Dieses Protokoll stellt eine umfassende Pipeline zur Analyse von Proben aus menschlichen Herzen dar, die sich über die mikroskopische und makroskopische Skala erstrecken.
Die detaillierte Untersuchung von nicht versagenden menschlichen Herzen, die für eine Transplantation abgestoßen wurden, bietet eine einzigartige Möglichkeit, strukturelle Analysen auf mikroskopischer und makroskopischer Skala durchzuführen. Zu diesen Techniken gehören das Tissue Clearing (modifizierte Immunmarkierungs-gestützte dreidimensionale (3D) Bildgebung von Organen, die durch Lösungsmittel freigegeben wurden) und die immunhistochemische Färbung. Zu den mesoskopischen Untersuchungsverfahren gehören stereoskopische Dissektion und mikrocomputertomographische (CT) Scans. Zu den makroskopischen Untersuchungsverfahren gehören grobe Dissektion, Fotografie (einschließlich Anaglyphen und Photogrammetrie), CT und 3D-Druck des physisch oder virtuell präparierten oder ganzen Herzens. Vor der makroskopischen Untersuchung kann eine Druck-Perfusionsfixation durchgeführt werden, um die 3D-Architektur und die physiologisch relevante Morphologie des Herzens zu erhalten. Die Anwendung dieser Techniken in Kombination zur Untersuchung des menschlichen Herzens ist einzigartig und entscheidend für das Verständnis der Beziehung zwischen unterschiedlichen anatomischen Merkmalen wie koronaren Gefäßen und Myokardinnervation im Kontext der 3D-Architektur des Herzens. Dieses Protokoll beschreibt die Methoden im Detail und enthält repräsentative Ergebnisse, um die Fortschritte in der Erforschung der menschlichen Herzanatomie zu veranschaulichen.
Da die Funktion der Form folgt, ist das Verständnis der Architektur des Herzens von grundlegender Bedeutung für das Verständnis seiner Physiologie. Obwohl zahlreiche Untersuchungen die kardiale Anatomie von der Mikro- bis zur Makroskala aufgedeckt haben 1,2,3, sind mehrere Fragen ungeklärt, insbesondere solche, die sich auf die menschliche Herzanatomie beziehen. Dies liegt zum Teil daran, dass grundlegende Studien, die sich auf die funktionelle Anatomie konzentrierten, im Allgemeinen Tierherzen verwendeten 4,5,6, die sich oft von menschlichen Herzen unterscheiden 1,7,8. Darüber hinaus neigt jede einzelne Studie, auch die mit menschlichen Herzproben, dazu, sich auf sehr spezifische Strukturen zu konzentrieren, was es schwierig macht, die Ergebnisse auf den Kontext des gesamten Herzens anzuwenden. Dies gilt umso mehr, wenn die fokussierten Strukturen auf Mikro- oder Mesoskalen liegen, wie z. B. der Perinexus9 und die ganglionierten Plexus10.
In diesem Zusammenhang bietet die systemische Strukturuntersuchung des menschlichen Herzens, das für eine Transplantation abgestoßen wurde, eine einzigartige und seltene Gelegenheit, einen umfassenden Atlas der kardialen Strukturen im Fokus über mikroskopische und makroskopische Skalen zu erhalten11. Zu den mikroskopischen Untersuchungsprotokollen gehören die Gewebereinigung (modifizierte Immunmarkierungs-fähige dreidimensionale (3D) Bildgebung von lösemittelfreigeschalteten Organen, iDISCO+)12,13 und die immunhistochemische Färbung. Zu den mesoskopischen Untersuchungsprotokollen gehören stereoskopische Dissektion, Makrofotografie und mikrocomputertomographische (CT) Scans. Zu den makroskopischen Untersuchungsprotokollen gehören die grobe Dissektion14, die Fotografie (einschließlich Anaglyphen und Photogrammetrie)15,16,17, die CT, die virtuelle Dissektion18 und der 3D-Druck des physisch oder virtuell präparierten oder ganzen Herzens17. Zur Vorbereitung der makroskopischen Untersuchung wird eine Druck-Perfusionsfixation durchgeführt, um die 3D-Architektur und die physiologisch relevante Morphologie des Herzens zu erhalten 14,19,20,21. Die kombinierte Anwendung dieser Techniken ist einzigartig und entscheidend, um unterschiedliche anatomische Merkmale im Kontext der 3D-Architektur des menschlichen Herzens zu korrelieren.
Da die Möglichkeit, eine nicht-pathologische menschliche Herzprobe zu erhalten, extrem begrenzt ist, maximiert ein hierin beschriebener Multiskalenansatz die Verwendung der Probe. Durch die Anwendung verschiedener Verfahren, die im Folgenden beschrieben werden, werden repräsentative Ergebnisse dem Leser veranschaulichen, wie die Ergebnisse für verschiedene Zwecke genutzt werden können, einschließlich der Entdeckung in der wissenschaftlichen Forschung11 (umfassende Analysen der kardialen Innervation, der Verteilung ganglionierter Plexus), der Verbesserung klinischer Verfahren (Simulation für chirurgische und interventionelle Ansätze) und der anatomischen Ausbildung (reale 3D-Demonstration der Herzanatomie).
Die vorliegende Studie zeigt die umfassende Pipeline zur Analyse von Proben, die aus ganzen menschlichen Herzen gewonnen wurden. Repräsentative Befunde zeigen mikro- bis makroskalige anatomische Untersuchungen, die routinemäßig an einem einzelnen Herzen durchgeführt werden. Da eine menschliche Herzprobe äußerst wertvoll ist, ist ein Multiskalenansatz ideal und effektiv, um keine Teile der Probe zu verschwenden, indem mehrere Protokolle für verschiedene Zwecke angewendet werden, einschließlich der Entdeckung in de…
The authors have nothing to disclose.
Wir danken den Menschen, die ihre Körper für die Förderung von Bildung und Forschung gespendet haben. Wir danken der OneLegacy Foundation, die die Grundlage für die Gewinnung von Spenderherzen für die Forschung bildete. Wir danken auch Anthony A. Smithson und Arvin Roque-Verdeflor vom UCLA Translational Research Imaging Center (Department of Radiology) für ihre Unterstützung bei der CT-Datenerfassung. Dieses Projekt wurde vom UCLA Amara Yad Project unterstützt. Wir danken Dr. Kalyanam Shivkumar und Dr. Olujimi A. Ajijola für den Aufbau und die Pflege einer Pipeline für die Forschung im menschlichen Herzen. Wir danken unserer Research Operations Managerin, Amiksha S. Gandhi, für ihr Engagement bei der Unterstützung unserer Projekte. Diese Arbeit wurde durch die Unterstützung der NIH-Zuschüsse OT2OD023848 & P01 HL164311 und Leducq Grant 23CVD04 für Kalyanam Shivkumar, des American Heart Association Career Development Award 23CDA1039446 für PH und des UCLA Amara-Yad Project (https://www.uclahealth.org/medical-services/heart/arrhythmia/about-us/amara-yad-project) ermöglicht. Der in dieser Studie verwendete GNEXT microPET/CT-Scanner wurde durch einen NIH Shared Instrumentation for Animal Research Grant (1 S10 OD026917-01A1) finanziert.
1x Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P3813 | |
3D Viewer | Microsoft | ||
647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-605-152 | |
647 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 713-605-147 | |
AF Micro-NIKKOR 200 mm f/4D IF-ED lens | Nikon | ||
Anti-Actin, α-Smooth Muscle – Cy3 antibody | Sigma-Aldrich | C6198 | |
Antigen Retrieval Buffer (100x EDTA Buffer, pH 8.0) | Abcam | ab93680 | |
Anti-PGP9.5 (protein gene product 9.5) | Abcam | ab108986 | |
Anti-TH (tyrosine hydrox ylase) | Abcam | ab1542 | |
Anti-VAChT (vesicular acetylcholine transporter) | Synaptic Systems | 139 103 | |
Benzyl ether | Sigma-Aldrich | 108014 | |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503-10G | |
Cheetah 3D printer filament (95A), 1.75 mm | NinjaTek | ||
Coverslip, 22 mm x 30mm, No. 1.5 | VWR | 48393 151 | |
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-165-152 | |
Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997-100ML | |
Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418-500ML | |
Ethanol, 100% | Decon laboratories | 2701 | |
Glycine | Sigma-Aldrich | G7126-500G | |
GNEXT PET/CT | SOFIE Biosciences | ||
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
Histodenz | Sigma-Aldrich | D2158-100G | |
Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | H1009-500ML | |
Imaging software | Zeiss | ZEN (black edition) | |
Imaging software | Oxford Instruments | Imaris 10 | |
iSpacer | Sunjin Labs | iSpacer 3mm | |
KIRI Engine | KIRI Innovation | ||
Laser scanning confocal microscope | Zeiss | LSM 880 | |
LEAD-2 – Vertical & Multi-channels Peristaltic Pump | LONGER | ||
Lightview XL | Brightech | ||
Methanol (Certified ACS) | Fischer Scientific | A412-4 | |
Nikon D850 | Nikon | ||
NinjaTek NinjaFlex TPU @MK4 | NinjaTek | ||
Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 017-000-121 | |
Original Prusa MK4 3D printer | Prusa Research | ||
PAP pen | Abcam | ab2601 | |
Paraformaldehyde, 32% | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
Polycam | Polycam | ||
Primary antibody | |||
PrusaSlicer 2.7.1 | Prusa Research | ||
SARA-Engine | pita4 mobile LLC | ||
Scaniverse | Niantic | ||
Secondary antibody | |||
SlowFade Gold Antiface Mountant | Invitrogen | S36936 | |
Sodium azide, 5% (w/v) | Ricca Chemical Company | 7144.8-32 | |
SOMATOM Definition AS | Siemens Healthcare | ||
Standard Field Surgi-Spec Telescopes, | Designs for Vision | ||
Stereomicroscope System SZ61 | OLYMPUS | ||
StereoPhoto Maker | Free ware developed by Masuji Suto | ||
Superfrost Plus Microscope Slides, Precleaned | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ML | |
Xylene | Sigma-Aldrich | 534056-4L | |
Ziostation2 | Ziosoft, AMIN |