Das DREAM-Implantat: ein leichtes, modulares und kostengünstiges Implantatsystem für die chronische Elektrophysiologie bei kopffesten und sich frei verhaltenden Mäusen
Summary
Hier stellen wir ein leichtes, kostengünstiges Sondenimplantatsystem für die chronische Elektrophysiologie bei Nagetieren vor, das für Benutzerfreundlichkeit, Sondenwiederherstellung, experimentelle Vielseitigkeit und Kompatibilität mit dem Verhalten optimiert ist.
Abstract
Chronische elektrophysiologische Ableitungen bei Nagetieren haben unser Verständnis der neuronalen Dynamik und ihrer Verhaltensrelevanz deutlich verbessert. Die derzeitigen Methoden zur chronischen Implantation von Sonden stellen jedoch hohe Kompromisse zwischen Kosten, Benutzerfreundlichkeit, Größe, Anpassungsfähigkeit und Langzeitstabilität dar.
Dieses Protokoll führt ein neuartiges chronisches Sondenimplantatsystem für Mäuse namens DREAM (Dynamic, Recoverable, Economical, Adaptable, and Modular) ein, das entwickelt wurde, um die Kompromisse zu überwinden, die mit den derzeit verfügbaren Optionen verbunden sind. Das System bietet eine leichte, modulare und kostengünstige Lösung mit standardisierten Hardwareelementen, die in einfachen Schritten kombiniert und implantiert und sicher für die Wiederherstellung und mehrfache Wiederverwendung von Sonden explantiert werden können, wodurch die experimentellen Kosten erheblich gesenkt werden.
Das DREAM-Implantatsystem integriert drei Hardware-Module: (1) ein Mikrolaufwerk, das alle Standard-Siliziumsonden aufnehmen kann und es den Experimentatoren ermöglicht, die Aufzeichnungstiefe über einen Verfahrweg von bis zu 7 mm einzustellen; (2) ein dreidimensionales (3D)-druckbares Open-Source-Design für einen tragbaren Faradayschen Käfig, der mit Kupfergitter für elektrische Abschirmung, Aufprallschutz und Steckerplatzierung überzogen ist, und (3) ein miniaturisiertes Kopffixierungssystem für verbesserten Tierschutz und Benutzerfreundlichkeit. Das entsprechende Operationsprotokoll wurde im Hinblick auf Schnelligkeit (Gesamtdauer: 2 h), Sondensicherheit und Tierschutz optimiert.
Die Implantate hatten nur minimale Auswirkungen auf das Verhaltensrepertoire der Tiere, waren leicht in frei beweglichen und kopffixierten Kontexten anwendbar und lieferten klar identifizierbare Spike-Wellenformen und gesunde neuronale Reaktionen für Wochen der Datenerfassung nach der Implantation. Infektionen und andere chirurgische Komplikationen waren äußerst selten.
Als solches ist das DREAM-Implantatsystem eine vielseitige, kostengünstige Lösung für die chronische Elektrophysiologie bei Mäusen, die das Wohlbefinden der Tiere verbessert und ethologisch fundiertere Experimente ermöglicht. Sein Design vereinfacht experimentelle Verfahren für verschiedene Forschungsanforderungen und verbessert den Zugang zur chronischen Elektrophysiologie bei Nagetieren für eine Vielzahl von Forschungslabors.
Introduction
Die Elektrophysiologie mit chronisch implantierten Siliziumsonden hat sich aufgrund ihrer genetischen und experimentellen Nachvollziehbarkeit als leistungsfähige Technik zur Untersuchung der neuronalen Aktivität und Konnektivität bei sich verhaltenden Tieren, insbesondere bei Mäusen, erwiesen1. Insbesondere laminare Siliziumsonden haben sich als unschätzbares Werkzeug erwiesen, um funktionelle Beziehungen innerhalb kortikaler Säulenzu identifizieren 2 und um die Dynamik großer neuronaler Populationen auf eine Weise mit dem Verhalten in Beziehung zu setzen, die zuvor unmöglich war3.
Zwei komplementäre Ansätze sind die aktuellen Goldstandards für die Aufzeichnung neuronaler Aktivität in vivo: die Zwei-Photonen-Mikroskopie 4,5 und die extrazelluläre Elektrophysiologie6. Die Wahl der Aufzeichnungsmethode schränkt die Art der Messwerte ein, die erhalten werden können: Die Zwei-Photonen-Mikroskopie eignet sich besonders gut für Längsschnittstudien von individuell identifizierbaren Neuronen in großen Populationen über die Zeit, leidet jedoch unter hohen Gerätekosten und ist auf oberflächliche Schichten der Hirnrinde in intakten Gehirnen beschränkt. Darüber hinaus schränkt die typische zeitliche Auflösung von ~30 Hz die Fähigkeit ein, die laufende neuronale Dynamik zu erfassen 7,8.
Im Gegensatz dazu bieten elektrophysiologische Aufzeichnungen eine hohe zeitliche Auflösung (bis zu 40 kHz), um die neuronale Aktivität Moment für Moment zu verfolgen, können sowohl bei Spezies als auch in kortikalen Tiefen breit angewendet werden und sind im Vergleich zur Zwei-Photonen-Mikroskopie relativ kostengünstig aufgebaut. Die Identifizierung einzelner Neuronen sowie die longitudinale Verfolgung von neuronalen Populationen sind jedoch nur schwer zu erreichen. Dies gilt insbesondere für Drahtelektroden, z. B. Tetroden, und für akute Elektrodeneinführungen. Abgesehen davon, dass sie nicht in der Lage sind, Neuronen über Aufzeichnungssitzungen hinweg zu verfolgen9, verursachen wiederholte akute Insertionen ein lokales Trauma10 , das eine Immunantwortauslöst 11, was die Wahrscheinlichkeit von Infektionen und Gliose erhöht. Dies verringert letztlich die Stabilität der aufgezeichneten neuronalen Aktivität und die Lebenserwartung der Versuchstiere, so dass der Umfang von Längsschnittstudien mit akuten elektrophysiologischen Aufzeichnungen auf wenige Tage begrenztist 12.
Chronische Messungen von Siliziumsonden mit hoher Dichte zielen darauf ab, einige der besten Eigenschaften der akuten Elektrophysiologie und der Zwei-Photonen-Bildgebung zu kombinieren. Sie können die Dynamik der neuronalen Population über Sitzungen hinweg verfolgen, wobei die Fähigkeit, einzelne Neuronen zu identifizieren, im Vergleich zur Zwei-Photonen-Bildgebung nur etwas geringer ist13. Diese Aufzeichnungen bieten eine hohe Flexibilität bei der räumlichen Platzierung und präzisen zeitlichen Auflösung der aufgezeichneten Signale sowie eine verbesserte Langlebigkeit und ein verbessertes Wohlbefinden der Versuchstiere im Vergleich zu akuten Aufzeichnungen14. Darüber hinaus ist bei der chronischen Elektrophysiologie im Gegensatz zu akuten Aufzeichnungen nur ein einziges Implantationsereignis erforderlich, wodurch das Risiko von Infektionen und Gewebeschäden effektiv reduziert und der Stress für die Tiere minimiertwird 15. Zusammengenommen machen diese Vorteile die chronische Elektrophysiologie zu einem leistungsfähigen Werkzeug zur Untersuchung der Organisation und Funktion des Nervensystems.
Die häufig verwendeten chronischen Implantationstechniken für Mäuse hindern die Forscher jedoch dazu, erhebliche Kompromisse zwischen der Kompatibilität mit Verhaltensaufzeichnungen, dem Implantatgewicht, der Replizierbarkeit von Implantaten, den finanziellen Kosten und der allgemeinen Benutzerfreundlichkeit einzugehen. Viele Implantatprotokolle sind nicht darauf ausgelegt, die Wiederverwendung von Sonden16 zu erleichtern, was die effektiven Kosten einzelner Experimente stark erhöht und es somit für einige Laboratorien finanziell schwierig macht, chronische Elektrophysiologie einzusetzen. Sie erfordern oft auch umfangreiche interne Prototyping- und Designarbeiten, für die möglicherweise nicht das Fachwissen und die Ressourcen vorhanden sind.
Andererseits bieten integrierte Implantatsysteme17 eine breiter zugängliche Lösung für die chronische Elektrophysiologie bei Nagetieren. Diese Systeme sind so konzipiert, dass sie ein Mikrolaufwerk integrieren, das die Sonde mit dem Rest des Implantats hält, um die Handhabung des Implantats und chirurgische Eingriffe zu vereinfachen. Einmal implantiert, können solche Systeme jedoch kopflastig sein und die Fähigkeit des Experimentators einschränken, ein Experiment flexibel an unterschiedliche Zielkoordinaten anzupassen. Oft schließt ihr Gewicht Implantate bei kleineren Tieren aus, beeinträchtigt möglicherweise die Bewegung der Tiere und führt zu Stress18. Dies kann sich unverhältnismäßig stark auf die Forschung an jugendlichen und weiblichen Kohorten auswirken, da diese Gruppen eher von Gewichtseinschränkungen betroffen sind.
Darüber hinaus ermöglichen nicht alle integrierten Systeme eine Anpassung der Elektrodenpositionen nach der Implantation. Dies ist relevant, da Gliosen oder Narbenbildung durch das Einführen der Sonde19, insbesondere in den ersten 48 h nach der Implantation20, die Qualität der aufgezeichneten neuronalen Aktivität verringern können. Durch Mikroanpassungen der Einstecktiefe der Sonde können diese negativen Auswirkungen auf die Signalintegrität begrenzt werden. Daher können Mikropositioniermechanismen, allgemein als Mikroantriebe bezeichnet, auch bei Sonden mit einer großen Anzahl von Elektroden über ihre Länge verteilt sein.
Um solche Kompromisse zu überwinden, stellen wir ein neuartiges chronisches Elektrophysiologie-Implantatsystem für Mäuse vor, das die Einschränkungen früherer Designs überwindet, indem es eine leichte, kostengünstige und modulare Lösung bietet. Das DREAM-Implantatsystem ist so konzipiert, dass es weniger als 10 % (~2,1 g) des typischen Körpergewichts einer Maus wiegt, was das Wohlergehen der Tiere und minimale Auswirkungen auf das Verhalten gewährleistet. Die Validierung des DREAM-Implantatdesigns zeigt minimale Auswirkungen auf Verhaltenskennzahlen wie die Fortbewegung, die bei Nagetieren erheblich beeinträchtigt werden kann, wenn der Schädel belastet wird. Dies kann experimentellen Paradigmen zugute kommen, die sowohl frei bewegliche als auch kopffixierte Tiere verwenden, indem sie das Wohlbefinden der Tiere steigern und ethologisch fundiertere Experimente ermöglichen.
Das System verfügt über einen Mikroantrieb zur flexiblen Einstellung der Aufzeichnungstiefe von bis zu 7 mm und kann an verschiedene Arten von Sonden und Aufzeichnungsgeräten angepasst werden, wodurch den Forschern ein kostengünstiges und vielseitiges Werkzeug für verschiedene experimentelle Anwendungen zur Verfügung steht. Das System wird routinemäßig mit einem Metall-Mikroantrieb21 kombiniert, der im Vergleich zu anderen Systemen eine konsistente Sondenrückgewinnung bietet (erwartete durchschnittliche Wiederfindungsrate: ca. drei zuverlässige Wiederverwendungen pro Sonde) und die Kosten für einzelne Experimente drastisch reduziert.
Das Design verfügt über einen 3D-gedruckten Faradayschen Schutzkäfig, der einen kostengünstigen und dennoch robusten Schutz vor elektrophysiologischem Rauschen, mechanischen Einwirkungen und infektiösen Materialien ermöglicht und stabile und rauschfreie Aufnahmen mit minimalen Infektionsraten ermöglicht. Dieser implantierbare Käfig besteht aus der sogenannten “Krone”, die zum Aufprallschutz und zur Strukturierung der leitfähigen Metallnetzbeschichtung des Faradayschen Käfigs entwickelt wurde, und dem Kronenring, der als Halterung für einen implantierbaren Verstärker und/oder Sondenanschluss dient (siehe Abbildung 1).
Schließlich sind die Kopfplatten, die im modularen Implantatsystem enthalten sind, so konzipiert, dass sie mit einem neuartigen, effizienten Kopffixationssystem kompatibel sind, ohne dem Implantat zusätzliches Volumen hinzuzufügen. Im Gegensatz zu anderen bestehenden Systemen müssen keine kleinen Schrauben in der Nähe des Implantats festgezogen werden, was die Fixierung von Mäusen im Versuchsaufbau beschleunigt und die Beziehung zwischen Versuchsleiter und Tier sowie die Verhaltensadhärenz verbessert. Gleichzeitig dient die Kopfplatte als Basis, auf der die anderen Module des chronischen Elektrophysiologie-Systems DREAM aufgebaut werden.
Designdateien für das DREAM-Implantat werden als Open-Source-Hardware auf https://github.com/zero-noise-lab/dream-implant/ veröffentlicht. In den folgenden Abschnitten werden das Design und die Herstellung des DREAM-Implantatsystems beschrieben, seine erfolgreiche Implementierung in einem Mausmodell demonstriert und seine Anwendungsmöglichkeiten und Vorteile gegenüber bestehenden Systemen diskutiert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Manuskript stellt ein Protokoll für die schnelle, sichere und standardisierte Implantation von Sonden vor, das auch die Bergung und Wiederverwendung der Sonde am Ende des Experiments ermöglicht. Der Ansatz nutzt ein modulares System von Implantatkomponenten, insbesondere ein Mikrolaufwerk, das mit allen gängigen Siliziumsonden und Aufzeichnungssystemen kompatibel ist, eine Kopfplatte, die für kopffeste Verhaltensexperimente verwendet werden kann, und einen tragbaren Faradayschen Käfig zum Schutz des Implantats. Diese Konstellation ermöglicht es dem Anwender, sein Implantat flexibel an unterschiedliche experimentelle Paradigmen anzupassen, wie z.B. kopffixiertes versus frei bewegliches Verhalten oder Implantatminiaturisierung (ohne Faradayscher Käfig) versus erhöhte Langzeitsignalrobustheit (mit Faradayscher Käfig) – ohne dabei auf die Standardisierung des Implantats verzichten zu müssen.
Dieser Ansatz macht chronische elektrophysiologische Aufzeichnungen standardisierter (durch vorgefertigte Elemente, die nicht von Hand montiert werden müssen), kostengünstiger (durch Sondenbergung), weniger zeitaufwändig (durch Vereinfachung von Operationsschritten) und leichter kompatibel mit dem Tierschutz und -verhalten (durch verringerte Implantatgröße und stressfreie Kopffixierung). Als solches zielt dieses Protokoll darauf ab, elektrophysiologische Implantate in sich verhaltenden Nagetieren für ein breiteres Spektrum von Forschern zugänglich zu machen, das über die Pionierlabore auf dem neuesten Stand des Fachgebiets hinausgeht.
Um dieses Ziel zu erreichen, minimiert das hier vorgestellte Protokoll den Kompromiss zwischen mehreren oft gleich entscheidenden Aspekten von Mikroantriebsimplantaten, nämlich Flexibilität, Modularität, einfache Implantation, Stabilität, Gesamtkosten, Kompatibilität mit dem Verhalten und Wiederverwendbarkeit der Sonde. Die derzeit verfügbaren Ansätze zeichnen sich oft durch einige dieser Aspekte aus, gehen jedoch zu hohen Kosten für andere Funktionen. Für Anwendungsfälle, die absolute Implantatstabilität über lange Zeiträume erfordern, kann beispielsweise der beste Implantatansatz darin bestehen, die Sonde direkt auf den Schädel zu zementieren25. Dies verhindert jedoch auch die Wiederverwendung der Sonde sowie die Neupositionierung der Aufnahmestellen bei schlechter Aufnahmequalität und ist mit der standardisierten Implantatinsertion nicht kompatibel. In ähnlicher Weise bietet das AMIE-Laufwerk zwar eine leichte, kostengünstige Lösung für die wiederherstellbare Implantation von Sonden, ist jedoch auf einzelne Sonden beschränkt und in der Platzierung der Zielkoordinaten17 eingeschränkt. Am anderen Ende des Spektrums stehen einige kommerziell erhältliche Nanoantriebe (siehe Tabelle 1 16,17,21,26,27,28,29,30) extrem klein, können frei auf dem Schädel platziert werden und maximieren die Anzahl der Sonden, die in ein einzelnes Tier implantiert werden können 16. Sie sind jedoch im Vergleich zu anderen Lösungen teuer, erfordern von den Experimentatoren hohe Fähigkeiten für erfolgreiche Implantatoperationen und verbieten die Wiederverwendung von Sonden. Das von Vöröslakos et al.21 entwickelte Mikrolaufwerk, von dem auch eine leichte Version Teil dieses Protokolls ist, opfert die kleine Implantatgröße für eine bessere Benutzerfreundlichkeit, einen niedrigeren Preis und eine bessere Wiederverwendbarkeit der Sonde
Tabelle 1: Vergleich gängiger Strategien für chronische Sondenimplantate bei Nagetieren. Verfügbarkeit: ob das Mikrolaufwerk Open Source ist (damit Forscher es selbst bauen können), kommerziell verfügbar oder beides. Modularität: Integrierte Systeme bestehen aus einer oder wenigen Komponenten, die in einer festen Beziehung zueinander stehen, während modulare Systeme eine freie Platzierung der Sonde/des Mikroantriebs relativ zum Schutz (Kopfband/Faradayscher Käfig) nach der Herstellung des Implantats (z. B. zum Zeitpunkt der Operation) ermöglichen. Die Modularität wurde anhand von veröffentlichten Informationen bzw. Implantationsprotokollen der aufgeführten Implantate ermittelt. Headfix: Ja: Das Implantat verfügt über Mechanismen zur Kopffixierung, die in sein Design integriert sind, X: Das Implantat lässt Platz, um eine zusätzliche Kopfplatte für die Fixierung ohne große Probleme hinzuzufügen, Nein: Das Design des Implantats führt wahrscheinlich zu Platzproblemen oder erfordert erhebliche Designänderungen für die Verwendung mit der Kopffixierung. Sondenplatzierung: Eingeschränkt: Die Sondenposition ist in der Phase des Implantatdesigns begrenzt. Flexibel: Die Sondenposition kann auch während der Operation angepasst werden. Anzahl der Sonden: Die Anzahl der Sonden, die implantiert werden konnten. Beachten Sie, dass die Implantation von >2-Sonden in eine Maus unabhängig vom gewählten Implantatsystem eine erhebliche Herausforderung darstellt. Wiederverwendbarkeit der Sonde: Ja, wenn die Sonden theoretisch wiederverwendet werden können. Gewicht/Größe: Gewicht und Sperrigkeit des Implantats. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Um ein System zu schaffen, das diese unterschiedlichen Anforderungen nahtloser in Einklang bringt, wurde das DREAM-Implantat auf Basis des Vöröslakos-Implantats21 entwickelt, jedoch mit einigen grundlegenden Modifikationen. Um das Gesamtgewicht des Implantats zu reduzieren, wird der hier verwendete Mikroantrieb zunächst aus maschinell bearbeitetem Aluminium anstelle von 3D-gedrucktem Edelstahl hergestellt, und die Faraday-Krone ist miniaturisiert, wodurch je nach Wahl des Kopfplattenmaterials eine Gesamtgewichtsreduzierung von 1,2-1,4 g erreicht wird (siehe Tabelle 2). Zweitens wurde die Kopfplatte, die den Mikroantrieb umgibt, so konzipiert, dass sie einen integrierten Kopffixationsmechanismus ermöglicht, der eine schnelle und stressfreie Kopffixierung ermöglicht und gleichzeitig als Basis für den Faradayschen Käfig dient, wodurch der Zugang zu den meisten potenziellen Zielbereichen für neuronale Aufzeichnungen ermöglicht und das Implantat nur minimal belastet wird. Die flache Form des Fixationsmechanismus und das Fehlen von Vorsprüngen sorgen auch für eine minimale Beeinträchtigung des Gesichtsfeldes oder der Fortbewegung der Tiere (siehe Abbildung 2A-C), eine deutliche Verbesserung gegenüber früheren Systemen31,32. Die Faradaysche Krone und der Faraday-Ring, die auf der Kopfplatte befestigt sind, wurden im Vergleich zu früheren Designs ebenfalls erheblich verändert. Sie erfordern jetzt keine Ad-hoc-Anpassung (z. B. in Bezug auf die Platzierung des Steckers) oder Löten während der gesamten Operation, wodurch potenzielle Ursachen für Implantatschäden und unvorhersehbare Schwankungen in der Implantatqualität beseitigt werden. Stattdessen bietet das DREAM-Implantat mehrere standardisierte Kronenringvarianten, die es ermöglichen, jeden Konnektor in einer von vier vordefinierten Positionen zu platzieren, wodurch die Variabilität und der Aufwand während der Operation minimiert werden. Durch die Optimierung des Implantatsystems für die Sondenwiederherstellung ermöglicht das DREAM-Implantat den Experimentatoren, die Kosten sowie die Vorbereitungszeit pro Implantat drastisch zu senken, da das Mikrolaufwerk und die Sonde in der Regel zusammen geborgen, gereinigt und wiederverwendet werden können.
Einen umfassenderen Überblick über die Kompromisse, die die verschiedenen Implantatsysteme mit sich bringen, finden Sie in Tabelle 1. Während der hier vorgestellte Ansatz im Vergleich zu allen anderen Strategien in der Regel keine maximale Leistung bietet, z. B. in Bezug auf Größe, Stabilität oder Kosten, arbeitet er bei all diesen Parametern im oberen Bereich, was ihn leichter auf eine Vielzahl von Experimenten anwendbar macht.
Drei Aspekte des Protokolls sind besonders wichtig, um es an den jeweiligen Anwendungsfall anzupassen: Die Konstellation von Boden und Referenz, die Technik zur Zementierung des Mikroantriebs und die Implantatvalidierung durch neuronale Aufzeichnung. Zunächst ging es bei der Implantation der Masse- und Referenzstifte darum, den Sweet Spot zwischen mechanischer/elektrischer Stabilität und Invasivität zu identifizieren. Während z. B. schwimmende Silberdrähte, die in Agar eingebettet sind, weniger invasiv sind als Knochenschrauben33, sind sie wahrscheinlich anfälliger dafür, sich im Laufe der Zeit zu lösen. Die Verwendung von Stiften, gekoppelt mit Agar, gewährleistet eine stabile elektrische Verbindung und hat gleichzeitig den Vorteil, dass sie während des Einführens leichter zu kontrollieren ist und Gewebetraumata vermieden werden. Es ist unwahrscheinlich, dass sich am Schädel befestigte Erdungsstifte lösen, und falls sich der Draht vom Stift trennt, ist die Wiederbefestigung aufgrund der größeren Oberfläche und Stabilität des implantierten Stifts in der Regel einfach.
Tabelle 2: Vergleich der Komponentengewichte zwischen dem DREAM-Implantat und dem von Vöröslakos et al.21 beschriebenen Implantat. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Zweitens sollte die Zementierung des Mikrolaufwerks in der Regel vor dem Einführen der Sonde in das Gehirn erfolgen. Dadurch wird eine seitliche Bewegung der Sonde im Gehirn verhindert, wenn der Mikroantrieb während des Einführens nicht perfekt in der stereotaktischen Halterung fixiert ist. Um die Platzierung der Sonde zu überprüfen, bevor das Mikrolaufwerk an Ort und Stelle zementiert wird, kann man die Spitze des Sondenschafts kurz absenken, um festzustellen, wo er das Gehirn berühren wird, da die Extrapolation der Aufsetzposition angesichts der Parallaxenverschiebung des Mikroskops schwierig sein kann. Sobald die Position des Mikroantriebs festgelegt ist, kann die Kraniotomie optional mit Silikonelastomer geschützt werden, bevor der Mikroantrieb zementiert wird, um sicherzustellen, dass der Zement nicht versehentlich mit der Kraniotomie in Kontakt kommt. Es wird jedoch nicht empfohlen, die Sonde durch das Silikonelastomer abzusenken, da Silikonelastomerrückstände ins Gehirn gezogen werden und Entzündungen und Gliose verursachen können.
Drittens kann je nach verwendetem Versuchsprotokoll eine Testaufzeichnung direkt nach der Operation sinnvoll sein oder auch nicht. Im Großen und Ganzen ist die neuronale Aktivität, die direkt nach dem Einführen der Sonde aufgezeichnet wird, nicht direkt repräsentativ für die chronisch aufgezeichnete Aktivität, was auf Faktoren wie vorübergehende Hirnschwellungen und Gewebebewegungen um die Sonde zurückzuführen ist, was bedeutet, dass sowohl die Einstichtiefe als auch die Spike-Wellenformen wahrscheinlich nicht direkt stabilisiert werden. Sofortaufnahmen können daher vor allem dazu dienen, die allgemeine Signalqualität und die Integrität des Implantats zu ermitteln. Es wird empfohlen, den beweglichen Microdrive-Schlitten in den folgenden Tagen nach der Operation zu verwenden, sobald sich das Gehirn stabilisiert hat, um die Position fein abzustimmen. Dies trägt auch dazu bei, eine Bewegung der Sonde um mehr als 1000 μm pro Tag zu vermeiden, wodurch Schäden an der Aufzeichnungsstelle minimiert und somit die Langlebigkeit der Aufzeichnungsstelle verbessert wird.
Schließlich können Benutzer das System so anpassen, dass es von mehr als einem Zielort aus aufzeichnet. Da dieses System modular aufgebaut ist, hat der Anwender einen großen Spielraum bei der Montage und Platzierung der Komponenten zueinander (siehe oben sowie Ergänzende Abbildung 3 und Ergänzende Abbildung 4). Dazu gehören Modifikationen, die es ermöglichen würden, ein horizontal verlängertes Shuttle auf dem Mikroantrieb zu montieren, was die Implantation mehrerer Sonden oder großer Sonden mit mehreren Schäften ermöglicht, sowie die Implantation mehrerer einzelner Mikroantriebe (siehe Ergänzende Abbildung 3 und Ergänzende Abbildung 4). Solche Modifikationen erfordern lediglich die Verwendung eines angepassten Kronenrings mit einer erhöhten Anzahl von Befestigungszonen für Steckverbinder/Interface-Boards/Headstages. Die räumlichen Einschränkungen dieses Designs werden jedoch durch das Tiermodell, in diesem Fall die Maus, vorgegeben, was das Stapeln mehrerer Sonden auf ein Mikrolaufwerk in Bezug auf den Platzbedarf attraktiver macht als die Implantation mehrerer Mikrolaufwerke unabhängig voneinander. Die hier verwendeten Mikroantriebe können gestapelte Sonden unterstützen, und daher ist die einzige wirkliche Einschränkung die Anzahl der Kopfstufen oder Anschlüsse, die den vom Tiermodell definierten Platz- und Gewichtsbeschränkungen entsprechen können. Abstandshalter können auch verwendet werden, um die nicht-vertikalen Montage- und Einsteckwege weiter zu erhöhen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll eine kostengünstige, leichte und vor allem einstellbare Implantation einer Sonde ermöglicht, mit dem zusätzlichen Vorteil eines Mikrolaufwerksdesigns, das die Wiederherstellung der Sonde in den Vordergrund stellt. Dies löst die Probleme der unerschwinglichen Kosten von Einwegsonden, der hohen Barriere für chirurgische und Implantationsfähigkeiten sowie der Tatsache, dass kommerzielle Lösungen für chronische Implantationen oft schwer an einzigartige Anwendungsfälle angepasst werden können. Diese Probleme stellen ein Problem für Labore dar, die bereits akute Elektrophysiologie anwenden, und eine Abschreckung für diejenigen, die noch keine elektrophysiologischen Experimente durchführen. Dieses System zielt darauf ab, die breitere Akzeptanz der chronischen Elektrophysiologieforschung über diese Grenzen hinaus zu erleichtern.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom Niederländischen Forschungsrat (NWO; Crossover-Programm 17619 “INTENSE”, TS) und wurde durch das Siebte Rahmenprogramm der Europäischen Union (FP7/2007-2013) im Rahmen des Grant Agreements Nr. 600925 (Neuroseeker, TS, FB, PT) sowie durch die Max-Planck-Gesellschaft gefördert.
Materials
| 0.05" Solder Tail Socket | Mill-Max | 853-93-100-10-001000 | |
| 1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’- Reagent tetramethylindocarbocyanine perchlorate (’DiI’; DiIC18(3)) | ThermoFisher | D282 | Lipophilic dye used for easier histological verification of the probe location |
| Adhesive Putty (Blu-Tack) | Bostik | 308590110 | Variations (e.g. by Pritt) should be available in your stationary store |
| Agar | Sigma Aldrich | A1296 | Make with saline for conductivity. |
| Amplifier (Miniamp-64) | Cambridge Neurotech | Miniature and implantable amplifier and digitiser. Alternative Implantable digitiser, or implantable Omnetics connector use possible. | |
| Analgesic Cream (EMLA Cream) | Aspen | 39699/0088 | Analgesic cream used for operative pain containing prilocaine, lidocaine. |
| Angled Spacer | 3DNeuro | Angled spacer for non-perpendicular drive mounting.. Open souce, also available at https://github.com/zero-noise-lab/dream-implant/ | |
| Blue light curing LED | B.A. International | 818223 | Curing light for primer polymerisation. 420-480 nm wavelength |
| Bone wax | SMI | Z046 | Wax to protect craniotomy and probe post surgery. |
| Copper mesh | Dexmet | 3CU6-050FA | Copper mesh used to electrically and physically shield probe and craniotomy. |
| Cyanoacrylate glue (Loctite) | Loctite | 1363589 | Cyanoacrylate gel glue |
| Dental Cement (SuperBond C&B) | Sun Medical | K058E | Dental cement (SuperBond) |
| Depilation Cream (Veet) | Veet | 310000091434 | Hair removal cream for removal of hair around surgical site. |
| Faraday crown | 3DNeuro | 3D printed implantable protective cage. Open souce, also available at https://github.com/zero-noise-lab/dream-implant/ | |
| Faraday ring | 3DNeuro | 3D printed implantable protective ring for faraday cage. Open souce, also available at https://github.com/zero-noise-lab/dream-implant/ | |
| Haemostatic Sponge | SMI | ZHG101010 | Absorbable gelatin haemostatic sponge |
| Heat Shrink Tubing | HellermannTyton | TA32-9/3 BK | Heat Shrink tubing for making soft tipped forceps |
| Iodine | Braunol | 9322507 | Aqueous povidone-iodine solution. |
| Microdrive (R2Drive) | 3DNeuro | Recoverable Metal micro drive with moveable shuttle. Open souce, also available at https://buzsakilab.github.io/ 3d_print_designs/ |
|
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5310-100ML | Oil used as solvent to create craniotomy protection gel. |
| Non-Shedding Wipes (Kimtech) | Kimtech | 7552 | Non-shedding wipes |
| Primer | Bisco | B-7202P | Universal skull adhesive preventing moisture from deteriorating the cement and providing a solid base to build up cement onto. |
| R2Drive holder | 3DNeuro | Stereotactic attachment for mounting R2Drive. Open souce, also available at https://buzsakilab.github.io/ 3d_print_designs/ |
|
| Self-adherent wrap | 3M | VB050 | Protective wrap for implant post surgery |
| Silicon probe (H2) | Cambridge Neurotech | Chronically implantable linear silicon probe with 32 channels. Alternative Probe use possible. | |
| Silicone Elastomer (Duragel) | Cambridge Neurotech | Silicone Elastomer | |
| Silicone Plaster (Kwikcast) | WPI | KWIK-CAST | |
| Silver conductive epoxy | MG Chemicals | 8331D-14G | Silver epoxy |
| Size 5 Dumont forceps | FSTools | 11251-10 | Small forceps for lifting bone flap. |
| Stainless steel wire, Teflon coated | Science Products GmBH | SS-3T | Ground wire |
| Stereotax (RWD) | RWD | 68803 | Stereotax for surgical procedures on mice. |
| Tergazyme | Alconox | 1304 | A possible enzymatic cleaner to clean probe |
| Two Part Fast setting Epoxy Resin | Gorilla | EP3 | Epoxy for permanent bonding of DREAM implant parts. |
| Vannas Spring Scissors Round Handle | FSTools | 15403-08 | 0.075mm straight tipped spring rebound veterinary scissors. |
| Veterinary Cyanoacrylate glue (Vetbond) | 3M | 70-0068-5256-3 | Veterinary cyanoacrylate glue |
Referenzen
- Epsztein, J., Brecht, M., Lee, A. K. Intracellular determinants of hippocampal CA1 place and silent cell activity in a novel environment. Neuron. 70 (1), 109-120 (2011).
- Okun, M., et al. Diverse coupling of neurons to populations in sensory cortex. Nature. 521 (7553), 511-515 (2015).
- Jun, J. J., et al. Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity. Nature. 551 (7679), 232-236 (2017).
- Znamenskiy, P., Kim, M. -. H., Muir, D. R., Iacaruso, M. F., Hofer, S. B., Mrsic-Flogel, T. D. Functional specificity of recurrent inhibition in visual cortex. Neuron. 112 (6), 991-1000.e8 (2024).
- Rowland, J. M., et al. Propagation of activity through the cortical hierarchy and perception are determined by neural variability. Nat Neurosci. 26 (9), 1584-1594 (2023).
- Roth, M. M., Dahmen, J. C., Muir, D. R., Imhof, F., Martini, F. J., Hofer, S. B. Thalamic nuclei convey diverse contextual information to layer 1 of visual cortex. Nat Neurosci. 19 (2), 299-307 (2016).
- Zong, W., et al. Large-scale two-photon calcium imaging in freely moving mice. Cell. 185 (7), 1240-1256.e30 (2022).
- Demas, J., et al. High-speed, cortex-wide volumetric recording of neuroactivity at cellular resolution using light beads microscopy. Nat Methods. 18 (9), 1103-1111 (2021).
- Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents – EEG, ECoG, LFP and spikes. Nat Rev Neurosci. 13 (6), 407-420 (2012).
- Polikov, V. S., Tresco, P. A., Reichert, W. M. Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes. J Neurosci Methods. 148 (1), 1-18 (2005).
- Savya, S. P., et al. In vivo spatiotemporal dynamics of astrocyte reactivity following neural electrode implantation. Biomaterials. 289, 121784 (2022).
- Perge, J. A., et al. Intra-day signal instabilities affect decoding performance in an intracortical neural interface system. J Neural Eng. 10 (3), 036004 (2013).
- Pachitariu, M., Steinmetz, N., Kadir, S., Carandini, M., Harris, K. D. Kilosort: realtime spike-sorting for extracellular electrophysiology with hundreds of channels. bioRxiv. , (2016).
- Buzsáki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nat Neurosci. 7 (5), 446-451 (2004).
- Kloosterman, F., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: Drive fabrication. J Vis Exp. (26), e1094 (2009).
- Jacobs, T., Darch, H., Holtzman, T., De Zeeuw, C. I., Romano, V. Standard operating protocol: Implantation of Cambrige NeuroTech chronic silicon probe and mini-amp-64 digital headstage in mice. Protocol Exchange. , (2023).
- Juavinett, A. L., Bekheet, G., Churchland, A. K. An adaptable, reusable, and light implant for chronic Neuropixels probes. bioRxiv. , (2024).
- Kozai, T. D. Y., Jaquins-Gerstl, A. S., Vazquez, A. L., Michael, A. C., Cui, X. T. Brain tissue responses to neural implants impact signal sensitivity and intervention strategies. ACS Chem Neurosci. 6 (1), 48-67 (2015).
- Nguyen, D. P., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: tetrode assembly. J Vis Exp. (26), 1098 (2009).
- Biran, R., Martin, D. C., Tresco, P. A. Neuronal cell loss accompanies the brain tissue response to chronically implanted silicon microelectrode arrays. Exp Neurol. 195 (1), 115-126 (2005).
- Vöröslakos, M., Petersen, P. C., Vöröslakos, B., Buzsáki, G. Metal microdrive and head cap system for silicon probe recovery in freely moving rodent. eLife. (10), e65859 (2021).
- . IMEC Neuropixels 1.0 User Manual V1.0.8 Available from: https://www.neuropixels.org/_files/ugd/328966_ca209d53ffb346b3bf98be39b903efa9.pdf (2023)
- Baranauskas, G., et al. Carbon nanotube composite coating of neural microelectrodes preferentially improves the multiunit signal-to-noise ratio. J Neural Eng. 8 (6), 066013 (2011).
- Niell, C. M., Stryker, M. P. Modulation of visual responses by behavioral state in mouse visual cortex. Neuron. 65 (4), 472-479 (2010).
- Okun, M., Carandini, M., Harris, K. D. Long term recordings with immobile silicon probes in the mouse cortex. bioRxiv. , (2015).
- Chung, J., Sharif, F., Jung, D., Kim, S., Royer, S. Micro-drive and headgear for chronic implant and recovery of optoelectronic probes. Sci Rep. 7 (1), 2773 (2017).
- Bimbard, C., et al. An adaptable, reusable, and light implant for chronic Neuropixels probes. bioRxiv. , (2024).
- Jones, E. A. A. Chronic recoverable Neuropixels in mice. protocols.io. , (2023).
- . Neuronexus Products – dDrive Available from: https://www.neuronexus.com/products/accessories/microdrives/ddrive (2024)
- van Daal, R. J. J., et al. Implantation of Neuropixels probes for chronic recording of neuronal activity in freely behaving mice and rats. Nat Protoc. 16 (7), 3322-3347 (2021).
- Guo, Z. V., et al. Procedures for behavioral experiments in head-fixed mice. PLoS One. 9 (2), e88678 (2014).
- Groblewski, P. A., et al. A standardized head-fixation system for performing large-scale, in vivo physiological recordings in mice. J Neurosci Methods. 346, 108922 (2020).
- Vasilev, D., Raposo, I., Totah, N. K. Brightness illusions evoke pupil constriction preceded by a primary visual cortex response in rats. Cereb Cortex. 33 (12), 7952-7959 (2023).
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