Summary

Perfusion der Rattenleber und Isolierung primärer Hepatozyten: ein altes Verfahren, das für die hochmoderne 3D-Organoidkultur entscheidend ist

Published: November 22, 2024
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Summary

Dieses Protokoll stellt eine optimierte zweistufige Kollagenase-Leberperfusionstechnik in einem Rattenmodell vor und zeigt die Verwendung von isolierten Hepatozyten für die in vitro Langzeitkultur von 3D-Organoiden.

Abstract

Primäre Hepatozyten sind ein häufig verwendetes Werkzeug für In-vitro-Studien im Zusammenhang mit der Leber. Die Erhaltung dieser Zellen war jedoch schon immer eine Herausforderung, da sie in Kultur schnell an Morphologie, Lebensfähigkeit und Funktionalität verloren haben. Ein neuerer Ansatz zur Langzeitkultur ist die Erzeugung von dreidimensionalen (3D) Organoiden, einem In-vitro-Werkzeug , das Gewebe in einer Schale rekapitulieren kann, basierend auf der wunderbaren Fähigkeit der Leber, sich selbst zu regenerieren. Veröffentlichte Protokolle wurden entwickelt, um langfristig funktionsfähige 3D-Organoide aus primären adulten Hepatozyten (Hep-Orgs) zu gewinnen. Das hochmoderne 3D-Organoid-Werkzeug erfordert die Fähigkeit, Zellen aus adultem Gewebe zu isolieren, und dieser erste Schritt ist entscheidend für ein qualitativ hochwertiges Endergebnis. Die in den 1970er Jahren eingeführte zweistufige Kollagenase-Perfusion ist nach wie vor ein gültiges Verfahren, um einzelne Hepatozyten zu gewinnen. Ziel des vorliegenden Artikels ist es, alle entscheidenden Schritte des chirurgischen Eingriffs zu beschreiben und dadurch das Verfahren zur Isolierung primärer Hepatozyten im Rattenmodell zu optimieren. Darüber hinaus wird ein besonderes Augenmerk auf die PREPARE-Leitlinien gelegt, um die Wahrscheinlichkeit erfolgreicher Verfahren zu erhöhen und qualitativ hochwertige Ergebnisse zu gewährleisten. Ein detailliertes Protokoll ermöglicht es den Forschern, die nachgelagerte Arbeit zur Etablierung von 3D-Organoiden aus primären adulten Rattenhepatozyten zu beschleunigen und zu optimieren. Im Vergleich zu 2D-Hepatozyten waren Hep-Orgs an Tag 15 noch lebensfähig und in aktiver Proliferation, was ein langfristiges Potenzial zeigt.

Introduction

Primäre Hepatozyten sind ein wichtiges und weit verbreitetes Werkzeug für in vitro Leberstudien. Ihre Erweiterung und Pflege war jedoch in der Vergangenheit eine Herausforderung, da sie nach einigen Tagen in der Kultur an Morphologie und Funktionalität verlieren1. Die 2D-Kultur ist insbesondere für Hepatozyten eine limitierende Bedingung, die eine polygonale Form und polarisierte Struktur mit differenzierten apikalen und basolateralen Membranen aufweisen. Tatsächlich beeinträchtigt die Adhäsion der Hepatozyten an der Platte ihre normale Aktivität, da sie zu einem flachen Zytoskelett mit begrenzter Interaktion zwischen den Zellen und zwischen den Zellen und der extrazellulären Matrix (EZM) führt, wodurch die Polarisation und die beteiligten Signalwege reduziertwerden 2.

Um die Einschränkungen dieser Methode zu umgehen, verwendeten Dunn und Kollegen3 zunächst die Kollagen-Doppelschicht. Diese Kulturmethode, die als “Sandwichkultur-Methode” bekannt ist, basiert auf der Aussaat von primären Hepatozyten zwischen den beiden Schichten der Matrix. Diese Methode hat viele Vorteile, darunter die Langzeitkultur, die Beibehaltung der polygonalen Morphologie und transkriptionelle Aktivitäten, die mit denen frisch isolierter Hepatozyten vergleichbar sind4. Ein ähnliches, auf dem gleichen Prinzip beruhendes Verfahren, bei dem die Unterlage aus Matrigel und die Überlagerung aus Kollagen besteht, hat das Vorhandensein eines gut etablierten Kanalikularnetzwerks nachgewiesen5.

Trotz der Zuverlässigkeit der Sandwich-Kulturmethode für das Hepatozytenwachstum wird in der vorliegenden Arbeit eine 3D-Organoidkultur aufgebaut, ein In-vitro-Werkzeug zur Rekapitulation von Geweben in einer Schale und eine potenzielle Brücke zur personalisierten Medizin gebildet, die die Generierung krankheitsspezifischer biologischer Erkenntnisse, die Identifizierung molekularer Ziele, die Etablierung von Medikamenten, die Einrichtung von Biobanken und die Eröffnung neuer Horizonte für innovative Technologien wie Organ-on-Chipermöglicht 6. Primäre Hepatozyten wurden in hemisphärische Matrixtröpfchen eingebettet, die als “Domes” bekannt sind, um ein robustes Wachstum von Organoiden in den Domes zu ermöglichen und den Fluss der löslichen Faktoren, einschließlich des Hepatozyten-Wachstumsfaktors (HGF) und des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF), aus dem Kulturmedium zu gewährleisten. Diese Wachstumsfaktoren aktivieren direkt Signalwege, um das Überleben der Hepatozyten zu sichern7. Leber-Organoide werden in der Regel aus Stamm-/Vorläuferzellen gewonnen, die aus embryonalen Stadien oder adulten Ratten, Mäusen, menschlicher (und auch Hunde- und Katzen-) Leber isoliert wurden8. Auch wenn die 3D-Konformation die Differenzierung von Stammzellen zu adulten Hepatozyten verbessert, fehlt diesem Werkzeug immer noch die Reife des ursprünglichen Primärgewebes9. Um dieses Problem zu überwinden, veröffentlichten 2018 zwei verschiedene Gruppen 9,10 gleichzeitig ein Protokoll zur Gewinnung einer Langzeitkultur von 3D-Leberorganoiden aus adulten primären Maus-Hepatozyten (als Hep-Orgs bezeichnet). Ihre Protokolle rekapitulieren die proliferative Schadensreaktion der Leberregeneration, indem Hepatozyten mit einem hohen Gehalt an entzündlichen Zytokinen wachsen, wie sie nach einer partiellen Hepatektomie auftreten. In der Tat zeigen die oben genannten Studien, dass Hepatozyten nach einer Verletzung12 oder wenn die Cholangiozytenproliferation unterdrückt wird13, in einen duktalen Zustand wechseln können. Ihre bipotente Kapazität ermöglicht die zelluläre Plastizität, was für komplexe Strukturen wie Organoide wichtig ist. Daher überwinden diese Protokolle das Problem der Unfähigkeit, primäre Hepatozyten in vitro zu expandieren.

Das hochmoderne 3D-Organoid-Werkzeug erfordert die Fähigkeit, Zellen aus adultem Gewebe zu isolieren, und dieser erste Schritt ist entscheidend für ein qualitativ hochwertiges Endergebnis. Während die 3D-Organoid-Präparation als eine neue und sich entwickelnde Technik angesehen werden kann (da die Organoid-Definition erst vor zehn Jahren von Lancaster14 und Huch15 geprägt wurde), ist die zweistufige Kollagenase-Perfusion ein altes Verfahren, das von Seglen in den 1970er Jahren eingeführt wurde16. Konzentriert man sich auf die neuesten Veröffentlichungen auf diesem Gebiet, so können die Protokolle von Ng17 und Shen18 als Goldstandard für die Durchführung des Verfahrens bei Ratten angesehen werden, während die Protokolle von Cabral19 und Charni-Natan20 für Mäuse angesehen werden. Es ist nicht ungewöhnlich, dass sich Forscher auf die Auswahl der besten extrazellulären Matrix (EZM) und Wachstumsfaktoren für die Entwicklung von 3D-Organoiden konzentrieren, aber auf Fehler stoßen, wie z. B. unsachgemäße chirurgische Eingriffe, geringe Lebensfähigkeit und Ausbeute der Hepatozyten oder ein hohes Maß an bakterieller Kontamination. Diese Probleme verlängern die nachgelagerten Versuche und erhöhen die Anzahl der Tiere, die für die folgenden Versuche benötigt werden. Umgekehrt ermöglicht die hohe Anzahl der gewonnenen lebensfähigen Hepatozyten, wenn die Operations- und Isolierungsverfahren gut abgestimmt sind, die Herstellung einer großen Anzahl von Organoiden, wodurch der Einsatz von Tieren eingeschränkt wird. Das vorliegende Protokoll befasst sich hauptsächlich mit diesen Fragen unter Verwendung kommerzieller Lösungen und durch die Optimierung einer präzisen Pfortaderkanülierung, die optimale Perfusions- und Verdauungsschritte mit der Leber in situ gewährleistet.

Um die Qualität, Reproduzierbarkeit und Übersetzbarkeit unserer Tierversuche zu verbessern, haben wir die PREPARE-Richtlinien sorgfältig berücksichtigt: Planning Research and Experimental Procedures on Animals: Recommendations for Excellence21. Diese Reporting-Richtlinien versuchen, die Erfolgswahrscheinlichkeit durch Planung zu erhöhen und stellen einen wichtigen Schritt bei der Umsetzung der 3R von Russel und Burch (Replacement, Reduction, and Refinement) dar. Der PREPARE-Leitfaden deckt 15 Hauptthemen ab, die je nach Forschungsprojekt bearbeitet werden sollten. Wir beschreiben die Themen, auf die wir uns bei der Planung und Vorbereitung des Projekts konzentriert haben.

Die vorliegende Arbeit zielt darauf ab, in einem umfassenden, detaillierten und konsequenten Protokoll die entscheidenden Schritte der Operation im Rattenmodell zu beschreiben, um den Forschern eine Beschleunigung und Optimierung der nachgelagerten Arbeit zu ermöglichen. Als wir uns diesen Protokollen zum ersten Mal näherten, stießen wir auf Probleme mit bakterieller Kontamination, geringer Leberverdauungseffizienz, geringer primärer Hepatozytenausbeute und geringer Lebensfähigkeit der Hepatozyten, die den Erfolg der Technik leicht beeinträchtigen können. Dieses Protokoll zeigte, wie kritische Merkmale angesprochen und gelöst werden können, und optimierte das Verfahren für die Isolierung primärer Hepatozyten von Ratten. Die Perfusion der Rattenleber und die anschließende Isolierung von primären adulten Hepatozyten sind die wichtigsten vorbereitenden Schritte für verschiedene Anwendungen. Insbesondere eignet sich dieses Protokoll für alle Verfahren, die eine gute Ausbeute an hochwertigen und lebensfähigen adulten Hepatozyten erfordern. Die Ergebnisse des Protokolls sind geeignet, um In-vitro-Modelle zur Untersuchung der Leberphysiologie und -pathologie zu etablieren.

Protocol

Alle Verfahren und die Unterbringung der Tiere wurden gemäß den Richtlinien des italienischen Rechts und der Richtlinie der Europäischen Gemeinschaft durchgeführt. Das Versuchsprotokoll wurde vom lokalen Tierschutzausschuss und vom italienischen Gesundheitsministerium (Genehmigung Nr. 321/2022-PR) gemäß Art. 31 des Dekrets 26/2014 genehmigt. 1. Vorbereitung auf den Tiereingriff HINWEIS: Bitte beziehen Sie sich a…

Representative Results

Am Ende der Setup-Verfahren (Schritt 6.13) erhielten wir eine Zellausbeute von bis zu 1 x 108 Zellen pro Isolation aus der Leber von etwa 300 g einer Ratte. Eine Zellviabilität zwischen 78 % und 97 % wurde durch Trypanblau-Zählung festgestellt. Wie bereits in früheren Studienbeschrieben 1,18,19, verlieren primäre Hepatozyten in Kultur ihre Morphologie, …

Discussion

3D-Organoide sind eine Grenze für die personalisierte Medizin und ermöglichen eine langfristige Hepatozytenkultur. Die Qualität dieser innovativen Technik erfordert eine gute Ausbeute an lebensfähigen primären Hepatozyten und eine gut durchgeführte Leberperfusion und Hepatozytenisolierung. Dieses alte Verfahren ist immer noch weit verbreitet; Es umfasst jedoch verschiedene Schritte, die eine Herausforderung darstellen können. Als wir uns dem Verfahren näherten, stießen wir auf k…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Dr. Davide Selvestrel und Prof. Giovanni Sorrentino vom SorrentinoLab an der Universität Triest für die Unterstützung bei der Durchführung des EdU-Proliferationstests. Die Arbeiten wurden durch einen Ad-hoc-Zuschuss der Banca d’Italia und interne FIF-Zuschüsse unterstützt.

Materials

A83-01- ALK5 Inhibitor IV Twin Helix  T3031
B27 Thermofisher Scientific 0080085SA
CFX Connect Real-Time PCR Detection System   Bio-Rad
CHIR99021 Twin Helix T2310
Click EdU Alexa 488 imaging kit Thermofisher Scientific C10499
Collagen, Type I, solution from rat tail Merck C3867-1VL
Dexamethasone  Merck D4902
EGF Merck  E9644
Fetal bovine serum (FBS) Euroclone ECS0180L
GELTREX LDEV FREE RGF BME Thermofisher Scientific A1413202
Heparin Sodium 25000 IU/5 ml B. Braun Melsungen AG B01AB01
HGF Peprotech  100-39H 
Insulin-Transferrin-Selenium solution 100x  Thermofisher Scientific 41400045
L-Glutamine solution Euroclone ECB3000D
Liver Digest Medium  Thermofisher Scientific  17703-034
Liver Perfusion Medium Thermofisher Scientific 17701038
N2 supplement Thermofisher Scientific 17502048
N-acetylcysteine Merck A9165
Nicotinamide Merck  N-0636
Non-Essential Amino Acids Merck M7145
Normocin Aurogene ant-nr-1
PBS buffer 1X PanReac AppliChem A0964,9050
Penicillin-streptomycin solution 100x Euroclone ECB3001D
Percoll Santa Cruz sc-296039A
Peristaltic pump Ismatec™  MS-4/12 Reglo Digital Pump
TNFa Peprotech  300-01A
TRI Reagent Merck T9424
Tubing  Ismatec™   ID.2,79mm
Williams' E Medium, no glutamine Thermofisher Scientific 31415029
Y27632 Twin Helix T1725

Referenzen

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Diesen Artikel zitieren
Tiriticco, V., Codotto, G., Blarasin, B., Salvoza, N., Stebel, M., Tiribelli, C., Bellarosa, C. Rat Liver Perfusion and Primary Hepatocytes Isolation: An Old Procedure Crucial for Cutting-Edge 3D Organoids Culture. J. Vis. Exp. (213), e66857, doi:10.3791/66857 (2024).

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