Modelagem Avançada de Aneurisma da Aorta Abdominal em Camundongos por Combinação de Elastase Tópica e ß-aminopropionitrila Oral
Summary
Este protocolo descreve uma abordagem cirúrgica metódica para modelar aneurismas avançados da aorta abdominal em camundongos por uma combinação de aplicação direta de elastase na aorta infrarrenal e administração de ß-aminopropionitrila através da água potável.
Abstract
O modelo murino de elastase tópica de aneurisma da aorta abdominal (AAA) é aprimorado quando combinado com água potável suplementada com ß-aminopropionitrila (BAPN) para produzir de forma confiável aneurismas infrarrenais verdadeiros com comportamentos que imitam AAAs humanos. A aplicação tópica de elastase na adventícia da aorta infrarrenal causa dano estrutural às camadas elásticas da parede aórtica e inicia a dilatação do aneurisma. A co-administração de BAPN, um inibidor da lisil oxidase, promove a degeneração sustentada da parede, reduzindo a reticulação de colágeno e elastina. Essa combinação resulta em grandes AAAs que se expandem progressivamente, formam trombo intraluminal e são capazes de se romper. O refinamento de técnicas cirúrgicas, como o isolamento circunferencial de todo o segmento aórtico infrarrenal, pode ajudar a padronizar o procedimento para uma aplicação consistente e completa da elastase pancreática suína, apesar dos diferentes operadores e variações anatômicas entre os camundongos. Portanto, o modelo elastase/BAPN é uma abordagem refinada para induzir cirurgicamente AAA em camundongos, o que pode recapitular melhor os aneurismas humanos e fornecer oportunidades adicionais para estudar o crescimento do aneurisma e o risco de ruptura.
Introduction
Um aneurisma é definido como uma dilatação patológica de um vaso sanguíneo maior que 50% do diâmetro do vaso saudável1. Apesar de os aneurismas da aorta abdominal (AAA) serem uma condição comumente encontrada na população idosa, com incidência de cerca de >5% dos homens > 65 anos de idade, não existem estratégias terapêuticas direcionadas para o tratamento do AAA1. O tratamento atual do AAA é limitado à redução dos fatores de risco e reparo cirúrgico com cirurgia aberta ou endovascular com base no diâmetro da aorta ou na taxa de crescimento2. O maior perigo do AAA é a ruptura do aneurisma, que é fatal se não for tratada, e o reparo nesse cenário emergente pode acarretar riscos de mortalidade acima de 90%1.
A fisiopatologia do AAA é complicada, multifatorial e não totalmente compreendida3. As características do AAA humano incluem dilatação aneurismática verdadeira da parede aórtica com infiltração de células inflamatórias, presença de trombo intraluminal e dilatação progressiva que leva a eventual ruptura 3,4. Além disso, os AAAs estão associados à idade avançada, têm predominância sexual masculina:feminina de 9:1 e ocorrem mais comumente na aorta infrarrenal5. Modelar todas as características e comportamentos de AAAs humanos em animais continua sendo um desafio contínuo6.
A modelagem atual do AAA é conduzida principalmente em camundongos, e os aneurismas são comumente induzidos usando um dos três métodos – por infusão de angiotensina II (AngII) por meio de uma bomba osmótica implantada por via subcutânea e por aplicação direta de cloreto de cálcio (CaCl2) ou elastase na aorta7. Neste último método, a elastase pancreática suína (PPE) é aplicada a um segmento da aorta infrarrenal e causa degradação enzimática das fibras de elastina dentro da lamela elástica da túnica média. Esse dano estrutural resulta no enfraquecimento da parede aórtica e na dilatação externa do aneurisma. O uso de elastase tópica isoladamente, no entanto, produz aneurismas infrarrenais relativamente pequenos, que não aumentam ou se rompem progressivamente ao longo do tempo. Mais recentemente, Lu et al. melhoraram esse modelo administrando adicionalmente β-aminopropionitrila (BAPN), um inibidor irreversível da lisil oxidase, a seus camundongos tratados com elastase8. Ao impedir a reticulação das fibras de elastina e colágeno, a suplementação de BAPN faz com que as aortas danificadas por elastase se dilatem progressivamente até o ponto de ruptura. O modelo elastase/BAPN também tem uma taxa de incidência de AAA maior do que o modelo de elastase tópica, e os aneurismas produzidos também são maiores e contêm trombo intraluminal8.
No modelo elastase/BAPN, o grau de dissecção cirúrgica e a exposição da aorta à elastase podem impactar no sucesso e na replicabilidade desse modelo. Neste manuscrito, descrevemos que a administração concomitante de água potável do BAPN e a aplicação tópica de elastase na aorta após o isolamento circunferencial de todo o segmento aórtico infrarrenal melhora a replicabilidade, explica as diferenças anatômicas entre os animais e resulta em uma maior taxa de indução de AAA, tamanhos de aneurismas e incidência de ruptura. Neste artigo, descreveremos uma abordagem padronizada para induzir de forma confiável aneurismas avançados da aorta abdominal em camundongos usando uma combinação de água suplementada com elastase tópica e BAPN.
Protocol
Representative Results
Discussion
Compreender a complexa fisiopatologia do AAA é fundamental para melhorar o manejo da doença do aneurisma da aorta. Embora novas estratégias sejam ativamente desenvolvidas para melhorar os resultados cirúrgicos, os AAAs continuam prevalentes em nossa sociedade em envelhecimento e a ruptura do aneurisma continua sendo uma das principais causas de morte nos Estados Unidos10. Portanto, as necessidades não atendidas nas estratégias de detecção, prevenção e tratamento do AAA justificam mais pesquisas fundamentais sobre aneurismas11.
Modelos animais que recapitulam com precisão e eficiência as características e comportamentos dos AAAs humanos são essenciais para estudos mecanicistas da fisiopatologia do aneurisma e identificação de potenciais alvos terapêuticos. Embora os modelos animais atuais possam imitar os principais aspectos das alterações aneurismáticas que ocorrem na doença humana, nenhum modelo representa totalmente a verdadeira complexidade dos AAAs humanos. Atualmente, os camundongos são as espécies mais amplamente aceitas para modelagem de AAA animal. Os pesquisadores devem considerar os vários pontos fortes e fracos de cada modelo murino para seu estudo de aneurisma específico, como aqueles habilmente descritos nas revisões de Daugherty et al. e Busch et al.12,13.
O uso de elastase para induzir AAA em roedores foi descrito pela primeira vez por Anidjar et al. em 199014. A perfusão da aorta com elastase pancreática suína usando uma bomba de seringa cria uma dilatação inicial aproximadamente entre 50% e 70%, e os segmentos dilatados demonstram favoravelmente características patológicas semelhantes aos AAAs humanos, como degeneração medial e inflamação adventícia. O modelo clássico de perfusão, no entanto, é indiscutivelmente o modelo de aneurisma tecnicamente mais desafiador, e os aneurismas que normalmente são formados na segunda semana começam a se resolver gradualmente a partir de então. Bhamidipati et al. em 2012 demonstraram que a aplicação adventícia de elastase também poderia induzir com sucesso aneurismas semelhantes que são mais reprodutíveis no tamanho15. Um modelo muito menos desafiador, o modelo de elastase tópica tornou-se amplamente adotado na pesquisa de aneurismas. A metodologia adicional e as vantagens do modelo de elastase tópica são discutidas no artigo de métodos de Xue e colegas16.
O modelo elastase/BAPN de AAA murino foi desenvolvido por Lu e colegas em 20178. A introdução de água potável BAPN a 0,2% melhorou muitas das críticas ao modelo clássico de elastase tópica, agora produzindo aneurismas que se expandem continuamente até o ponto de ruptura do AAA. Em seu estudo de 2017, eles demonstraram que os camundongos no grupo tratado com elastase / BAPN tinham taxas de formação de AAA significativamente mais altas em comparação com o grupo elastase (93% vs 65%, P 800% do diâmetro basal e formaram trombo intraluminal (53,8%), e 46,2% se romperam espontaneamente antes do final do experimento. Este modelo permitiu que os pesquisadores investigassem fatores que podem afetar a progressão e a estabilidade do aneurisma ao longo do tempo.
Berman et al. exploraram ainda mais o modelo elastase/BAPN, variando a concentração de elastase tópica, a duração do estudo, o momento da administração do BAPN e o impacto do sexo do animal9. O tratamento com 5 μL de elastase concentrada mais alta (5 mg/mL ou 10 mg/mL) produziu aneurismas maiores que 2,5 mg/mL em 56 dias. A prevalência da formação de trombos intraluminais também dependeu da concentração de elastase, que ocorreu em 28,6% dos camundongos tratados com 5 mg / mL e 62,5% dos camundongos tratados com 10 mg / mL. Eles também demonstraram que o modelo elastase/BAPN pode induzir aneurismas em camundongos fêmeas. Embora apenas alguns camundongos fêmeas tenham sido estudados (n = 5), eles descobriram que os aneurismas nas fêmeas eram mais propensos à ruptura (2 de 5 camundongos) e eram significativamente maiores do que os AAAs machos em 56 dias.
Neste artigo, pretendemos fornecer um método para abordar uma das maiores limitações da modelagem cirúrgica, que é a variação no procedimento cirúrgico. Sem um consenso claro sobre o grau de dissecção e a área da aorta tratada com elastase, os resultados desse modelo podem variar drasticamente entre animais, pesquisadores e instituições. Observamos inúmeras variações anatômicas entre camundongos, incluindo o número e o tamanho das artérias e veias lombares, a localização da AIM, a decolagem da veia gonadal esquerda, entre outras, o que pode ser limitante ao tentar tratar apenas uma porção ou segmento específico da aorta infrarrenal. Aqui, demonstramos que a dissecção circunferencial de todo o comprimento da aorta infrarrenal da artéria renal esquerda proximalmente à bifurcação aórtica distalmente ajuda a fornecer graus reprodutíveis de exposição aórtica, apesar das diferenças anatômicas, ao mesmo tempo em que aumenta o sucesso da indução do aneurisma e fornece limites claros para o operador. Além disso, o tamanho e a posição mais anterior da VCI tendem a cobrir a maior parte da aorta, o que pode afetar a quantidade de aorta tratada se não for isolada da VCI. Embora seja necessário remover a fáscia retroperitoneal para expor a aorta, é importante não dissecar totalmente o tecido conjuntivo da adventícia da aorta e expor qualquer uma das camadas médias, pois isso geralmente resulta em ruptura durante o período de incubação da elastase de 5 minutos. Isso pode servir como um controle interno adicional para o grau de dissecção com este modelo, mas pode ser uma curva de aprendizado frustrante ao adotar este modelo. Além disso, os operadores aprenderão áreas de maior risco (Figura 4) que podem ser facilmente feridas durante a cirurgia e levar a hemorragia incontrolável.
Embora seja importante que as etapas processuais deste modelo sejam consistentes, a duração do estudo e o momento da ultrassonografia intervalada podem variar dependendo do objetivo da pesquisa. A dilatação da aorta começa imediatamente com a aplicação de elastase, mas os estudos que usam esse modelo geralmente acompanham camundongos por 28 dias após a cirurgia7, como neste experimento de exemplo. A extensão da duração do estudo deve ser considerada ao estudar AAAs avançados, crescimento em longo prazo, formação de trombo intraluminal ou ruptura.
Medidas perioperatórias adicionais, como manter a temperatura corporal do animal e o estado de hidratação, podem ajudar a melhorar a sobrevivência animal desse procedimento invasivo. O uso de uma almofada de aquecimento durante a cirurgia e a colocação em uma gaiola de recuperação quente podem ajudar a evitar a hipotermia. A solução salina deve ser aquecida antes de ser usada para irrigar a cavidade abdominal. Um bolus de fluido subcutâneo logo após a cirurgia pode ser responsável por perdas insensíveis de fluido durante a operação e ajudar o animal a manter a hidratação adequada durante a fase de recuperação imediata. Com manuseio cuidadoso do tecido e uma abordagem metódica consistente, o modelo elastase/BAPN pode ser realizado por um operador experiente entre 30 min e 45 min por camundongo e produzir AAA de forma confiável com complicações perioperatórias muito baixas.
Nossos resultados demonstram que a combinação de NIAB associada à dissecção circunferencial da aorta infrarrenal antes da aplicação da elastase produz AAAs grandes e em contínua expansão, com maiores diâmetros e incidência de ruptura em períodos mais curtos. Neste experimento, os AAAs foram induzidos com sucesso em todos os camundongos machos (6 de 6) e fêmeas (6 de 6) tratados com elastase ativa. A exposição à elastase por 5 minutos resultou em um aumento imediato no diâmetro da aorta em cerca de 30-40%, o que é útil para confirmar a aplicação bem-sucedida e consistente de elastase entre os grupos de tratamento. Semelhante a Berman et al., mostramos que este modelo pode induzir AAAs em camundongos fêmeas, que também têm uma resposta de ruptura maior do que os machos. Metade dos camundongos fêmeas (3 de 6) se rompeu em 28 dias, em comparação com 0 de 6 dos machos, no entanto, os camundongos fêmeas pesam menos que os machos. Os camundongos machos demonstraram um aumento no diâmetro do AAA em 257% em comparação com -4% dos controles machos, enquanto as fêmeas sobreviventes mostraram um aumento de 417% no diâmetro, em comparação com -16% dos controles femininos. Os diâmetros da aorta não foram significativamente diferentes entre os camundongos machos e fêmeas sobreviventes tratados aos 28 dias devido ao maior número de rupturas no grupo feminino. Especulamos que os camundongos simulados exibem diâmetros aórticos menores ao final do estudo, pois a aorta tende a se dilatar ligeiramente durante a dissecção inicial e, em seguida, forma tecido cicatricial em 28 dias.
O modelo elastase/BAPN possui certas limitações. A dissecção circunferencial da aorta requer habilidades cirúrgicas finas, mas ajuda a melhorar a replicabilidade e o grau de indução do aneurisma. Semelhante ao modelo de elastase tópica, há também um efeito de lote na atividade da enzima elastase, que, como mencionado anteriormente, é, portanto, importante utilizar o mesmo frasco de elastase para todos os animais em um determinado experimento. Embora a incidência de trombo intraluminal e ruptura do AAA aumente com o tempo e a gravidade do aneurisma, eles não são garantidos nem totalmente previsíveis neste modelo.
Em resumo, o modelo elastase/BAPN produz AAAs infrarrenais grandes e verdadeiros em camundongos machos e fêmeas, que se expandem progressivamente ao longo do tempo, formam trombo intraluminal e são capazes de ruptura. Esses pontos fortes desse modelo murino ajudam a recapitular melhor alguns dos comportamentos e características dos aneurismas em humanos. Embora tecnicamente difícil, a dissecção cuidadosa e completa da aorta pode aumentar a resposta aneurismática. Atualmente, o método elastase/BAPN é um modelo avançado para o estudo de aneurismas da aorta abdominal infrarrenal.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigação foi apoiada pelo Instituto Nacional do Coração, Pulmão e Sangue (NHLBI) dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) sob 1R01HL149404-01A1 (BL), e o Prêmio Ruth L. Kirschstein do Serviço Nacional de Pesquisa T32 HL 007936 ao Centro de Pesquisa Cardiovascular da Universidade de Wisconsin-Madison (JB). As figuras foram criadas ou editadas com Biorender.com. A análise estatística foi realizada por meio do software GraphPad Prism 10.
Materials
| 0.5 L induction chamber | Kent Scientific Corporation | SOMNO-0530XXS | anesthesia induction chamber |
| 0.9% sodicum chloride injection, USP, 20 mL | Hospira | NDC 0409-4888-03 | normal saline |
| 3 mL syringe Luer-Lok Tip with BD PrecisionGlide Needle 22 G x 3/4 | BD | REF 309569 | syringe, 22 G needle |
| 3-Aminopropionitrile Fumarate | TCI | A0796 | BAPN |
| 3-Aminopropionitrile Fumarate salt | Sigma-Aldrich | A3134-25G | BAPN |
| Avant Delux gauze sponges, 2" x 2" 4-Ply | Medline | NON26224 | gauze sponges |
| Balding clipper | Whal Clipper Corporation | 8110 | hair clippers |
| betadine surgical scrub (povidone-iodine, 7.5%) | Avrio | NCD 67618-154-16 | betadine surgical scrub |
| blunt forceps | ROBOZ | RS-5130 | blunt forceps |
| Buprenorphine ER-lab | ZooPharm | BERLAB0.5 | buprenorphine |
| carprofen | Norbrook | NDC 55529-131-11 | carprofen |
| CASTROVIEJO 5.75" straight with lock | ROBOZ | RS-6412 | Castroviejo needle driver |
| cotton tipped wood applicators, 6" | Dynarex | No. 4302 | cotton tipped wood applicators |
| DESMARRES 5.5' rectractor | ROBOZ | RS-6672 | skin rectractor |
| digital caliper, 0-150 mm | World Precision Instruments | 501601 | digital caliper |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-144 | DPBS |
| Elastase from porcine pancrease Type I | Sigma-Aldrich | E1250-10MG | elastase >4.0 units/mg protein |
| Ethanol 200 proof | Decon Labs, Inc | 2701 | ethanol diluted to 70% |
| eye lube | Optixcare | 14716 | eye lube |
| Germinator 500 dry sterilizer | CellPoint Scientific, Inc | 5-1450 | dry bead sterilizer |
| heat therapy mat | Adroit Medical Systems | V016 | heat therapy mat |
| heat therapy pump | Adroit Medical Systems | HTP-1500 | heat therapy pump |
| isoflurane, USP | Akorn Animal Health | NCD 59399-106-01 | isoflurane |
| L-10 pipette | Rainin | LTS 0.5-10 uL | pipette |
| Low profile anesthesia mask, small | Kent Scientific Corporation | SOMNO-0801 | anesthesia nose cone |
| micro dissector scissors | ROBOZ | RS-5619 | micro dissector scissors |
| microscope | Leica | S9i | microscope |
| Nii-LED high intensity LED illuminatorLED exertnal light | Nikon Instruments, Inc | 83359 NII-LED | external dissection light |
| nylon 5-0 monofilament, black non-absorbable suture | Oasis | MV-661-V | 5-0 nylon suture |
| polyisoprene surgical gloves, GAMMEX Non-Latex PI Micro, size 7.5 | Ansell | 20685975 | non-latex surgical gloves |
| Reflex 7 mm stainless steel wound clips | CellPoint Scientific, Inc | 203-1000 | wound clips |
| scale | Ohaus | Compass CR2200 | scale |
| SomnofFlo Accessory Kit | Kent Scientific Corporation | 10-8000-71 | tubing for electronic vaporizer |
| SomnoFlo electronic vaporizer | Kent Scientific Corporation | SF2992 | low-flow electronic vaporizer |
| SomnoPath Flow Diverter | Kent Scientific Corporation | SP1016 | flow diverter for electronic vaporizer |
| SS/45 sharp forceps | ROBOZ | RS-4941 | sharp forceps |
| surgical scissors | ROBOZ | RS-6010SC | surgical scissors |
| vessel forceps | Dumont | VES 0.35 | vessel forceps |
Referenzen
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