu ile Faraday kafesine sabitleyin. Entegre problu Faraday halkası ampkaldırıcı/konektör yerine sabitlendikten sonra, mikrosürücü tutucusu ile stereotaktik kolu tamamen geri çekin. Bu bileşenlerin montajıyla ilgili adım adım kılavuz için Ek Şekil 3’e bakın. 7. Ameliyat sonrası test kaydı Probu bağlayın amplifier/konektörü kayıt donanımına bağlayın ve bir kayıt başlatın. İlk yerleştirme sırasında prob henüz hedef konumuna ulaşmadıysa (bkz. adım 5.9), nöronal sinyalleri izlerken probu indirmek için mikro sürücü vidasını yavaşça saat yönünün tersine çevirin.NOT: Sinyaller a) elektrotlar kraniyotominin üzerindeki silikon elastomer tabakasına temas ettiğinde ve b) elektrotlar beyne doğru hareket etmeye başladığında değişmelidir (bkz. adım 7.2). Yüksek frekanslı nöronal aktivite, beyne tam olarak yerleştirilen elektrotlar tarafından kaydedilirken, beyin yüzeyindeki BOS ile temas halinde olan elektrotlar tipik olarak, ani aktivite olmadan (EEG izine benzer) düşük geçişli filtrelenmiş bir nöronal popülasyon sinyali gösterecektir ve havadaki kayıt alanları artan elektriksel gürültüyü kaydedecektir. Test kaydından sonra tek tek kanalların empedansını ölçerek prob yerleştirme derinliğini ek olarak doğrulamak mümkündür. Hava ile temas eden kanallar, BOS’a temas eden veya zaten beyinde bulunan kanallar için yüksek empedans (açık devre olduğunu gösterir) ve ameliyattan önce ölçülenler gibi empedanslar göstermelidir. Silikon probu seans başına yaklaşık 1000 μm’lik maksimum toplam mesafe ve maksimum hız yaklaşık 75 μm/dak ilerletin (bkz. adım 5.5). Prob boyunca nöral yerel alan potansiyelleri göründüğünde ve/veya prob maksimum 1000 μm ilerletildiğinde, test kaydını sonlandırın ve kafa aşaması konektörünün bağlantısını kesin. 8. Kurtarma Faraday kafesini kendinden yapışkanlı veteriner sargısı ile örtün (bkz. Malzeme Tablosu). Anesteziyi sonlandırın ve onaylanmış deneysel yönergeleri izleyerek hayvanın birkaç gün iyileşmesine izin verin. Silikon prob üzerindeki elektrotlar henüz istenen hedef konumda değilse, mikro sürücünün vidasını seans başına maksimum dört tam tur (veya ~1000 μm) olacak şekilde küçük adımlarla çevirin. Gerekirse, hedefe ulaşılana kadar bu prosedürü birkaç gün boyunca tekrarlayın. Enine alanlardaki elektrofizyolojik aktiviteyi değerlendirmek için prob hareketinin eşzamanlı kayıtlarla birleştirilmesi önerilir. 9. Davranışsal deneyler ve kronik kayıtlar Görev performansı sırasında kronik kafaya sabitlenmiş kayıtlar için, Faraday kafesinin tabanındaki kafa plakasını, kelepçeyi manuel olarak açarak ve implante edilmiş kafa plakasını sıkıştırarak kafa sabitleme kelepçesine takın (bkz. Şekil 1C, E, F).NOT: Kafa fiksasyonu gerekmiyorsa, bu implant sistemi serbestçe hareket eden kayıtlar için de kullanılabilir. Serbestçe hareket eden kayıtlar için 9.1 ve 9.7 adımlarını atlayın. Kendine yapışan veteriner sargısını implanttan çıkarın.NOT: Hayvan için rahatsızlığı en aza indirmek için, deneyci implantla çalışırken dikkat dağıtıcı olarak bu adımdan önce basit, ödüllendirici bir davranışsal görevin başlatılması önerilir. Amplifikatörü/konektörü kayıt ekipmanına takın. Hayvan görevi yerine getirirken nöronal kayıtlar yapın.NOT: Amaç, kaydedilen hücre dışı birimlerin sayısını en üst düzeye çıkarmaksa, bir konumdaki nöral verim azaldığında mekiği birkaç on mikrometre hareket ettirin. Probu hareket ettirdikten sonra sinyalin stabilize olmasının dakikalar ila saatler sürebileceğini unutmayın. Bu nedenle, sinyalin bir sonraki oturumun başlangıcına kadar toparlanabilmesi için bir oturumun sonunda probu hareket ettirmek faydalı olabilir. Kayıt ekipmanının bağlantısını kesin ve davranışsal kaydın sonunda implantı yeni bir veteriner sargısı ile örtün. Hayvanı kafa sabitlemesinden ayırmak için kafa sabitleme kelepçesini açın. 10. Prob kurtarma Son kaydın sonunda, vidayı saat yönünde çevirerek silikon probu mümkün olduğunca mikro sürücünün üzerine geri çekin. Bunu, hayvan kafası sabitken ve davranırken veya cerrahi düzenekte uyuşturulmuş hayvan ile yapın. Nöronal sinyalleri eş zamanlı olarak izleyerek ve beyne daldırılmış, beyin yüzeyine dokunan veya hava ile temas halinde olan elektrotların imzasını kontrol ederek probun beyinden çıkışını çizin (bkz. adım 7.3).NOT: Histoloji protokolüne ve proba bağlı olarak, prob üzerindeki bazı elektrotların tam yerini belirlemek için prob geri çekilmeden önce elektrolitik lezyonlar gerçekleştirilir. Prob çıkışının nöronal kayıt yoluyla izlenmesi gerekli değilse, hayvan sonlandırıldıktan sonra probun geri çekilmesi de mümkündür. Onaylanmış yönergeleri izleyerek hayvanı sonlandırın (bu, sonraki histoloji için beynin sabitlenmesi planlanıyorsa hayvanın perfüze edilmesini içerir). Hayvan öldükten sonra ~ 10 dakika bekleyin. Ardından, probun kırılmasını önlemek için hayvanın kafasının eksplant sırasında hareket edemediğinden emin olarak, hayvanın kafasını stereotax’a sabitleyin. Kraniotominin üzerine bir damla salin uygulayın ve prob sapındaki kurumuş biyolojik dokuyu yumuşatmak ve sapın kırılma olasılığını azaltmak için birkaç dakika bekletin. Stereotaktik tutucuyu mikro sürücünün yaklaşık 0.5 cm yukarısına yerleştirin. Ardından, Faraday kafesinin parmaklıklarının üst ucunu küçük cerrahi makasla kesin (Malzeme Tablosuna bakınız), Faraday halkasını serbest bırakmak için amplifikatörü/konektörü serbest bırakın ve halkayı stereotaktik tutucunun üst kısmındaki dikey pimlere geri aktarın (bkz. adım 5.1 ve Ek Şekil 1). Faraday tacının parmaklıkları arasındaki u şeklindeki ağ alanlarını keserek bakır ağı aynı cerrahi makasla dikkatlice kesin. Ardından, tepenin tabanındaki plastik telleri kesin.NOT: Basılı plastik jant tellerini kesilirken bükmekten kaçının, çünkü bunlar kopabilir ve plastik kalıntıları proba doğru uçurabilir. Mikro sürücü, tutucunun yan vidası kullanılarak tutucuya sabitlenene kadar stereotaktik tutucuyu indirin, mikro sürücüyü sabitleyin, ardından mikro sürücü gövdesini mikro sürücü tabanına bağlayan T1 vidasını gevşetin. Mikro sürücüyü tabanından kaldırmak için stereotaktik kolu implant tutucu ile yavaşça geri çekin. Mikro sürücünün tabandan dik bir açıyla (yani tabandan ‘dikey’) ayrıldığından emin olun.NOT: Mikro sürücü gövdesi ve tabanı kolayca ayrılmıyorsa, stereotaktik kolun hareketinin mikro sürücü yönüne kıyasla bir açıda olmadığını doğrulayın. Gerekirse, tutucu ve mikro sürücü, hayvanın kafasının sabitlenmesini hafifçe gevşeterek ve buna göre yeniden konumlandırarak birbirine yeniden hizalanır. Doğru hizalama, mikro sürücünün kolay kurtarılması için en önemli hususlardan biridir. Ayrıca, mikro sürücü ile mikro sürücü tabanını birbirine bağlayan herhangi bir diş çimentosu kalıntısı olup olmadığını kontrol edin (bkz. adım 5.5). Eğer öyleyse, kullanılan çimento miktarına bağlı olarak çimento bir neşter ve/veya diş matkabı ile dikkatlice kazınır. Altında yeterli boşluk oluşturmak için stereotaktik kolu takılı prob ile kaldırın. Hayvanı stereotakstan çıkarın ve istenirse onaylanmış bir histoloji protokolünü izleyerek beyni hazırlayın. İmplante edilmiş mikro sürücü tabanını kurtarın ve daha sonra yeniden kullanmak üzere birkaç saat asetonda bekleterek temizleyin. Yapışkan macun üzerine temiz bir mikro sürücü tabanı yerleştirin ( Malzeme Tablosuna bakın), ardından mikro sürücüyü tabana indirin ve vidayı sıkın. Kırılmayı önlemek için, işlem boyunca prob konumunu mikroskop altında izleyin. İmplante edilen mikro sürücü tabanının önce yeniden kullanım için temizlenmesi gerekiyorsa, bu adım daha sonra tamamlanabilir.NOT: Bu protokol, taban için bir platform olarak yapışkan macunun kullanılmasını gerektirir, bu hem tabanı sabitlediği hem de bir dereceye kadar verme özelliğine sahip olduğu için hayati önem taşır ve tabanın kaymamasını ve prob ile çarpışmamasını sağlar. Macun, probun indirileceği mikro sürücü tabanının yan tarafında dikey bir ‘uçurum yüzü’ şeklinde şekillendirilmelidir. Bu, probun tabandan aşağı indirilmesi durumunda altındaki macunla temas etmemesini sağlar. Macun ‘kulesi’ ayrıca, mikro sürücü tabanının ötesine indirilirse, probun macunun yerleştirildiği masa yüzeyi ile temas etmeyeceği kadar uzun olmalıdır. Son olarak, kaymasını veya düşmesini önlemek için macunu yüzeye iyice sabitleyin. Mikro sürücüyü macun tarafından tutulan mikro sürücü tabanına indirirken, ilerlemeyi izlemek için mikroskoptan bir yan profil görünümü sağlayın, böylece prob indirilirken taban veya macun ile çarpışmaz. Üreticinin talimatlarına göre probu temizleyin ve sterilize edin. En yaygın olarak bulunan problar için, bunları 12 saat boyunca enzimatik bir temizleyicide ( Malzeme Tablosuna bakınız) bekletin, ardından demineralize suda durulayın ve alkolde sterilize edin. Bunu, probu stereotaktik kolundaki mikro sürücü tutucusuna takılıyken enzimatik temizleyiciyi içeren büyük bir behere indirerek yapın.NOT: İstenirse, tek tek elektrotların potansiyel bozulmasını izlemek için temizledikten sonra prob üzerindeki elektrotların empedanslarını ölçün. Mikrosürücüyü temizlenmiş probla birlikte bir sonraki deneye kadar güvenli bir şekilde saklayın.

Representative Results

Bu protokol, araştırmacıların davranan farelerde hafif, uygun maliyetli ve güvenli kronik elektrofizyoloji kayıtları yapmalarını sağlayan bir kronik implantasyon sistemi sunmaktadır (Şekil 1). Bu yaklaşımın başarılı bir şekilde uygulanmasını belirleyen ana faktörler şunlardır: kafatasının tam çimento kaplaması, minimal invaziv ve uygun şekilde korunan bir kraniyotomi, mikrosürücünün güvenli bir şekilde bağlanması ve kafatasına kablolama ve koruyucu Faraday materyalinin tam sürekliliği. Bu noktalar hesaba katıldığında, yüksek kaliteli kayıtlara tutarlı bir şekilde ulaşılabilir. Burada, cerrahi başarının aşağıdaki ana yönleriyle ilgili temsili sonuçlar gösterilmektedir: 1) İmplant hayvan davranışına veya sağlığına müdahale ediyor mu?2) Sinyal kalitesi yüksek mi ve sinyaller uzun süre korunabilir mi?3) Kayıtlar görev performansı ile kolayca birleştirilebilir mi? İmplantın hayvan davranışı üzerindeki etkisini değerlendirmek için, implante edilmiş beş hayvanda izlenen hareket modellerini analiz ettik. Şekil 2A , implanttan 10 dakika önce ve implanttan 1 hafta sonra bir oyun kafesi içinde serbestçe hareket eden bir hayvan örneğini göstermektedir. Hareket kalıplarının değişmediği görülebilir. Bu gözlem, hayvanlar arasındaki hareket hızlarının ve kafa yönlerinin dağılımını gösteren Şekil 2B, C ile doğrulanmaktadır. Hem koşu hızı hem de kafa yönleri implantasyondan önce ve sonra büyük ölçüde değişmedi ve eğer bir şey varsa, ameliyattan sonra koşu hızları biraz yükselmiş gibi görünüyordu. Ek Video 1 , implantasyon ameliyatından 6 gün sonra bir hayvanın kısa bir video kaydını göstermektedir. Ev ortamında hareket, tımar, yetiştirme ve yiyecek arama gibi tipik ev kafesi davranışlarının tümü görülebilir ve genel sağlığın yanı sıra ameliyattan başarılı bir şekilde iyileşmeyi gösterir. İmplantın düşük davranışsal etkisi, büyük olasılıkla düşük ağırlığı ve yönetilebilir yüksekliğinden kaynaklanmaktadır. Şekil 2: Ameliyat öncesi ve sonrası hareket. (A) Bir hayvanın (sol panel) implantasyondan önce ve sonra (sağ panel) örnek hareketi. X/Y koordinatları santimetre cinsindendir, noktalar 10 dakikalık bir süre boyunca her zaman noktasında hayvanın konumunu gösterir. (B) 5 hayvanda implantasyondan önce 5 seans ve implantasyondan sonra 3 seans boyunca hareket hızlarının cm/s cinsinden dağılımı. (C) (B)’de analiz edilen aynı oturumlar için farklı yönlerde hareket olasılığı için çekirdek yoğunluğu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Daha sonra, Yerel Alan Potansiyeli’ndeki (LFP) sinyal kalitesi ve kayıt sahalarındaki ani artış etkinliği değerlendirilir. Burada, birincil görsel korteksteki (V1) kortikal kayıtlardan elde edilen temsili verileri gösteriyoruz. Doğrulama için, varsayılan tek birimli aktivite, Kilosort 3 kullanılarak uyanık bir farenin V1’inde kaydedilen geniş bant nöronal sinyallerden çıkarıldı (bkz. Şekil 3). Şekil 3A , prob şaftı üzerindeki ekstrakte edilen tek birimlerin konumunu gösterir, Şekil 3B , karşılık gelen spike dalga formlarını gösterir ve Şekil 3C , aynı nöronların bir akım kaynak yoğunluğu (CSD) protokolüne verdiği ani tepkileri gösterir. Bu paradigmada, geniş alan flaşları, 200 denemeden fazla 1 Hz frekansında (yani 300 ms açık, 700 ms kapalı) 300 ms’lik bir süre ile sunuldu. Son olarak, Şekil 3D , gri bir arka plan üzerinde rastgele seçilmiş siyah beyaz karelerden oluşan ve her biri 16,6 ms için sunulan 2000 kareden oluşan görsel alıcı bir alan haritalama protokolüne aynı birimlerin yanıtlarını göstermektedir. Karelerin her biri 12 derecelik görsel açıyı kapsıyordu ve 15 x 5 olası konumdan oluşan bir alandan seçildi, böylece haritalama paradigması toplamda -90 ila +90 derece azimut ve -30 ila +40 derece yükseklikte bir görsel alanı kapsıyordu. Her bir uyaran çerçevesine verilen ateşleme hızı yanıtları, her penceredeki maksimum aktiviteye dayalı olarak kanal başına optimal olarak tanımlanan, 40-140 ms arasında bir gecikmeye tabi olan 16,6 ms’lik bir pencere boyunca maksimum ateşleme hızı analiz edilerek çıkarıldı. Bu kayıt türü, her bir elektrotun yerleştirme derinliğinin ayarlanmasına rehberlik etmek ve implant ameliyatından sonra sinyal kalitesini değerlendirmek için kullanılabilir. Şekil 3: Kaydedilen nöronal sinyaller. (A) Probun elektrot kontakları boyunca Kilosort 3 spike sıralama paketi ile sıralanan tek birimlerin çıkarımsal konumu. (B) 5 ms zaman boyunca A’da gösterilen aynı birimler için ani dalga biçimleri. İnce çizgiler: Bireysel sivri dalga biçimleri. Kalın çizgiler: Ortalama spike dalga biçimi. (C) 300 ms geniş alan yanıp sönmeleri ve ardından 700 ms siyah ekran sunan mevcut kaynak yoğunluğu (CSD) paradigmasına yanıt olarak ani artışların raster grafiği. Yanıtlar, A ve B’deki ile aynı birimler için gösterilir. Üst üste binen renkli çizgiler, aynı yanıtların peri-uyaran zaman histogramlarını (PSTH’ler) temsil eder. PSTH’ler için ateşleme hızları 10 ms’lik kutularda hesaplandı ve daha sonra tüm PSTH’deki maksimum ateşleme hızı ile normalleştirildi. Zaman 0, geniş alan flaş uyaranı etrafında ortalanır. (D) Seyrek Gürültü Alıcı Alan Haritalama paradigması ile ölçülen, AC ile aynı birimlerin tahmini alıcı alanları. Her çizim, beyaz ve siyah kare uyaranların başlangıcına (sol panel) veya ofsetine (sağ panel) yanıt olarak 16,6 ms’lik bir analiz penceresi üzerinden ortalama ateşleme hızı aktivitesini gösterir. Uyaranlar, yatay olarak 180 derecelik görüş açısını ve dikey olarak 70 derecelik görüş açısını kapsayan 5 x 15 kare ızgara boyunca rastgele yerleştirilmiş 16.6 ms süreyle sunuldu. Ateşleme hızı aktivitesi, tüm alıcı alan ızgarası boyunca z-skorlandı (renk çubuğuna bakın). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Kayıt kalitesi, haftalarca veya aylarca tekrarlanan kayıtlarda yüksek kaldı. Şekil 4A, 15 hafta boyunca bir hayvandan alınan uzunlamasına LFP kayıtlarını göstermektedir. LFP’ler, yukarıda açıklanan CSD paradigmasına yanıt olarak kaydedilmiştir (bkz. Şekil 3A-C). Şekil 4A, flaş başlangıcından 500 ms sonra ortalama LFP yanıtlarını göstermektedir. Bu örnekte, elektrotlar arası mesafesi 25 μm olan 32 kanallı doğrusal bir prob kullandık. 18. günde, prob derinliğinin ayarlandığını ve probun 600 μm aşağı kaydırıldığını unutmayın. Bu ayarlamadan önce ve sonra, LFP sinyalleri kayıt günleri boyunca sabit kaldı. Bununla tutarlı olarak, varsayılan tek birimlerin ani dalga biçimleri birçok kayıtta fark edilebilirdi. Şekil 4B , bir aylık kayıt boyunca üç kayıt oturumundan elde edilen temsili örnek ani yükselme dalga biçimlerini gösterir ve bu da tek birim etkinliğinin zaman içinde başarılı bir şekilde tanımlanabileceğini gösterir. Şekil 4C , 100 güne kadar bir pencereyi kapsayan, altı hayvanda kronik kayıtlardan çıkarılan varsayılan tek birimlerin toplam sayısını göstermektedir. Tek birimler, kilosort 3.0’ın varsayılan kriterlerine göre tanımlanmıştır (bakınız Ek Tablo 1). Görülebileceği gibi, açıkça tanımlanmış tek birimlerin sayısı tipik olarak implantasyondan sonraki ilk haftada ~ 40’a ulaştı ve daha sonra kademeli olarak düştü ve ~ 20 birimlik görünüşte stabil bir asimptota doğru hareket etti. Bu kayıtların doğrusal 32 kanallı problar kullanılarak gerçekleştirildiği göz önüne alındığında, bu, implantasyondan hemen sonra elektrot başına yaklaşık 1.25 tek birimlik beklenen bir verime eşittir ve uzun süreli kayıtlarda elektrot başına yaklaşık 0.65 tek birime düşer. Oturumlar boyunca implantın amplifikatörüne/konektörüne tekrarlanan bağlantının, amplifikatörü/konektörü tutan Faraday kronu, standart konektörlerin gerektirdiği maksimum eşleşme kuvvetlerinden bile daha büyük bir büyüklük sırası olan 10 Newton’un üzerinde tekrarlanan kuvvetlere dayanabildiğinden, kayıt kalitesini veya implant stabilitesini etkilemediği görülmüştür (bkz. Ek Video 2). Şekil 4: Nöronal kayıtların zaman içindeki kararlılığı. (A) İmplanttan 3-110 gün sonra kronik olarak implante edilmiş bir probun 32 kanalının tamamında gösterilen, geniş alan flaş CSD uyaranına yanıt olarak ortalama LFP aktivitesi. Kırmızı dikey çizgi, ameliyattan sonraki 18. güne kadar beynin dışından 0-8 arası kanal kaydı nedeniyle probun yeni bir konuma indirildiğini gösterir. (B) Aynı kronik implanttan alınan üç örnek birimin spike dalga formları, dört hafta boyunca tekrar tekrar kaydedildi. İnce çizgiler: Bireysel sivri dalga biçimleri. Kalın üst üste binen çizgi: Ortalama spike dalga biçimi. (C) Kilosort 3 tarafından 6 hayvan için kayıt günleri boyunca tespit edilen varsayılan tek birimlerin sayısı (ek açıklamaya bakınız). Kırmızı kare, sondanın taşındığı günleri gösterir. Noktalı çizgi, bu kayıtlarda kullanılan implant başına elektrot sayısını gösterir (32). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Son olarak, bir mikro sürücünün yanı sıra giyilebilir bir Faraday kafesi ve implant tabanı olarak ikiye katlanan bir kafa plakası ve kafa sabitleme için bir cihaz içeren modüler bir sistem sağlayarak, bu protokol kronik elektrofizyolojinin başa sabitleme davranışı ile entegrasyonunu sağlar. Burada, küresel bir koşu bandında sanal bir ortamdan geçen farelerden elde edilen örnek veriler gösterilmektedir. Şekil 5A , örnek bir denemede 20 birimin koşuyla ilgili ani yükselme aktivitesini göstermektedir. Şekil 5B , tek tek sivri uçlu sıralanmış birimlerin koşu hızı ve sivri uçlu aktivitesi arasındaki çeşitli ancak sağlam ilişkilerin yanı sıra Şekil 5C’de aynı etki için bir popülasyon ortalamasını göstermekte ve lokomotor aktivitenin kemirgen V124’teki nöronal aktivite üzerindeki iyi bilinen etkisini doğrulamaktadır. Şekil 5: Başa sabitlenmiş davranış sırasında nöronal tepkiler. (A) Örnek bir deneme boyunca tek birim yanıtlarının raster grafiği, çalışma hızı (mor çizgi) ve tüm tek birimlerde (açık mavi çizgi) ortalama ateşleme oranları üst üste bindirilmiştir. (B) Altı örnek birim için gösterilen, farklı çalışma hızı kategorileri sırasında tek birim etkinliği. (C) Tek bir örnek oturumda tüm tek birimlerdeki ortalama ani artış etkinliği, koşu hızı dağılımının beş beşte birlik dilimi boyunca çizilir. Bu seansta koşu hızları 0 ila 0,88 metre/saniye arasında değişiyordu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Ek Tablo 1: Şekil 3, Şekil 4 ve Şekil 5’te gösterilen kayıtlarda tek birimleri tanımlarken Kilosort 3 tarafından kullanılan varsayılan parametreleri gösteren tablo. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın. Ek Video 1: İmplant sonrası hayvan lokomotor aktivitesini gösteren video. 5 günlük iyileşme aşaması tamamlandıktan sonra çekilen video, normal lokomotor davranışın yanı sıra implantın boyutuna ve ağırlığına adaptasyonu gösterir. Hayvan normalde çevresel zenginleştirme içeren bir oyun kafesini keşfederken görülebilir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın. Ek Video 2: Monte edilmiş Faraday tacına uygulanan kuvveti gösteren video. Faraday tacının dayandığı kuvvetler, 4 pinli polarize nano konektörler gibi standart konektörler için gereken bağlantı kuvvetinden yaklaşık bir kat daha büyüktür. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın. Ek Şekil 1: Sürücü tutucunun resimlerini gösteren şekil. Yazdırılabilir tasarım dosyaları ilgili Github deposunda (https://github.com/zero-noise-lab/dream-implant/) bulunabilir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın. Ek Şekil 2: Bakır ağ için şablon. Şablonu orijinal ölçekleme ile yazdırın ve bakır ağı kesmek için şablonu kullanın (adım 2.12). Baskının ölçeklemesini doğrulamak ve gerekirse ayarlamak için ölçek çubuğunu kullanın. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın. Ek Şekil 3: Ameliyat sırasında implantın montaj adımlarını gösteren fotoğraf serisi. Bu durumda iki mikro sürücü ve iki amplifikatör takılmıştır. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın. Ek Şekil 4: Sürücülerin, kraniyotomilerin (yeşil renkte) ve GND/REF pininin (kırmızı renkte) örnek yerleşimini içeren fare kafatası çizimi. Kortikal kayıtlara müdahale etme olasılığı düşük olan beyincikteki yerleştirme nedeniyle pim konumu önerilir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Bu el yazması, probların hızlı, güvenli ve standartlaştırılmış implantasyonu için bir protokol sunar ve bu da deneyin sonunda probun geri kazanılmasına ve yeniden kullanılmasına izin verir. Yaklaşım, modüler bir implant bileşenleri sistemini, özellikle tüm yaygın silikon problar ve kayıt sistemleriyle uyumlu bir mikro sürücüyü, kafaya sabitlenmiş davranışsal deneyler için kullanılabilecek bir kafa plakasını ve implantı korumak için giyilebilir bir Faraday kafesini kullanır. Bu takımyıldız, kullanıcıların implantlarını, süreç içinde implantın standardizasyonundan ödün vermek zorunda kalmadan, başa sabit ve serbest hareket eden davranış veya implant minyatürizasyonu (Faraday kafesi olmadan) ve artırılmış uzun vadeli sinyal sağlamlığı (Faraday kafesi ile) gibi farklı deneysel paradigmalara esnek bir şekilde uyarlamalarına olanak tanır.

Bu yaklaşım, kronik elektrofizyolojik kayıtları daha standart hale getirir (elle montaj gerektirmeyen prefabrike elemanlar aracılığıyla), daha az maliyetli (prob geri kazanımı yoluyla), daha az zaman alıcı (cerrahi adımları basitleştirerek) ve hayvan refahı ve davranışı ile daha kolay uyumlu hale getirir (azaltılmış implant boyutu ve stressiz kafa fiksasyonu yoluyla). Bu nedenle, bu protokol, kemirgenlerde elektrofizyolojik implantları, alanın en ileri noktasındaki öncü laboratuvarların ötesinde daha geniş bir araştırmacı yelpazesi için ulaşılabilir hale getirmeyi amaçlamaktadır.

Bu amaca ulaşmak için, burada sunulan protokol, mikrodrive implantlarının esneklik, modülerlik, implantasyon kolaylığı, stabilite, toplam maliyet, davranışla uyumluluk ve probun yeniden kullanılabilirliği gibi genellikle eşit derecede önemli birkaç yönü arasındaki dengeyi en aza indirir. Şu anda, mevcut yaklaşımlar genellikle bu yönlerden bazılarında mükemmeldir, ancak diğer özellikler için yüksek bir maliyete sahiptir. Örneğin, uzun süreler boyunca mutlak implant stabilitesi gerektiren kullanım durumları için en iyi implant yaklaşımı, probu doğrudan kafatasına25 yapıştırmak olabilir. Bununla birlikte, bu aynı zamanda probun yeniden kullanılmasını ve kötü kayıt kalitesi durumunda kayıt bölgelerinin yeniden konumlandırılmasını önler ve standart implant yerleştirme ile uyumlu değildir. Benzer şekilde, AMIE sürücüsü, probların geri kazanılabilir implantasyonu için hafif, düşük maliyetli bir çözüm sağlarken, tek problarla sınırlıdır ve hedef koordinatların17 yerleştirilmesiyle sınırlıdır. Spektrumun diğer ucunda, ticari olarak temin edilebilen bazı nano sürücüler (bkz. Tablo 1 16,17,21,26,27,28,29,30) son derece küçüktür, kafatasına serbestçe yerleştirilebilir ve tek bir hayvana implante edilebilecek prob sayısını en üst düzeye çıkarabilir16. Bununla birlikte, diğer çözümlere kıyasla pahalıdırlar, deneycilerin başarılı implant ameliyatları için çok yetenekli olmalarını gerektirir ve probun yeniden kullanılmasını yasaklar. Vöröslakos ve ark.21 tarafından geliştirilen ve hafif bir versiyonu da bu protokolün bir parçası olan mikrosürücü, daha iyi kullanım kolaylığı, daha düşük fiyat ve probun yeniden kullanılabilirliği için küçük implant boyutundan ödün verir

Tablo 1: Kemirgenlerde kronik prob implantları için popüler stratejilerin karşılaştırılması. Kullanılabilirlik: mikro sürücünün açık kaynak olup olmadığı (araştırmacıların kendilerinin oluşturması için), ticari olarak mevcut olup olmadığı veya her ikisi de olup olmadığı. Modülerlik: Entegre sistemler, birbiriyle sabit bir ilişki içinde olan bir veya birkaç bileşenden oluşurken, modüler sistemler, implantın üretilmesinden sonra (örneğin, ameliyat sırasında) probun / mikro sürücünün korumaya (kafa dişlisi / Faraday kafesi) göre serbest yerleştirilmesine izin verir. Modülerlik, listelenen implantların yayınlanmış bilgilerinden veya implantasyon protokollerinden belirlendi. Headfix: Evet: İmplantın tasarımına entegre edilmiş kafa sabitleme mekanizmaları vardır, X: İmplant, büyük sorunlar olmadan sabitleme için ekstra bir kafa plakası eklemek için boşluk bırakır, Hayır: İmplantın tasarımı muhtemelen alan sorunları yaratır veya kafa sabitleme ile kullanım için önemli tasarım değişiklikleri gerektirir. Prob yerleşimi: Sınırlı: İmplant tasarımı aşamasında prob yeri sınırlıdır. Esnek: Prob yeri ameliyat sırasında bile ayarlanabilir. Prob sayısı: implante edilebilecek prob sayısı. Bir fareye >2 prob implante etmenin, seçilen implant sisteminden bağımsız olarak önemli bir zorluk teşkil ettiğini unutmayın. Probun yeniden kullanılabilirliği: evet, eğer problar teorik olarak yeniden kullanılabilirse. Ağırlık / boyut: implantın ağırlığı ve hacmi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Bu farklı gereksinimleri daha sorunsuz bir şekilde uzlaştıran bir sistem oluşturmak için DREAM implantı, Vöröslakos implant21 temel alınarak tasarlanmıştır, ancak birkaç temel modifikasyon yapılmıştır. İlk olarak, toplam implant ağırlığını azaltmak için, burada kullanılan mikro sürücü, 3D baskılı paslanmaz çelik yerine işlenmiş alüminyumdan üretilir ve Faraday tacı minyatürleştirilir ve başlık plakası malzemesinin seçimine bağlı olarak 1,2-1,4 g’lık bir toplam ağırlık azalması sağlanır (bkz. Tablo 2). İkinci olarak, mikro sürücüyü çevreleyen kafa plakası, Faraday kafesi için bir taban olarak ikiye katlanırken hızlı ve stressiz kafa fiksasyonu sağlayan entegre bir kafa sabitleme mekanizmasına izin verecek şekilde tasarlanmıştır, nöronal kayıtlar için potansiyel hedef alanların çoğuna erişim sağlar ve implanta yalnızca minimum ağırlık ekler. Fiksasyon mekanizmasının düz şekli ve çıkıntıların olmaması, hayvanların görme alanında veya hareketinde minimum bozulma sağlar (bkz. Şekil 2A-C), önceki sistemlere göre belirgin bir gelişme31,32. Başlık plakasına sabitlenen Faraday tacı ve yüzüğü de önceki tasarımlara göre önemli ölçüde değiştirildi. Artık ameliyat boyunca herhangi bir geçici adaptasyon (örneğin, konektör yerleştirme açısından) veya lehimleme gerektirmezler, bu da implant hasarının potansiyel nedenlerini ve implant kalitesindeki öngörülemeyen varyansı ortadan kaldırır. Bunun yerine, DREAM implantı, her bir konektörün önceden tanımlanmış dört pozisyondan birine yerleştirilmesine izin vererek, ameliyat sırasında değişkenliği ve çabayı en aza indiren birden fazla standartlaştırılmış taç halkası varyasyonu sağlar. Son olarak, implant sistemini prob geri kazanımı için optimize eden DREAM implantı, mikrosürücü ve prob tipik olarak geri kazanılabildiği, temizlenebildiği ve birlikte yeniden kullanılabildiği için deneycilerin implant başına maliyeti ve hazırlık süresini önemli ölçüde azaltmasına olanak tanır.

Farklı implant sistemlerinin ortaya çıkardığı ödünleşimlere daha ayrıntılı bir genel bakış için, Tablo 1’e bakınız. Burada sunulan yaklaşım, örneğin boyut, kararlılık veya maliyet açısından diğer tüm stratejilerle karşılaştırıldığında genellikle maksimum performans sağlamasa da, tüm bu parametreler arasında üst aralıkta çalışır ve bu da onu çok çeşitli deneylere daha kolay uygulanabilir hale getirir.

Protokolün üç yönü, her bir özel kullanım durumuna uyum sağlamak için özellikle önemlidir: Zemin ve referans takımyıldızı, mikro sürücüyü çimentolama tekniği ve nöronal kayıt yoluyla implant doğrulaması. İlk olarak, topraklama ve referans pimlerini implante ederken amaç, mekanik/elektriksel stabilite ve invazivlik arasındaki tatlı noktayı belirlemekti. Örneğin, agar içine gömülü yüzen gümüş teller kemik vidalarından33 daha az invaziv olsa da, zamanla yerinden çıkmaya daha yatkındırlar. Agar ile birleştirilmiş pimlerin kullanılması, sağlam bir elektrik bağlantısı sağlarken, aynı zamanda doku travmasını önleyerek yerleştirme sırasında daha kolay kontrol edilme avantajına sahiptir. Kafatasına yapıştırılan topraklama pimlerinin yerinden çıkması olası değildir ve telin pimden ayrılması durumunda, implante edilen pimin daha geniş yüzey alanı ve stabilitesi nedeniyle yeniden takma genellikle basittir.

Tablo 2: Vöröslakos ve ark.21 tarafından tarif edilen DREAM implantı ile implant arasındaki bileşen ağırlıklarının karşılaştırılması. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

İkincisi, mikrosürücünün çimentolanması genellikle probun beyne yerleştirilmesinden önce gerçekleşmelidir. Bu, yerleştirme sırasında mikro sürücü stereotaktik tutucuya mükemmel bir şekilde sabitlenmezse, probun beyin içindeki yanal hareketini önler. Mikrosürücüyü yerine yapıştırmadan önce probun yerleşimini kontrol etmek için, mikroskobun paralaks kayması göz önüne alındığında dokunma konumunu tahmin etmek zor olabileceğinden, beyinle nereye temas edeceğini belirlemek için prob şaftının ucunu kısaca indirebilirsiniz. Mikro sürücü konumu belirlendikten sonra, çimentonun yanlışlıkla kraniyotomi ile temas etmemesini sağlamak için mikro sürücüyü çimentolandırmadan önce isteğe bağlı olarak kraniyotomiyi silikon elastomer ile koruyabiliriz; Bununla birlikte, silikon elastomer kalıntısı beyne çekilebileceğinden ve iltihaplanma ve gliyozise neden olabileceğinden, probun silikon elastomerden indirilmesi önerilmez.

Üçüncüsü, kullanılan deneysel protokole bağlı olarak, ameliyattan hemen sonra bir test kaydı yararlı olabilir veya olmayabilir. Büyük ölçüde, prob yerleştirildikten hemen sonra kaydedilen nöronal aktivite, geçici beyin şişmesi ve prob etrafındaki doku hareketi gibi faktörler nedeniyle kronik olarak kaydedilen aktiviteyi doğrudan temsil etmeyecektir, bu da hem yerleştirme derinliğinin hem de spike dalga formlarının doğrudan stabilize olma olasılığının düşük olduğu anlamına gelir. Bu nedenle, anlık kayıtlar esas olarak genel sinyal kalitesini ve implant bütünlüğünü belirlemeye hizmet edebilir. Hareketli mikro sürücülü kızağın, beyin pozisyona ince ayar yapmak için stabilize olduktan sonra ameliyattan sonraki günlerde kullanılması önerilir. Bu aynı zamanda probun günde 1000 μm’den fazla hareket etmesini önlemeye yardımcı olur, kayıt alanına verilen zararı en aza indirir ve böylece kayıt alanının ömrünü uzatır.

Son olarak, kullanıcılar sistemi birden fazla hedef konumdan kayıt yapacak şekilde uyarlamak isteyebilirler. Bu sistem modüler olduğundan, kullanıcının bileşenlerin birbirine göre nasıl monte edileceği ve yerleştirileceği konusunda çok fazla hareket alanı vardır (bkz. yukarıdaki ve Ek Şekil 3 ve Ek Şekil 4). Bu, yatay olarak uzatılmış bir mekiğin mikro sürücüye monte edilmesine izin verecek, birden fazla probun veya büyük çok uçlu probun implante edilmesine ve ayrıca birden fazla ayrı mikro sürücünün implantasyonuna izin verecek modifikasyonları içerir (bkz. Ek Şekil 3 ve Ek Şekil 4). Bu tür modifikasyonlar, yalnızca konektörler/arayüz kartları/başlıklar için artan sayıda montaj bölgesi ile uyarlanmış bir taç halkasının kullanılmasını gerektirir.tages. Bununla birlikte, bu tasarımın alan sınırlamaları, hayvan modeli, bu durumda, fare tarafından belirlenir, bu da birden fazla probu tek bir mikro sürücüye istiflemeyi, birkaç mikro sürücüyü birbirinden bağımsız olarak implante etmekten daha ayak izi açısından daha çekici hale getirir. Burada kullanılan mikro sürücüler, yığılmış probları destekleyebilir ve bu nedenle, tek gerçek sınırlama, hayvan modeli tarafından tanımlanan alan ve ağırlık kısıtlamalarına uyabilecek baş aşamalarının veya konektörlerin sayısıdır. Ara parçalar, dikey olmayan montaj ve yerleştirme yollarını daha da artırmak için de kullanılabilir.

Sonuç olarak, bu protokol, prob kurtarmaya öncelik veren bir mikro sürücü tasarımının ek avantajıyla birlikte, bir probun ucuz, hafif ve daha da önemlisi ayarlanabilir implantasyonuna izin verir. Bu, tek kullanımlık probların engelleyici maliyeti, cerrahi ve implantasyon becerilerinin yüksek bariyeri ve kronik implantasyon için ticari çözümlerin benzersiz kullanım durumlarına uyarlanmasının genellikle zor olduğu gerçeğinin sorunlarını ele alır. Bu sorunlar, halihazırda akut elektrofizyoloji kullanan laboratuvarlar için bir acı noktası ve henüz elektrofizyoloji deneyleri yapmayanlar için caydırıcı bir unsur oluşturmaktadır. Bu sistem, bu sınırlamaların ötesinde kronik elektrofizyoloji araştırmalarının daha geniş bir şekilde benimsenmesini kolaylaştırmayı amaçlamaktadır.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Hollanda Araştırma Konseyi (NWO; Crossover Programı 17619 “INTENSE”, TS) ve Avrupa Birliği’nin Yedinci Çerçeve Programından (FP7/2007-2013) 600925 No’lu hibe sözleşmesi kapsamında (Neuroseeker, TS, FB, PT) ve Max Planck Topluluğu’ndan fon almıştır.

Materials

0.05" Solder Tail Socket Mill-Max 853-93-100-10-001000
1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’- Reagent tetramethylindocarbocyanine perchlorate (’DiI’; DiIC18(3)) ThermoFisher D282 Lipophilic dye used for easier histological verification of the probe location
Adhesive Putty (Blu-Tack) Bostik 308590110 Variations (e.g. by Pritt) should be available in your stationary store
Agar Sigma Aldrich A1296 Make with saline for conductivity.
Amplifier (Miniamp-64) Cambridge Neurotech Miniature and implantable amplifier and digitiser. Alternative Implantable digitiser, or implantable Omnetics connector use possible.
Analgesic Cream (EMLA Cream) Aspen 39699/0088 Analgesic cream used for operative pain containing prilocaine, lidocaine.
Angled Spacer 3DNeuro Angled spacer for non-perpendicular drive mounting.. Open souce, also available at https://github.com/zero-noise-lab/dream-implant/
Blue light curing LED B.A. International 818223 Curing light for primer polymerisation. 420-480 nm wavelength
Bone wax SMI Z046 Wax to protect craniotomy and probe post surgery.
Copper mesh Dexmet 3CU6-050FA Copper mesh used to electrically and physically shield probe and craniotomy.
Cyanoacrylate glue (Loctite) Loctite 1363589 Cyanoacrylate gel glue
Dental Cement (SuperBond C&B) Sun Medical K058E Dental cement (SuperBond)
Depilation  Cream (Veet) Veet 310000091434 Hair removal cream for removal of hair around surgical site.
Faraday crown 3DNeuro 3D printed implantable protective cage. Open souce, also available at https://github.com/zero-noise-lab/dream-implant/
Faraday ring 3DNeuro 3D printed implantable protective ring for faraday cage. Open souce, also available at https://github.com/zero-noise-lab/dream-implant/
Haemostatic Sponge SMI ZHG101010 Absorbable gelatin haemostatic sponge 
Heat Shrink Tubing HellermannTyton TA32-9/3 BK Heat Shrink tubing for making soft tipped forceps
Iodine Braunol 9322507 Aqueous povidone-iodine solution.
Microdrive (R2Drive) 3DNeuro Recoverable Metal micro drive with moveable shuttle. Open souce, also available at https://buzsakilab.github.io/
3d_print_designs/
Mineral Oil Sigma-Aldrich M5310-100ML Oil used as solvent to create craniotomy protection gel.
Non-Shedding Wipes (Kimtech) Kimtech 7552 Non-shedding wipes
Primer Bisco B-7202P Universal skull adhesive preventing moisture from deteriorating the cement and providing a solid base to build up cement onto.
R2Drive holder 3DNeuro Stereotactic attachment for mounting R2Drive. Open souce, also available at https://buzsakilab.github.io/
3d_print_designs/
Self-adherent wrap  3M VB050 Protective wrap for implant post surgery
Silicon probe (H2) Cambridge Neurotech Chronically implantable linear silicon probe with 32 channels. Alternative Probe use possible.
Silicone Elastomer (Duragel) Cambridge Neurotech Silicone Elastomer
Silicone Plaster (Kwikcast)  WPI KWIK-CAST
Silver conductive epoxy MG Chemicals 8331D-14G Silver epoxy
Size 5 Dumont forceps FSTools 11251-10 Small forceps for lifting bone flap.
Stainless steel wire, Teflon coated Science Products GmBH SS-3T Ground wire
Stereotax (RWD) RWD 68803 Stereotax for surgical procedures on mice.
Tergazyme Alconox 1304 A possible enzymatic cleaner to clean probe
Two Part Fast setting Epoxy Resin Gorilla EP3 Epoxy for permanent bonding of DREAM implant parts.
Vannas Spring Scissors Round Handle FSTools 15403-08 0.075mm straight tipped spring rebound veterinary scissors.
Veterinary Cyanoacrylate glue (Vetbond) 3M 70-0068-5256-3 Veterinary cyanoacrylate glue
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Epsztein, J., Brecht, M., Lee, A. K. Intracellular determinants of hippocampal CA1 place and silent cell activity in a novel environment. Neuron. 70 (1), 109-120 (2011).
  2. Okun, M., et al. Diverse coupling of neurons to populations in sensory cortex. Nature. 521 (7553), 511-515 (2015).
  3. Jun, J. J., et al. Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity. Nature. 551 (7679), 232-236 (2017).
  4. Znamenskiy, P., Kim, M. -. H., Muir, D. R., Iacaruso, M. F., Hofer, S. B., Mrsic-Flogel, T. D. Functional specificity of recurrent inhibition in visual cortex. Neuron. 112 (6), 991-1000.e8 (2024).
  5. Rowland, J. M., et al. Propagation of activity through the cortical hierarchy and perception are determined by neural variability. Nat Neurosci. 26 (9), 1584-1594 (2023).
  6. Roth, M. M., Dahmen, J. C., Muir, D. R., Imhof, F., Martini, F. J., Hofer, S. B. Thalamic nuclei convey diverse contextual information to layer 1 of visual cortex. Nat Neurosci. 19 (2), 299-307 (2016).
  7. Zong, W., et al. Large-scale two-photon calcium imaging in freely moving mice. Cell. 185 (7), 1240-1256.e30 (2022).
  8. Demas, J., et al. High-speed, cortex-wide volumetric recording of neuroactivity at cellular resolution using light beads microscopy. Nat Methods. 18 (9), 1103-1111 (2021).
  9. Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents – EEG, ECoG, LFP and spikes. Nat Rev Neurosci. 13 (6), 407-420 (2012).
  10. Polikov, V. S., Tresco, P. A., Reichert, W. M. Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes. J Neurosci Methods. 148 (1), 1-18 (2005).
  11. Savya, S. P., et al. In vivo spatiotemporal dynamics of astrocyte reactivity following neural electrode implantation. Biomaterials. 289, 121784 (2022).
  12. Perge, J. A., et al. Intra-day signal instabilities affect decoding performance in an intracortical neural interface system. J Neural Eng. 10 (3), 036004 (2013).
  13. Pachitariu, M., Steinmetz, N., Kadir, S., Carandini, M., Harris, K. D. Kilosort: realtime spike-sorting for extracellular electrophysiology with hundreds of channels. bioRxiv. , (2016).
  14. Buzsáki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nat Neurosci. 7 (5), 446-451 (2004).
  15. Kloosterman, F., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: Drive fabrication. J Vis Exp. (26), e1094 (2009).
  16. Jacobs, T., Darch, H., Holtzman, T., De Zeeuw, C. I., Romano, V. Standard operating protocol: Implantation of Cambrige NeuroTech chronic silicon probe and mini-amp-64 digital headstage in mice. Protocol Exchange. , (2023).
  17. Juavinett, A. L., Bekheet, G., Churchland, A. K. An adaptable, reusable, and light implant for chronic Neuropixels probes. bioRxiv. , (2024).
  18. Kozai, T. D. Y., Jaquins-Gerstl, A. S., Vazquez, A. L., Michael, A. C., Cui, X. T. Brain tissue responses to neural implants impact signal sensitivity and intervention strategies. ACS Chem Neurosci. 6 (1), 48-67 (2015).
  19. Nguyen, D. P., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: tetrode assembly. J Vis Exp. (26), 1098 (2009).
  20. Biran, R., Martin, D. C., Tresco, P. A. Neuronal cell loss accompanies the brain tissue response to chronically implanted silicon microelectrode arrays. Exp Neurol. 195 (1), 115-126 (2005).
  21. Vöröslakos, M., Petersen, P. C., Vöröslakos, B., Buzsáki, G. Metal microdrive and head cap system for silicon probe recovery in freely moving rodent. eLife. (10), e65859 (2021).
  22. . IMEC Neuropixels 1.0 User Manual V1.0.8 Available from: https://www.neuropixels.org/_files/ugd/328966_ca209d53ffb346b3bf98be39b903efa9.pdf (2023)
  23. Baranauskas, G., et al. Carbon nanotube composite coating of neural microelectrodes preferentially improves the multiunit signal-to-noise ratio. J Neural Eng. 8 (6), 066013 (2011).
  24. Niell, C. M., Stryker, M. P. Modulation of visual responses by behavioral state in mouse visual cortex. Neuron. 65 (4), 472-479 (2010).
  25. Okun, M., Carandini, M., Harris, K. D. Long term recordings with immobile silicon probes in the mouse cortex. bioRxiv. , (2015).
  26. Chung, J., Sharif, F., Jung, D., Kim, S., Royer, S. Micro-drive and headgear for chronic implant and recovery of optoelectronic probes. Sci Rep. 7 (1), 2773 (2017).
  27. Bimbard, C., et al. An adaptable, reusable, and light implant for chronic Neuropixels probes. bioRxiv. , (2024).
  28. Jones, E. A. A. Chronic recoverable Neuropixels in mice. protocols.io. , (2023).
  29. . Neuronexus Products – dDrive Available from: https://www.neuronexus.com/products/accessories/microdrives/ddrive (2024)
  30. van Daal, R. J. J., et al. Implantation of Neuropixels probes for chronic recording of neuronal activity in freely behaving mice and rats. Nat Protoc. 16 (7), 3322-3347 (2021).
  31. Guo, Z. V., et al. Procedures for behavioral experiments in head-fixed mice. PLoS One. 9 (2), e88678 (2014).
  32. Groblewski, P. A., et al. A standardized head-fixation system for performing large-scale, in vivo physiological recordings in mice. J Neurosci Methods. 346, 108922 (2020).
  33. Vasilev, D., Raposo, I., Totah, N. K. Brightness illusions evoke pupil constriction preceded by a primary visual cortex response in rats. Cereb Cortex. 33 (12), 7952-7959 (2023).

Tags

DREAM ImplantChronic ElectrophysiologyLightweight Implant SystemModular DesignCost-effective SolutionNeuronal DynamicsMicrodriveSilicon Probes3D-printable DesignFaraday CageElectrical ShieldingHead-fixation SystemAnimal WelfareExperimental CostsResearch Accessibility
This article has been published
Video Coming Soon
Keep me updated:

.

PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Schröder, T., Taylor, R., Abd El Hay, M., Nemri, A., França, A., Battaglia, F., Tiesinga, P., Schölvinck, M. L., Havenith, M. N. The DREAM Implant: A Lightweight, Modular, and Cost-Effective Implant System for Chronic Electrophysiology in Head-Fixed and Freely Behaving Mice. J. Vis. Exp. (209), e66867, doi:10.3791/66867 (2024).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image