Superabsorbent Polymer-based Autotrophic Systems에서 Arbuscular Mycorrhizal Cultures 접종 및 관찰
Summary
여기에서는 초흡수성 고분자 기반 독립 영양 시스템에서 arbuscular mycorrhizal fungi를 접종하고 관찰하기 위한 간단하고 저렴한 기술에 대해 설명합니다.
Abstract
Arbuscular mycorrhizal (AM) 곰팡이는 식물 뿌리 및 뿌리권에서의 번식과의 영구적 인 연관성으로 인해 조작 및 관찰이 어렵습니다. 전형적으로, AM 진균류는 독립영양 숙주를 이용한 냄비 배양에서 in vivo 조건 하에서 배양하거나 페트리 접시에서 Ri Transfer-DNA 형질전환 뿌리(종속영양 숙주)를 이용한 시험관 내 조건에서 배양한다. 또한 화분 배양에서 AM 곰팡이의 배양은 불투명하고 멸균되지 않은 환경에서 발생합니다. 대조적으로, 체외 배양은 멸균되고 투명한 환경에서 AM 곰팡이의 증식을 포함합니다. 최근 초흡수성 고분자 기반 독립영양 시스템(SAP-AS)이 개발되어 각각의 한계(불투명도 및 종속영양 숙주, 무균성)를 피하면서 두 방법의 장점을 결합하는 것으로 나타났습니다. 여기에서는 간편한 준비, 단일 포자 접종 및 SAP-AS에서 AM 곰팡이 관찰을 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 페트리 접시를 수정함으로써 살아있는 표본에 대한 고해상도 사진 및 비디오 관찰이 가능했는데, 이는 현재의 생체 내 및 체외 기술로는 어렵거나 불가능했을 것입니다.
Introduction
Arbuscular mycorrhizal (AM) 곰팡이 (Glomeromycotina)는 고대 식물 뿌리 공생체 (~ 500 Ma 1,2)로, 기관 식물에 의한 육상 토양의 식민지화에 필수적인 역할을 했을 수 있습니다. AM 균류와 기관 식물 사이의 이러한 오랜 공진화는 arbuscular mycorrhiza를 왕국 간 상호주의의 걸작으로 자리 매김합니다. AM 곰팡이 균사는 균근 네트워크를 통해 새로운 숙주로의 영양분 전달을 포함하여 토양 영양분을 찾는 숙주의 능력을 크게 증가시킨다4. 균사 네트워크는 토양 구조를 개선하고 글로말린의 생산은 토양 침식을 줄일 수 있습니다5. 대기 중 탄소의 일부가 곰팡이 뿌리 공생체로 전달되면 토양 탄소 격리가 증가합니다6. 전반적으로, AM 균류는 비생물적 및 생물학적 스트레스에 대한 식물의 회복력을 향상시키기 때문에 농생태학에서 상당한 주목을 받고 있다7. 실제로, AM 곰팡이 친화적인 농업 관리 관행은 작물 생산을 위한 화학 투입물 사용을 줄이고 토양 유기 탄소 함량을 개선할 수 있는 잠재력을 가지고 있으며, 이는 농부들이 지속 가능한 농업 관행으로의 전환과 기후 변화와의 싸움에 관한 국내 및 국제 약속을 준수하기 위해 관리 관행에 통합해야 하는 중요한 목표입니다.
그러나 AM 곰팡이는 토양 미세한 곰팡이이며, 그들의 의무적 인 생물 영양 및 뿌리권 분포로 인해 연구가 어렵습니다. 토양은 불투명도, 틈새의 엄청난 다양성 및 모든 규모의 다중 영양 상호 작용으로 인해 연구하기 가장 어려운 비오톱 중 하나입니다. 따라서 AM 곰팡이의 분리, 증식 및 특성화가 어렵습니다. 20세기 중반까지만 해도 포자(sporocarps)를 형성하는 AM 곰팡이 종만이 특징지어졌다8. 그러나 대부분의 AM 곰팡이 종은 직경이 ~ 20 μm에서 ~ 500 μm에 이르는 비 포자형 포자를 생산합니다. 토양 습식 체질 기술(wet sherving tech)9에 대한 설명은 이러한 AM 곰팡이 종을 설명할 수 있는 길을 열었고, 그 이후로 종 설명의 비율이 증가했다. 그럼에도 불구하고 AM 곰팡이는 Dikarya에 비해 작은 종의 그룹을 나타냅니다.
트랩 배양, 즉 포자 또는 터페이스 및 질석과 같은 고압멸균 물질로 채워진 냄비의 AM 곰팡이 포자와 숙주의 멸균된 종자(부추, 질경이)가 포함된 환경 토양 샘플로 접종하는 것은 통제된 조건에서 AM 곰팡이를 번식시키는 한 가지 방법이다10. 그러나 접종의 성공 여부는 염색 후 뿌리 조각에서 수목의 존재를 찾거나 포자를 분리하기 위해 하위 샘플 또는 전체 냄비를 습식 체로 걸러냄으로써만 평가할 수 있습니다. 일반적으로 냄비 배양을 분석하기 전에 최소 6-12주 동안 시스템을 방해하지 않는 것이 좋습니다. 이 배양 기술은 가장 잘 알려진 AM 진균 종을 증식하는 데 적합하지만 진균 공생체의 실시간 관찰은 불가능하며 특히 단일 포자 배양을 시도하는 경우 접종 성공 여부가 불확실합니다.
반대로, AM 진균의 시험관 내 증식은 배양 배지(11)의 투명성 덕분에 실시간으로 모니터링할 수 있지만, 이 배양 기술은 멸균 환경에서 작동하기 위해 형질전환된 뿌리의 가용성과 배양 배지 내 탄소의 존재를 필요로 한다. 포자는 멸균되어야 하며, 종속영양 숙주와의 결합과 함께 알려진 대부분의 AM 곰팡이 종은 이 기술을 사용하여 성공적으로 번식되지 않습니다.
따라서 현재 기술을 사용하여 AM 곰팡이를 번식시키는 것은 대부분의 실험실에서 확립되고 널리 사용되지만 AM 곰팡이 연구에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. Paré et al. (2022)12 는 AM 곰팡이를 증식시키기 위해 전체 식물과 함께 투명 초흡수성 폴리머(SAP)를 사용하는 생체 내 기술을 개발했습니다. SAP 기반 독립영양 시스템(SAP-AS)으로 설계된 이 기술은 간단하고 저렴하며 냄비 배양(독립영양 숙주와의 연관성, 비멸균 조건)과 체외 배양(투명 배지, 공생 발달의 실시간 모니터링)의 장점을 결합합니다. 여기에서는 단일 포자 접종으로 배양을 설정하고 라디칼 외 균사체의 고배율 관찰을 위해 SAP-AS를 사용하는 방법을 설명하는 프로토콜을 제시합니다. 구체적으로, 두 칸 페트리 접시를 수정하고, 영양 용액을 준비하고, 고흡수성 폴리머(SAP)를 준비하고, 묘목을 준비하고, SAP-AS를 조립하고, 단일 포자를 접종하고, 포자를 발아하고, 공생의 발달을 실시간으로 모니터링하는 방법을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
접종은 프로토콜에서 가장 중요한 단계이며, 압출 유리 파스퇴르 피펫은 무결성을 유지하면서 AM 곰팡이의 단일 포자를 정확하게 조작할 수 있는 탁월한 도구임이 입증되었습니다. 압출 유리 파스퇴르 피펫은 양초 또는 분젠 버너의 불꽃을 사용하여 쉽게 성형할 수 있으며, 피펫팅되는 포자의 크기에 맞게 실체현미경으로 개구부를 조정할 수 있습니다. AM 곰팡이 포자의 크기에 맞게 조정된 도구로 포자를 조작하고(보충 그림 1) 숙주 식물 뿌리가 포자가 침착된 Nitex 막에 도달할 수 있을 만큼 충분히 길면 SAP-AS를 접종하는 것이 중요합니다.
SAP-AS는 실험 요구사항에 쉽게 적응할 수 있습니다. 예를 들어, 밀접하게 관련된 균주 간의 상호 작용 또는 다른 종의 AMF 간의 상호 작용을 모니터링하거나 화학적 (pH) 또는 생물학적 환경 (선충, 박테리아, 곰팡이 도입)을 수정하기 위해 다중 구획과 함께 더 큰 페트리 접시를 사용할 수 있습니다. 다양한 진균 영양 숙주 식물을 사용하여 AM 곰팡이에 광합성을 제공 할 수 있습니다. 영양 용액 mMS-1은 Bécard and Fortin (1988)15 에 의해 기술된 최소(M) 배지 레시피에서 자당, 비타민 및 박토 한천을 뺀 탄소원을 제한하기 위해 파생되었습니다. 그러나 SAP-AS는 실험 목표에 따라 다양한 영양 용액으로 보충될 수 있습니다.
SAP-AS에서 AM 곰팡이가 번식하려면 정기적으로 물을 주어야 합니다. 질석과 SAP의 제한된 부피는 뿌리와 AM 곰팡이를 습도 변동에 노출시키며, 특히 표준 2칸 페트리 접시(직경 10cm)에서 그렇습니다. 확장 할 수있는 능력과 따라서 SAP 조직의 투명성은 시간이 지남에 따라 감소합니다. 실제로, 영양 용액에서 양이온의 존재는 아크릴레이트 네트워크의 확장을 점진적으로 제한하고 몇 달 후에 SAP를 교체해야 합니다. 또한 페트리 접시가 빛으로부터 제대로 보호되지 않거나 물을 과도하게 주면 시간이 지남에 따라 녹조류와 곰팡이가 자랄 수 있습니다.
현재까지 SAP-AS에서 7종의 AM 곰팡이가 성공적으로 배양되었는데, 이는 화분 배양에서 번식할 수 있는 AM 곰팡이 종의 수에 훨씬 못 미치는 수치입니다. 그러나 SAP-AS의 생물 및 비생물 조건은 모두 냄비 배양과 매우 유사하며 다른 AM 곰팡이 종도 SAP-AS에서 번식할 수 있어야 합니다. SAP-AS에서 포자를 직접 접종하면 비멸균 포자/씨앗을 접종에 사용하는 경우 뿌리 삼출물 및/또는 박테리아의 존재로 인해 자연 토양의 뿌리권에 더 가까운 환경 조건을 제공할 수 있습니다. 이것은 발아된 포자로 접종하는 것보다 선호되어야 합니다. 또한 AMF 내에서 포자 발아를 유발하는 조건은 여전히 잘 이해되지 않았으므로 mMS-1 영양 용액으로 수화된 SAP는 다른 AM 곰팡이 종의 포자를 발아하는 데 적합하지 않을 수 있습니다. mMS-1 영양 용액으로 수화된 SAP에서의 포자 발아는 R. irregularis inoculum만을 사용하여 접종 단계를 위한 생존 가능한 포자를 특이적으로 선택하기 위해 테스트되었습니다.
AM 공생의 발달에 대한 접종 및 모니터링은 SAP-AS에서 쉽게 수행할 수 있습니다. 수정 된 2 구획 페트리 접시는 다양한 AM 곰팡이 종의 재배를 허용합니다. Paré et al.12 는 6개 속과 3개 과에서 7개의 서로 다른 AMF 종을 번식시켰습니다. 2 칸 페트리 접시의 수정은 저렴한 도구로 쉽게 수행 할 수 있습니다. SAP-AS의 제조 및 유지보수에 필요한 재료(질석, SAP, 파스퇴르 피펫 등) 및 시약(mMS-1)의 비용과 수량이 제한되어 있어 최소한의 비용으로 많은 수의 SAP-AS를 관리할 수 있습니다. 또한 SAP-AS를 적층할 수 있어 냄비 배양에 비해 AM 진균 배양물의 발자국을 크게 줄일 수 있습니다. 예를 들어, 50개의 SAP-AS(10개씩 5개의 스택)가 1m 길이의 선반에 들어갈 수 있습니다(보충 그림 2). 이러한 기능 덕분에 SAP-AS는 고등학교 실험실 과정이나 대학의 학부 수준에서 AM 공생을 가르치는 데 적합한 간단하고 저렴한 기술입니다. 집락화된 SAP 곡물은 새로운 SAP-AS 또는 냄비 배양물을 접종하는 데 사용할 수 있습니다.
Petri 접시 바닥 뒷면에 커버슬립이 있으면 라디칼 이상의 곰팡이 구조에 대한 고해상도 사진 및 비디오가 가능합니다. 세포질 흐름은 자연 조건에 매우 가까운 생활 조건에서 쉽게 연구할 수 있습니다. 이는 균사체와 관련된 AM 곰팡이 기능(영양분, 물 수송, 토양 구조 등)에 대한 연구와 균사 형태 형성 연구에 매우 중요합니다.
AMF는 식물 뿌리와 뿌리권 내에서 생물학적 주기를 완료합니다. 토양 미생물에 대한 연구는 토양 환경을 관찰하는 데 내재된 어려움으로 인해 복잡합니다. SAP-AS의 주요 목표는 AM 곰팡이의 발달을 매우 자세히 관찰할 수 있는 기능을 유지하면서 AM 곰팡이의 번식을 위해 뿌리권과 가능한 한 유사한 환경을 재현하는 것입니다. 이는 멸균되지 않은 조건을 의미하기 때문에 부영양 미생물의 증식을 피하기 위해 사용 가능한 탄소의 양을 제한해야 합니다. 근권에서 AM 곰팡이의 행동에 대한 지식은 여전히 극히 제한적이며, SAP-AS는 급진적 외 환경에서 먹이를 찾는 능력, 포자 생산 및 뿌리 군집화와 관련하여 종 간의 자세한 비교를 할 수 있는 가능성을 제공합니다. 이는 박테리아, 선충류, 원생생물 및 뿌리 곰팡이 병원체와 같은 다른 토양 종과의 상호 작용을 추가하여 더욱 복잡해질 수 있으며, SAP-AS 덕분에 토양 미생물군 상호 작용에 대한 지식을 향상시킬 수 있습니다.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
제안해 주신 두 명의 익명의 검토자에게 감사드립니다. 이 연구를 위한 자금은 프로젝트 J-002295(AAFC의 생물학적 컬렉션 관리 및 향상)에 따라 캐나다 농업 농식품부(AAFC)에서 제공했습니다.
Materials
| 100 x 15 mm Stackable Bi-Plate | Kord Valmark | 1204U09 | https://www.thomassci.com/Laboratory-Supplies/Petri-Dishes/_/100-x-15-mm-Stackable-Bi-Plate |
| 12-well plate | Greiner Bio-one | 665180 | https://shop.gbo.com/en/row/products/bioscience/cell-culture-products/cellstar-cell-culture-multiwell-plates/665180.html |
| 18 mm round glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-100 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-cover-glasses-circles-11/12545100#?keyword=12-545-100 |
| 20 mL Syringe PP/PE without needle | Millipore Sigma | Z683620-100EA | https://www.sigmaaldrich.com/CA/en/product/aldrich/z683620?utm_source=google&utm_medium= cpc&utm_campaign=20674735406 &utm_content=157607444391&gc lid=Cj0KCQiA5rGuBhCnARIsAN11 vgQOT_WPRg9WFyBEyoO4b0x1 -F7Tks4houU7VTRS5EiYM9l0F-B oL7saAmFoEALw_wcB |
| Acupuncture needle | Lierre | A143-LP1-3075 | https://www.lierre.ca/products/lierre-plus-acupuncture-needles-100pcs?gad _source=1&gclid=Cj0KCQiA5rGuBh CnARIsAN11vgTwupmw51UTdR k9cKr4ewi12W3dyVikenzH3sjdUB4 g41G-_KnvppoaAkbTEALw_wcB& utm_campaign=PMax-needles&utm_content=shopify_CA_ 5213169090694_35001500991622 &utm_medium=cpc&utm_source= google&variant=35001500991622 |
| Blotting paper | FLINN | FB0678 | https://www.flinnsci.ca/blotting-paper-12-x-19-pkg.-of-10/fb0678/ |
| Commercial or scientific blender or kitchen hand blender | kitchenaid | KHBV53DG | https://www.kitchenaid.ca/en_ca/countertop-appliances/hand-blenders/hand-blender-products/p.variable-speed-corded-hand-blender.khbv53dg.html |
| Dremel 199 Carving Bit | Dremel | 2615000199 | https://www.dremel.com/ca/en/p/199-2615000199 |
| Dry SAP medium granulometry 1–2 mm | HORTA-SORB MD | 00810085242789 | https://www.horticulturalalliance.com/product/horta-sorb-md-granule/ |
| Feather Stainless-Steel Blades for Dissecting Knife Handles | Fisher Scientific | 08-916-5B | https://www.fishersci.ca/shop/products/graham-field-stainless-steel-blades-dissecting-knife-handles-8/089165b |
| Glass Pasteur pipettes 230 mm | Kimble | RK-25554-14 | https://www.coleparmer.ca/i/dwk-life-sciences-kimble-disposable-pasteur-pipettes-plugged-end-borosilicate-glass-230-mm-1000-cs/2555414 |
| Ink | Sheaffer | 94321 | https://www.amazon.com/Sheaffer-Skrip-Bottled-Black-94231/dp/B002IKKKUU |
| Melting guide: modified paint Scraper, 2-in | Mastercraft | #049-7335-8 | https://www.canadiantire.ca/en/pdp/mastercraft-carbon-steel-flexible-spackling-putty-knife-wall-paint-scraper-2-in-0497335p.0497335.html?loc=plp |
| Microscopy glass slide | Fisher Scientific | 12-552-5 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-frosted-microscope-slides-4/125525 |
| Nitex nylon mesh filter screen | Dynamic Aqua-Supply Ltd. | NTX30-108 | https://dynamicaquasupply.com/products/nitex-screen?_pos=1&_sid=ffc105328&_ss=r& variant=6945749106731 |
| Paper clip | Makanu | Clips-BK-41mm-24 | https://www.amazon.ca/classeur-standard-grandes-trombones-excellentes |
| Parafilm | Avantor/vwr | 470201-930 | https://www.avantorsciences.com/ca/en/product/8882964/parafilm |
| Plantago lanceolata seeds | ecoumene | NA | https://www.ecoumene.com/produit/semences/herbacees/plantain-lanceole-bio/ |
| Polyvinyl alcohol-lactic acid-glycerol (PVLG). | NA | NA | https://invam.ku.edu/recipes |
| Pyrography kit with fine tip | Walnut Hollow | 483103 | https://www.walnuthollow.com/collections/creative-wood-burning/products/walnut-hollow-creative-versa-tool |
| Silicone sealant | Aqueon | 100165003 | https://www.aqueon.com/products/aquariums/silicone-sealant |
| Surgeon scalpel handle | Fisher Scientific | 22-079657 | https://www.fishersci.ca/shop/products/surgical-design-scalpel-handles-blades/22079657#?keyword=scalpel |
| Two Speed Rotary Tool Kit | Dremel | 200-1/21 | https://www.dremel.com/ca/en/p/200-1-21-f0130200ah |
| Vermiculite | PRO-MIX | 4981110 | https://www.canadiantire.ca/fr/pdp/vermiculite-pro-mix-9-l-0597936p.0597936.html |
| X1000 Round Coverslip dia. 30 mm #1 (0.13–0.16 mm) | Fisher Scientific | 12164692 | https://www.fishersci.fi/shop/products/x1000-cover-slip-diam-30-mm-n-1-1/12164692 |
Referenzen
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