Die Aufreinigung rekombinanter Proteine aus pflanzlichen Systemen wird in der Regel durch pflanzliche Proteine herausgefordert. Diese Arbeit stellt eine Methode zur effektiven Extraktion und Reinigung eines sekretierten rekombinanten Proteins aus dem Apoplast von Nicotiana benthamiana dar.
Pflanzen sind ein neu entwickeltes eukaryotisches Expressionssystem, das zur Herstellung therapeutischer Proteine erforscht wird. Die Reinigung von rekombinanten Proteinen aus Pflanzen ist einer der kritischsten Schritte im Produktionsprozess. In der Regel wurden Proteine aus vollständig löslichen Proteinen (TSP) gereinigt, und das Vorhandensein verschiedener intrazellulärer Proteine und Cytochrome stellt eine Herausforderung für nachfolgende Proteinreinigungsschritte dar. Darüber hinaus werden die meisten therapeutischen Proteine wie Antigene und Antikörper sezerniert, um eine ordnungsgemäße Glykosylierung zu erhalten, und das Vorhandensein unvollständig modifizierter Proteine führt zu inkonsistenten Antigen- oder Antikörperstrukturen. In dieser Arbeit wird eine effektivere Methode zur Gewinnung hochreiner rekombinanter Proteine aus dem apoplastischen Pflanzenraum vorgestellt. Das rekombinante grün fluoreszierende Protein (GFP) wird so verändert, dass es in den Apoplasten von Nicotiana benthamiana sezerniert und dann mit einer Infiltrations-Zentrifugationsmethode extrahiert wird. Das GFP-His aus dem extrahierten Apoplasten wird dann durch Nickel-Affinitätschromatographie aufgereinigt. Im Gegensatz zu den traditionellen Methoden von TSP entstehen bei der Aufreinigung aus dem Apoplasten hochreine rekombinante Proteine. Dies stellt eine wichtige technologische Verbesserung für pflanzliche Produktionssysteme dar.
Heutzutage werden verschiedene pflanzlich produzierte rekombinante therapeutische Proteine untersucht, darunter Antikörper, Impfstoffe, bioaktive Proteine, Enzyme und kleine Polypeptide 1,2,3,4,5,6. Pflanzen werden aufgrund ihrer Sicherheit, ihrer geringen Kosten und ihrer Fähigkeit, die Produktion schnell zu skalieren, zu einer zunehmend genutzten Plattform für die Herstellung therapeutischer Proteine 7,8. Die Proteinexpression und -modifikation in pflanzlichen Systemen sind zusammen mit der Proteinreinigung kritische Faktoren, die die Produktivität von pflanzlichen Bioreaktoren bestimmen 9,10. Die Steigerung der Pflanzenproduktivität und die Gewinnung hochreiner Zielproteine sind zentrale Herausforderungen für pflanzenbasierte Produktionssysteme11,12.
Die subzelluläre Lokalisierung und Modifikation rekombinanter Proteine hängt von dem spezifischen Signalpeptid ab, das am N-Terminus kodiert ist und das Protein während der Genexpression zu seinem endgültigen Organellenziel führt. Rekombinante Proteine sind so konzipiert, dass sie aufgrund ihrer einzigartigen Eigenschaften im Apoplasten, im endoplasmatischen Retikulum (ER), im Chloroplasten, in der Vakuole oder im Zytoplasma lokalisiertsind 13. Bei Antigenen und Antikörpern werden sekretierte Proteine bevorzugt. Vor der Sekretion durchlaufen die Proteine ER und Golgi für eine korrekte Faltung und posttranslationale Modifikationen 14,15,16.
Nach der Produktion in Pflanzen müssen rekombinante Proteine aus Pflanzenextrakten gereinigt werden. Typischerweise werden Proteine aus vollständig löslichen Pflanzenextrakten gereinigt, die reichlich intrazelluläre Proteine, fehlgefaltete und unmodifizierte Produkte und Cytochrome enthalten17. Um Verunreinigungen zu entfernen, werden Pflanzenextrakte einer umfangreichen Fraktionierung unterzogen, einschließlich einer Ribulose-1,5-Bisphosphat-Carboxylase/Oxygenase (RuBisCO)-spezifischen Affinitätschromatographie, Phytatfällung, Polyethylenglykolfällung und Einstellung von Temperatur und pH18,19. Solche Schritte zur Entfernung von Verunreinigungen sind mühsam und können die Proteinqualität beeinträchtigen.
Das pflanzliche Zellkompartiment jenseits der Plasmamembran wird als Apoplast definiert und umfasst die Zellwand, die Interzellularräume und das Xylem20. Die wässrige Phase wird allgemein als Apoplast-Waschflüssigkeit (AWF) bezeichnet. AWF enthält Moleküle, die von Zellen sezerniert werden, um zahlreiche biologische Prozesse wie Transport, Zellwandstoffwechsel und Stressreaktionen zu regulieren21,22. Im Gegensatz zu TSP sind die molekularen Bestandteile von AWF weniger komplex. Die Extraktion rekombinanter Proteine aus AWF kann eine Kontamination durch intrazelluläre Proteine, fehlgefaltete Produkte und zytoplasmatische Überreste vermeiden. Kurz gesagt, das Extraktionslipid gelangt unter Unterdruck durch die Spaltöffnungen in die Blätter, und das AWF wird durch schonende Zentrifugationaufgefangen 23. Während die Isolierung von AWF weit verbreitet ist, um den biologischen Fortschritt in Apoplast 24,25,26,27 zu untersuchen, wurde sie in pflanzlichen Produktionssystemen nicht genutzt.
Die Verbesserung der Pflanzenproduktivität und die Gewinnung hochreiner Zielproteine sind zentrale Herausforderungen für pflanzliche Produktionssysteme28. Typischerweise werden Proteine aus vollständig löslichen Pflanzenextrakten gereinigt, die große Mengen an intrazellulären Proteinen, fehlgefalteten und unmodifizierten Produkten und Cytochromenenthalten 29, was hohe Kosten für die anschließende Reinigungerfordert 30. Die Verwendung von AWF-Proteinextraktionsmethoden zur Extraktion exogener rekombinanter Proteine, die in Apoplasten sezerniert werden, kann die Homogenität rekombinanter Proteine effektiv verbessern und die Kosten für die Proteinreinigung senken. Hier verwenden wir ein Signalpeptid PR1a, um eine exogene Proteinsekretion in den Apoplastenraum zu ermöglichen und stellen eine detaillierte Methode zur rekombinanten Proteinreinigung aus dem AWF von N. benthamiana vor.
Die Verwendung von Pflanzen zur Herstellung therapeutischer Proteine hat in den letzten Jahren schnell zugenommen 1,2,3,4,5,6. Proteinkodierende Gene werden in Expressionsvektoren kloniert und über Agroinfiltration in pflanzliches Gewebe abgegeben. Nach der Produktion durch Pflanzenzellen werden Proteine für nachgelagerte A…
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wird unterstützt von der Youth Innovation Promotion Association CAS (2021084) und dem Key Deployment Project Support Fund des Dreijahresaktionsplans des Instituts für Mikrobiologie der Chinesischen Akademie der Wissenschaften.
100 mesh nylon fine mesh yarn | Guangzhou Huayu Trading limited company | hy-230724-2 | For AWF protein extraction |
50 ml centrifuge tubes | Vazyme | TCF00150 | For centrifuge |
ClonExpress II one step cloning kit | Vazyme | C112-02 | For clone |
FastDigest Sac1 | NEB | R3156S | For clone |
FastDigest XbaI | NEB | FD0685 | For clone |
ImageJ 1.5.0 | / | / | For greyscale analysis |
Large filter | Thermo Fisher | NEST | For filtering |
Laser scanning confocal microscopy | Leica SP8 | For subcellular localization | |
Ni sepharose excel | Cytiva | 10339806 | For protein purification |
Precast protein plus gel | YEASEN | 36246ES10 | For SDS-PAGE |
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Triton X-100 | SCR | 30188928 | To configure the extraction buffer |
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β-mercaptoethanol | SIGMA | BCBK8223V | To configure the extraction buffer |