Summary

Pipeline für dreidimensionale multidimensionale anatomische Untersuchung des menschlichen Herzens

Published: June 28, 2024
doi:

Summary

Dieses Protokoll stellt eine umfassende Pipeline zur Analyse von Proben aus menschlichen Herzen dar, die sich über die mikroskopische und makroskopische Skala erstrecken.

Abstract

Die detaillierte Untersuchung von nicht versagenden menschlichen Herzen, die für eine Transplantation abgestoßen wurden, bietet eine einzigartige Möglichkeit, strukturelle Analysen auf mikroskopischer und makroskopischer Skala durchzuführen. Zu diesen Techniken gehören das Tissue Clearing (modifizierte Immunmarkierungs-gestützte dreidimensionale (3D) Bildgebung von Organen, die durch Lösungsmittel freigegeben wurden) und die immunhistochemische Färbung. Zu den mesoskopischen Untersuchungsverfahren gehören stereoskopische Dissektion und mikrocomputertomographische (CT) Scans. Zu den makroskopischen Untersuchungsverfahren gehören grobe Dissektion, Fotografie (einschließlich Anaglyphen und Photogrammetrie), CT und 3D-Druck des physisch oder virtuell präparierten oder ganzen Herzens. Vor der makroskopischen Untersuchung kann eine Druck-Perfusionsfixation durchgeführt werden, um die 3D-Architektur und die physiologisch relevante Morphologie des Herzens zu erhalten. Die Anwendung dieser Techniken in Kombination zur Untersuchung des menschlichen Herzens ist einzigartig und entscheidend für das Verständnis der Beziehung zwischen unterschiedlichen anatomischen Merkmalen wie koronaren Gefäßen und Myokardinnervation im Kontext der 3D-Architektur des Herzens. Dieses Protokoll beschreibt die Methoden im Detail und enthält repräsentative Ergebnisse, um die Fortschritte in der Erforschung der menschlichen Herzanatomie zu veranschaulichen.

Introduction

Da die Funktion der Form folgt, ist das Verständnis der Architektur des Herzens von grundlegender Bedeutung für das Verständnis seiner Physiologie. Obwohl zahlreiche Untersuchungen die kardiale Anatomie von der Mikro- bis zur Makroskala aufgedeckt haben 1,2,3, sind mehrere Fragen ungeklärt, insbesondere solche, die sich auf die menschliche Herzanatomie beziehen. Dies liegt zum Teil daran, dass grundlegende Studien, die sich auf die funktionelle Anatomie konzentrierten, im Allgemeinen Tierherzen verwendeten 4,5,6, die sich oft von menschlichen Herzen unterscheiden 1,7,8. Darüber hinaus neigt jede einzelne Studie, auch die mit menschlichen Herzproben, dazu, sich auf sehr spezifische Strukturen zu konzentrieren, was es schwierig macht, die Ergebnisse auf den Kontext des gesamten Herzens anzuwenden. Dies gilt umso mehr, wenn die fokussierten Strukturen auf Mikro- oder Mesoskalen liegen, wie z. B. der Perinexus9 und die ganglionierten Plexus10.

In diesem Zusammenhang bietet die systemische Strukturuntersuchung des menschlichen Herzens, das für eine Transplantation abgestoßen wurde, eine einzigartige und seltene Gelegenheit, einen umfassenden Atlas der kardialen Strukturen im Fokus über mikroskopische und makroskopische Skalen zu erhalten11. Zu den mikroskopischen Untersuchungsprotokollen gehören die Gewebereinigung (modifizierte Immunmarkierungs-fähige dreidimensionale (3D) Bildgebung von lösemittelfreigeschalteten Organen, iDISCO+)12,13 und die immunhistochemische Färbung. Zu den mesoskopischen Untersuchungsprotokollen gehören stereoskopische Dissektion, Makrofotografie und mikrocomputertomographische (CT) Scans. Zu den makroskopischen Untersuchungsprotokollen gehören die grobe Dissektion14, die Fotografie (einschließlich Anaglyphen und Photogrammetrie)15,16,17, die CT, die virtuelle Dissektion18 und der 3D-Druck des physisch oder virtuell präparierten oder ganzen Herzens17. Zur Vorbereitung der makroskopischen Untersuchung wird eine Druck-Perfusionsfixation durchgeführt, um die 3D-Architektur und die physiologisch relevante Morphologie des Herzens zu erhalten 14,19,20,21. Die kombinierte Anwendung dieser Techniken ist einzigartig und entscheidend, um unterschiedliche anatomische Merkmale im Kontext der 3D-Architektur des menschlichen Herzens zu korrelieren.

Da die Möglichkeit, eine nicht-pathologische menschliche Herzprobe zu erhalten, extrem begrenzt ist, maximiert ein hierin beschriebener Multiskalenansatz die Verwendung der Probe. Durch die Anwendung verschiedener Verfahren, die im Folgenden beschrieben werden, werden repräsentative Ergebnisse dem Leser veranschaulichen, wie die Ergebnisse für verschiedene Zwecke genutzt werden können, einschließlich der Entdeckung in der wissenschaftlichen Forschung11 (umfassende Analysen der kardialen Innervation, der Verteilung ganglionierter Plexus), der Verbesserung klinischer Verfahren (Simulation für chirurgische und interventionelle Ansätze) und der anatomischen Ausbildung (reale 3D-Demonstration der Herzanatomie).

Protocol

Diese Studie verwendete anonymisierte Gewebeproben, die von nicht versagenden menschlichen Spenderherzen entnommen wurden, und wurde vom Institutional Review Board der University of California, Los Angeles (UCLA) genehmigt. Es wurden Proben von nicht versagenden Herzen entnommen, die für eine Transplantation abgestoßen wurden. Die Herzen wurden druckperfundiert, in 4 % Paraformaldehyd (PFA) fixiert und vor der Gewebeverarbeitung mit den folgenden Methoden abgebildet. Abbildung 1 fasst das …

Representative Results

Untersuchungen im MikromaßstabDie Anwendung von Tissue Clearing ermöglicht die Bildgebung größerer Gewebemengen in 3D mittels konfokaler Mikroskopie. Im Herzen können Ganglien mit Herzneuronen und die neuronale Musterung der Myokardinnervation sichtbar gemacht werden (Abbildung 2). Abbildung 3 zeigt ein konfokales Bild des Myokards des linken Ventrikels des Menschen, immungefärbt für Nerven und glatte Muskelzellen. Es wird festgestell…

Discussion

Die vorliegende Studie zeigt die umfassende Pipeline zur Analyse von Proben, die aus ganzen menschlichen Herzen gewonnen wurden. Repräsentative Befunde zeigen mikro- bis makroskalige anatomische Untersuchungen, die routinemäßig an einem einzelnen Herzen durchgeführt werden. Da eine menschliche Herzprobe äußerst wertvoll ist, ist ein Multiskalenansatz ideal und effektiv, um keine Teile der Probe zu verschwenden, indem mehrere Protokolle für verschiedene Zwecke angewendet werden, einschließlich der Entdeckung in de…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken den Menschen, die ihre Körper für die Förderung von Bildung und Forschung gespendet haben. Wir danken der OneLegacy Foundation, die die Grundlage für die Gewinnung von Spenderherzen für die Forschung bildete. Wir danken auch Anthony A. Smithson und Arvin Roque-Verdeflor vom UCLA Translational Research Imaging Center (Department of Radiology) für ihre Unterstützung bei der CT-Datenerfassung. Dieses Projekt wurde vom UCLA Amara Yad Project unterstützt. Wir danken Dr. Kalyanam Shivkumar und Dr. Olujimi A. Ajijola für den Aufbau und die Pflege einer Pipeline für die Forschung im menschlichen Herzen. Wir danken unserer Research Operations Managerin, Amiksha S. Gandhi, für ihr Engagement bei der Unterstützung unserer Projekte. Diese Arbeit wurde durch die Unterstützung der NIH-Zuschüsse OT2OD023848 & P01 HL164311 und Leducq Grant 23CVD04 für Kalyanam Shivkumar, des American Heart Association Career Development Award 23CDA1039446 für PH und des UCLA Amara-Yad Project (https://www.uclahealth.org/medical-services/heart/arrhythmia/about-us/amara-yad-project) ermöglicht. Der in dieser Studie verwendete GNEXT microPET/CT-Scanner wurde durch einen NIH Shared Instrumentation for Animal Research Grant (1 S10 OD026917-01A1) finanziert.

Materials

1x Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich P3813
3D Viewer Microsoft
647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories 711-605-152
647 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories 713-605-147
AF Micro-NIKKOR 200 mm f/4D IF-ED lens Nikon
Anti-Actin, α-Smooth Muscle – Cy3 antibody Sigma-Aldrich C6198
Antigen Retrieval Buffer (100x EDTA Buffer, pH 8.0) Abcam ab93680
Anti-PGP9.5 (protein gene product 9.5) Abcam ab108986
Anti-TH (tyrosine hydrox ylase) Abcam ab1542
Anti-VAChT (vesicular acetylcholine transporter) Synaptic Systems 139 103
Benzyl ether Sigma-Aldrich 108014
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A4503-10G
Cheetah 3D printer filament (95A), 1.75 mm NinjaTek
Coverslip, 22 mm x 30mm, No. 1.5 VWR 48393 151
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories 711-165-152
Dichloromethane Sigma-Aldrich 270997-100ML
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D8418-500ML
Ethanol, 100% Decon laboratories 2701
Glycine Sigma-Aldrich G7126-500G
GNEXT PET/CT SOFIE Biosciences
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa Sigma-Aldrich H3149-50KU
Histodenz Sigma-Aldrich D2158-100G
Hydrogen peroxide solution Sigma-Aldrich H1009-500ML
Imaging software Zeiss ZEN (black edition)
Imaging software Oxford Instruments Imaris 10
iSpacer Sunjin Labs iSpacer 3mm
KIRI Engine KIRI Innovation
Laser scanning confocal microscope Zeiss LSM 880
LEAD-2 – Vertical & Multi-channels Peristaltic Pump LONGER
Lightview XL  Brightech
Methanol (Certified ACS) Fischer Scientific A412-4
Nikon D850 Nikon
NinjaTek NinjaFlex TPU @MK4 NinjaTek
Normal donkey serum Jackson ImmunoResearch Laboratories 017-000-121
Original Prusa MK4 3D printer Prusa Research
PAP pen Abcam ab2601
Paraformaldehyde, 32% Electron Microscopy Sciences 15714-S
Polycam Polycam
Primary antibody
PrusaSlicer 2.7.1 Prusa Research
SARA-Engine pita4 mobile LLC
Scaniverse Niantic
Secondary antibody
SlowFade Gold Antiface Mountant Invitrogen S36936
Sodium azide, 5% (w/v) Ricca Chemical Company 7144.8-32
SOMATOM Definition AS Siemens Healthcare
Standard Field Surgi-Spec Telescopes,  Designs for Vision
Stereomicroscope System SZ61 OLYMPUS
StereoPhoto Maker Free ware developed by Masuji Suto
Superfrost Plus Microscope Slides, Precleaned Fisher Scientific 12-550-15
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787-50ML
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416-100ML
Xylene Sigma-Aldrich 534056-4L
Ziostation2 Ziosoft, AMIN

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Diesen Artikel zitieren
Hanna, P., Mori, S., Sato, T., Xu, S. Pipeline for Multi-Scale Three-Dimensional Anatomic Study of the Human Heart. J. Vis. Exp. (208), e66817, doi:10.3791/66817 (2024).

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