局部弹性蛋白酶和口服 β-氨基丙腈联合小鼠高级腹主动脉瘤建模

动物规程由威斯康星大学麦迪逊分校机构动物护理和使用委员会 （M005792） 批准。 1. 动物维护 在标准维护食物上饲养老鼠。使用成年小鼠或年轻成年小鼠 （8-12 周龄）。注意：使用成体可确保动物完全成熟，并限制主动脉直径变化可能与动物生长有关的任何机会。在这项研究中，我们使用了手术时年龄为 22-24 周的雄性和雌性 C57BL/6J 小鼠。Lu 及其同事未观察到年轻和老年小鼠之间的动脉瘤反应存在显著差异8。此外，虽然大多数动脉瘤建模是在雄性小鼠中进行的，但该模型成功地在雄性和雌性小鼠中诱导了 AAAs9。 确定研究持续时间并将动物分配到治疗组或假（对照）组。给治疗组小鼠施用 0.2% BAPN 饮用水，并让它们进行手术，局部施用活性弹性蛋白酶到肾下主动脉。给对照动物施用未经处理的水，并将它们进行手术，将变性弹性蛋白酶应用于肾下主动脉。 2. 开始使用补充 B-氨基丙腈 （BAPN） 的饮用水 手术前两天，在 0.2% BAPN 饮用水中开始治疗小鼠。制备大量 BAPN 水，并在 4 °C 的黑暗中储存长达 28 天。在给老鼠喂食之前，请确保 BAPN 水达到室温。注意：我们建议在整个研究期间每 7 天更换一次笼子中的 BAPN 水。 3. 手术当天准备材料 将手术手套剪成 5 mm x 10 mm 的条状，稍后用于帮助在用弹性蛋白酶处理之前隔离主动脉。通过在手术单的中心切一个 ~ 1.5 cm x 3 cm 大小的椭圆形来准备手术单。展开 2 英寸 x 2 英寸的纱布并切成两半，制成大约 2.5 厘米 x 10 厘米的纱布条，以便稍后用于缩回腹内容物。高压灭菌所有手术器械（参见 材料表）并设置无菌手术区域，如图 1 中的示例所示。 图 1：为 AAA 的弹性蛋白酶/BAPN 小鼠模型做准备的无菌手术设置示例。 缩写：BAPN = ß-氨基丙腈;AAA = 腹主动脉瘤。 请单击此处查看此图的较大版本。 将干净的笼子放在加热灯下，并将盐水放在灯附近以加热至体温 （37 °C），以准备术后恢复笼。确保加热灯安全放置，使回收笼和盐水温暖但不超过 37 °C。 打开水泵，开始通过加热垫循环温水。 4. 动物手术准备 将小鼠置于诱导室中，并使用低流量电子蒸发器以 200 mL/min 的速度用 5% 异氟醚麻醉它们。麻醉后，称量每只小鼠并皮下注射 0.6 mg/kg 丁丙诺啡缓释剂和 20 mg/kg 卡洛芬用于镇痛。使用电动毛发修剪器夹住腹部的毛皮，从下腹部到剑突的下部。使用纱布或实验室湿巾刷掉多余的毛发。将小鼠放回笼子中，等待至少 20 分钟让镇痛生效，然后再进行手术。 镇痛后至少 20 分钟后，将小鼠置于麻醉诱导室中，并使用低流量电子蒸发器再次以 200 mL/min 的速度输送 5% 异氟醚，直至小鼠被镇静。 从诱导室中取出镇静小鼠，并将其仰卧在手术区域上。涂抹眼部凝胶并用手术胶带固定鼻锥。以 50 mL/min 的速度将递送的吸入异氟醚降至 1-2% 的维持率。用手术胶带固定鼠标的前爪和后爪。 检查小鼠的小腹是否有膀胱。用拇指、食指和中指轻轻地对膀胱施加外部压力以诱导排尿;同时，用一块纱布吸走尿液。注意： 小心不要污染手术区域。 首先用含碘或洗必泰的磨砂膏和棉签用 70% 的酒精对腹部进行消毒。从腹部中央开始，以圆周运动 3 倍向外进行。在两次应用之间让该区域短暂干燥。 检查是否缺乏脚趾捏合反应，以确保麻醉充分。确保鼻锥和四肢固定。将手术单放在鼠标上，开口直接位于手术准备的腹部上。注意：请勿在鼠标上拖动窗帘，以避免潜在的污染。 5. 手术诱导 AAA 进入腹腔：洗手并戴上干净的丁腈或无菌外科手套。在接触手术区域之前，请务必在手套上喷洒 70% 乙醇，并将戴手套的手揉搓至干燥。 使用钝镊子在中线腹部的皮肤上搭帐篷。用手术剪刀在皮肤上划一个小口，然后纵向延长切口，大约 2-3 厘米长。 使用镊子抬起直肌，以识别半透明的白线。用剪刀通过白线进入腹腔，然后沿着白线向近端和远端延伸。 暴露腹主动脉：用温盐水蘸湿一条纱布和两根棉签。将纱布的一端紧紧卷成一半，留下一条宽大的尾巴，制作腹部卷。 使用皮肤牵开器回缩右腹壁。 使用湿润的棉签，轻轻地将小肠和大肠扫到左上腹，进行右内侧内脏旋转，并观察主动脉和下腔静脉 （IVC）。使用腹部卷将肠道缩回视野之外 – 将纱布卷起的一端塞入肠道下方，然后将尾端绕出身体，轻轻地包裹肠道。轻轻拉紧纱布的尾部，使肠道远离视野。调整腹卷和皮肤牵开器以获得腹膜后器官的最佳视图，如图 2A 所示。注意：腹卷有助于保持肠道湿润并防止其被手术器械意外损坏。确保纱布在手术过程中保持湿润，以防止肠道干燥。小心不要用力缩回肠道，因为这会导致肠系膜上动脉和肠脉管系统扭结，从而可能导致缺血性损伤。此外，最初清扫小肠时，要小心大肠和下肝（肝结肠韧带）之间的薄半透明附件，如果不小心，很容易撕下肝包膜并导致出血。如果在回缩过程中这条韧带有张力，请用剪刀将其急剧分开。 图 2：腹部回缩的表示和小鼠肾下主动脉暴露的最佳手术视图。 （A） 放置纱布腹卷有助于回缩腹腔内器官，而相对的牵开器有助于提供腹膜后可视化。将无菌手术单 （透明以显示动物方向） 放在麻醉的动物上，以帮助保持无菌。（B） 腹膜后筋膜（绿色框）前部覆盖主动脉。（C） 腹膜后筋膜夹层后肾下主动脉的示例。主动脉与 IVC 的分离可以通过从主动脉和 IVC 之间的潜在空间开始，该空间位于左肾静脉的远端，因为它向前穿过（黄色圆圈）。缩写：IVC = 下腔静脉。 请单击此处查看此图的较大版本。 肾下主动脉的周向夹层和分离术：确认 IVC 和肾下主动脉在全视野中。首先进入并分开腹膜后 （RP） 筋膜，开始暴露主动脉（图 2B）。确定沿肾下前主动脉平行的性腺（睾丸或卵巢）动脉（图 2B 和 图3）。使用镊子钝地分开性腺动脉之间的筋膜，并继续纵向向前暴露主动脉（图 2C）。注意：RP 筋膜是一层薄而半透明的结缔组织，包含淋巴管和内脏神经丛。有必要通过 RP 筋膜解剖以暴露主动脉。但是，不要通过主动脉外膜的结缔组织进行解剖。外膜（白色结缔组织）的撕裂会暴露出介质（呈亮红色），一旦应用弹性蛋白酶，主动脉可能会在该部位破裂。 接下来，开始将腹主动脉从 IVC 中分离出来。从 IVC 和主动脉之间的一个小间隙开始解剖，该间隙位于左肾静脉穿过主动脉时下缘的正下方（图 2C）。使用镊子的尖端轻轻地分开主动脉和 IVC 之间的结缔组织纤维，并继续在此水平围绕主动脉周向工作。注意：IVC 壁非常薄，通过一层细小的纤维结缔组织紧密粘附在主动脉上。小心避免处理 IVC 或尽可能清洁 IVC。首先从 IVC 上解剖主动脉的右侧（然后再从周围的肌肉组织中解剖主动脉的左侧）将有助于主动脉从 IVC 上“脱落”。 继续直截了当地解剖主动脉和 IVC 之间的平面，向主动脉分叉处尾部工作。一旦到达主动脉分叉处，就停止进一步的远端夹层。注意：在解剖肠系膜下动脉 （IMA） 周围时要格外小心，IMA 通常位于肾下主动脉中段附近，并横向穿过 IVC。 一旦主动脉的右缘与 IVC 分离，向近端返回到左肾静脉的水平。从主动脉左外侧缘解剖 RP 筋膜，沿周周工作，直到主动脉完全隔离。有关腹膜后夹层的相关解剖结构，请参见 图 3 。注意：仔细解剖主动脉后面，因为腰静脉和动脉的位置和数量变化很大。有关这种解剖出血风险高的区域的参考，请参见 图 4 。 仔细检查主动脉是否尽可能与 IVC 和周围肌肉组织圆周隔离，仔细解剖由 IMA 和腰动脉拴系的主动脉段周围。 沿着主动脉的左右边缘放置一条手套，如图 5A 所示。尝试尽可能多地覆盖 IVC。 使用手持式卡尺测量最宽的主动脉直径并记录 3 次测量结果。在测量前后用 70% EtOH 喷洒卡尺的尖端。避免用卡尺尖端直接接触主动脉，以防止污染。注意：也可以使用使用经过校准的相机显微镜拍摄的照片。 图 3：小鼠下腹部、骨盆和腹膜后血液供应的解剖结构。 缩写： R = right;L = 左。 请单击此处查看此图的较大版本。 图 4：腹膜后夹层和肾下主动脉周向隔离期间损伤和出血高风险部位。 缩写： L = 左;IMA = 肠系膜下动脉。 请单击此处查看此图的较大版本。 图 5：弹性蛋白酶/BAPN 小鼠 AAA 模型期间对弹性蛋白酶应用或假手术的术中反应。 （A） 在应用弹性蛋白酶之前，将手套段沿主动脉的长度放置，以帮助保护 IVC 和肠道免受弹性蛋白酶的影响，同时保持主动脉浸泡在弹性蛋白酶中 （B） 应用变性弹性蛋白酶不会导致主动脉扩张（蓝色框）。最大主动脉直径在基线时测得 0.627 mm，然后在局部变性弹性蛋白酶 5 min 后测得 0.607 mm。（C） 治疗 5 分钟后应用弹性蛋白酶导致主动脉扩张。在这个例子中，主动脉（绿色）从 0.607 毫米扩张到 0.953 毫米，直径增加了 57%。缩写：BAPN = ß-氨基丙腈;AAA = 腹主动脉瘤。 请单击此处查看此图的较大版本。 弹性蛋白酶应用：使用棉签轻拍主动脉上多余的血液或液体。 接下来，将一块 10 毫米 x 2 毫米的干纱布放在主动脉顶部。使用移液管分配 5 μL 弹性蛋白酶（或对照变性弹性蛋白酶）以使纱布和主动脉饱和。轻轻地将手套的碎片折叠在主动脉周围。注：要制备用于假组或对照组的变性弹性蛋白酶，请将弹性蛋白酶在 100 °C 下煮沸 30 分钟。 让弹性蛋白酶作用于主动脉 5 分钟。在此潜伏期内，如果需要，释放腹卷和皮肤牵开器施加的一些张力。注意：由于弹性蛋白酶的批量效应，我们鼓励研究人员在给定研究中的所有实验中使用同一瓶弹性蛋白酶。对于每一瓶新的弹性蛋白酶，我们建议进行剂量反应，以确保没有大量的早期破裂（4 周之前）。弹性蛋白酶应用的持续时间也可以在 4 到 6 分钟之间调整，具体取决于对弹性蛋白酶的反应。 5 分钟后，重置肠道回缩并展开手套的碎片。用 1 mL 温热的 0.9% 无菌生理盐水冲洗腹腔，同时小心地去除主动脉上的纱布和手套碎片。用 10 厘米 x 10 厘米的纱布吸收腹部的盐水。重复冲洗腹部，总共 3 x 3 mL。 使用手持式卡尺重新测量弹性蛋白酶应用后最宽的主动脉直径并记录 3 倍。参见图 5B，C 有关用假和活性弹性蛋白酶治疗的主动脉扩张的例子。注意：弹性蛋白酶前后的三次测量值的平均值可用于计算治疗后主动脉直径的百分比变化。通常，弹性蛋白酶处理后立即出现明显的扩张 ~30-50%，这有助于确保弹性蛋白酶功能正常且主动脉得到充分治疗。主动脉的直径不应随着变性弹性蛋白酶的应用而改变，或者尺寸可能略小（可能是由于痉挛）。 腹腔闭合：小心地从肠道下方取出腹卷并排出体外。如果需要，在肠道中涂抹额外的盐水，以防止在取出时粘在腹卷上。检查以确保肠道呈粉红色并充分灌注。注意：没有必要尝试将肠道重新定位回其原始位置;尝试这样做可能会有肠扭动或内疝的风险。 使用正在运行的 5-0 不可吸收单丝缝合线重新接近腹部筋膜。用 3-4 个皮肤钉缝合皮肤。 6. 术后动物护理 将鼠标放入带有加热灯的恢复笼中。确保笼子的温度是温暖的，而不是热的。 给予 0.5-1 mL 0.9% 生理盐水的皮下液体推注。 让鼠标在温暖的笼子中自行恢复 ~20 分钟，直到按照机构方案激活，然后返回笼子。 根据机构方案，术后第 1 天手术后 24 小时施用卡洛芬 20 mg/kg，并每天持续 3 天。 7. 主动脉测量和组织收获 使用异氟醚和宫颈脱位实施安乐死后，重新打开腹腔。通过胸骨延伸切口以进入胸部。切除右心房，在 2 分钟内用 10 mL 冷的 1% DPBS 溶液灌注左心室。切除肺、肝和脾。注意：小心不要伤到肠道;肠道内容物溢出会影响组织分析。 如上所述，暴露腹主动脉，并测量最大肾下主动脉直径。继续解剖整个主动脉和心脏。一旦心脏和主动脉被分离，切开所有动脉分支和髂总动脉，在主动脉上留下完整的短段。将心和主动脉放在标尺和图像旁边的对比色背景上。 8. 数据分析和报告 为了帮助解决人为错误，使用手持式卡尺时，每次测量主动脉直径至少 3 次，然后将直径报告为平均值。 将 AAA 定义为健康主动脉直径增加 50%。确保在研究结果中包括总主动脉直径和直径百分比变化。