出生後、若年性、および滑走性成体マウスの眼球後洞注射による全身治療

このプロトコルと付随するビデオは、出生後、若年性、および走った成体マウスの球後静脈注射スペース用です。このプロトコルは、National Human Genome Research InstituteのInstitutional Animal Care and Use Committee(ACUC)によってプロトコル番号G-03-4で承認されています。他の機関では、要件や制限が異なる場合があり、このプロトコルは、貴機関での承認のために変更が必要な場合があります。この処置またはその他の動物用処置を行う前に、所属機関のACUCから承認を得てください。 1.プレインジェクションの準備 AAVを、滅菌済みの1.5 mLマイクロ遠心チューブ内の滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で、各注入時に希望の注入量と濃度に希釈します。各注入に50%の容量を追加して、使い捨て滅菌シリンジを正確に充填できるようにします。注:ここでは、AAV8-CAG-eGFPレポーターを希釈して、体重1kgあたり1×1013ウイルスゲノム(vg / kg)を50μLの容量で送達しています。注入する50μL中のAAVの量は、注入時の動物の体重を用いて算出します。このビデオでは、AAVが球後経路を介して注入され、ヒトでの全身送達を再現しています。この手順を使用して、他の遺伝子治療ベクター(レンチウイルス、アデノウイルスなど)、RNA療法、および低分子を全身に送達できます。 卓上実験動物麻酔システム(LAAS)が適切にセットアップされ、製造元の指示に従って正しく機能していることを確認します。注:別の麻酔方法を使用する場合は、注射を開始する前に麻酔が準備されていることを確認してください。球後注射の手順は、ほとんどの麻酔薬と互換性がある必要があります(例:.、ケタミンやキシラジンなどの注射可能な化学的拘束具)。 使い捨て滅菌シリンジ(ここでは、インスリンシリンジ、31 G、長さ8 mm、容量3/10 mL)を充填する前に、プランジャーを数回上下に動かして、プランジャーをスムーズに押し下げることができるようにします。次に、シリンジを希望の量まで充填し、気泡がないことを確認します。注:最大150μLの容量を注入できます。当研究室では通常、50 μLの容量を注入します。 2. 実験動物麻酔システム(LAAS)を用いたイソフルランガス投与によるマウス鎮静 ガスが誘導チャンバーにのみ流れていることを確認してください。双方向ストップコックを非再呼吸(NRB)回路に閉じます。 流量計の前面にある緑色の酸素フローノブをオンにして、流量が1 L / minになるようにします。 気化器の上部にあるレバーを押し下げ、ダイヤルを希望の濃度に回して、イソフルランを≤4%に回します。 マウスを透明な誘導チャンバーに入れます。動物の呼吸と動きを注意深く観察してください。動物が横臥になったら、気化器のノブをイソフルランの2〜2.5%まで下げます。 フェイスマスクに取り付けられたNRB回路への双方向活栓を開き、誘導ボックスへのガスの流れを閉じます。 動物を取り外し、NRB回路のフェイスマスクに入れます。 イソフルラン濃度設定を1.5%〜1.75%に下げます。これは、刺激に対する反応によって決定されます(例:.、つま先をつまむか、足を絞る)。. マウスの呼吸と粘膜の色を常に監視してください(可能な場合)。動物の呼吸が苦しくなったり、粘膜の色がピンク色でない場合は、麻酔薬の濃度を下げてください。 手順全体を通して動物を暖かく保ちます。ペーパータオルで包んだハンドウォーマーをアンダーパッドの下に置き、マウスの真下に配置します。 手順が完了したら、酸素と気化器の電源を切ります。 3.動物の注射 右利きの場合は、マウスの右目を注入し、鼻を右に向けてマウスを左側に置きます。左利きの場合は、マウスの左目を注入し、鼻を左手に向けてマウスを右側に置きます。 注射する眼球に1〜2滴の眼科麻酔薬を塗布します。次に、滅菌吸収性ガーゼパッドを使用して余分な眼科麻酔液を取り除きます。指先で皮膚の背側と腹側に優しく圧力をかけ、マウスの眼球をソケットから部分的に突き出させます(図2A、B)。注:目を突き出すときは、血流や注射を妨げるため、周囲の頸血管に過度の圧力がかからないように注意してください。さらに、気管に圧力をかけると、マウスが呼吸できなくなる可能性があります。手順全体を通してマウスが呼吸できることを確認してください。 針を約30°の角度で斜めの位置に保ち、内側眼角に配置します(図2C)。注:球後洞に到達するための針の配置の深さは、動物のサイズによって異なります。注射中に針を斜めの位置にすると、眼の損傷のリスクが減少します。針を深く置きすぎて眼窩に穴を開けないように注意してください。注射は1分もかかりません。 シリンジプランジャーにゆっくりとスムーズに圧力をかけ、注射液を送達します。これにより、血管外漏出の可能性が減少します。 針をゆっくりとスムーズに取り外します。 マウスからフェイスマスクを取り外して、麻酔からの回復を可能にします。 4. ポストインジェクション 手順が完了したら、酸素と気化器の電源を切ります。 残存出血が発生した場合は、滅菌ガーゼを使用して血液を抜いてください。 マウスが暖かい場所(約37°C)にあることを確認してくださいが、過度に暑くならないようにして、麻酔からの回復中の低体温症を防ぎます。 マウスを完全に回復するまでマウスを単独で観察してから、マウスをケージとラックに戻します。注意: 回復中にマウスを分離すると、回復中にケージメイトが鎮静剤を打ったマウスを傷つけるのを防ぎます。