Systemische Behandlung von postnatalen, juvenilen und adulten Mäusen durch retrobulbäre Sinus-Injektion
Summary
Dieser Artikel enthält ein Protokoll und ein begleitendes Video für die retrobulbäre Sinus-Injektion von bis zu einem Gesamtvolumen von 150 μl für postnatale, juvenile und adulte Mäuse. Dieses Verfahren eignet sich besonders gut für die Injektion von kleinen Mäusen (15 g), wenn eine Injektion in die Schwanzvene nicht möglich ist.
Abstract
Während Schwanzveneninjektionen bei erwachsenen Mäusen häufig als systemischer Verabreichungsweg verwendet werden, sind retrobulbäre Injektionen eine alternative Methode zur systemischen Verabreichung mit weniger Einschränkungen. Erstens sind Schwanzveneninjektionen (TVIs) auf erwachsene Mäuse beschränkt, bei denen die Größe der Schwanzvene für den Zugang geeignet ist. Die Beschränkung auf die Behandlung adulter Mäuse kann problematisch sein, wenn es sich um Mausmodelle handelt, die nicht bis zum Erwachsenenalter überleben. Zweitens sind TVIs für Mausmodelle mit Wachstumsverzögerungsphänotypen, bei denen die Mäuse nie die Größe adulter Wildtyp-Mäuse erreichen, nicht durchführbar. Daher können retrobulbäre Injektionen erfolgreich zur Behandlung sowohl junger als auch kleiner erwachsener Mäuse eingesetzt werden. Schließlich werden retrobulbäre Injektionen unter Narkose durchgeführt, was für die Mäuse weniger belastend ist als TVIs, die üblicherweise ohne Anästhesie durchgeführt werden. In diesem Artikel werden ein Protokoll und detaillierte Anweisungen für retrobulbäre Injektionen vorgestellt, die für die systemische Verabreichung an kleine und junge Mäuse verwendet werden können.
Introduction
Mausmodelle genetischer Krankheiten werden häufig verwendet, um die Wirksamkeit von niedermolekularen, genetischen und Zelltherapien zu demonstrieren1. Bei Mäusen ist die am weitesten verbreitete Methode zur Replikation der systemischen Verabreichung an den Menschen die Schwanzveneninjektion (TVI), die typischerweise bei erwachsenen Mäusen im Alter von etwa 6-8 Wochen durchgeführt wird, um sicherzustellen, dass die Vene groß genug ist, um Zugang zu erhalten. TVI wurde erfolgreich in zahlreichen präklinischen Proof-of-Principle-Studien zu genetischen Krankheiten wie Hämophilie eingesetzt, die klinische Studien zur Gentherapie am Menschen unterstützt haben2. Viele Mausmodelle genetischer Erkrankungen weisen jedoch Wachstums- und/oder frühe Letalitätsphänotypen auf, die sie daran hindern, das Alter oder die Größe einer erwachsenen Maus zu erreichen (Abbildung 1). Die Behandlung solcher Mäuse mittels TVI kann je nach Alter der Letalität und/oder der maximalen Größe, die die Tiere erreichen können, äußerst schwierig, wenn nicht gar unmöglich sein.
Im Gegensatz dazu kann die systemische Verabreichung eines Therapeutikums durch retrobulbäre (häufig und fälschlicherweise als retroorbitale Sinusinjektion bezeichnet) bei Mäusen unabhängig von Alter oder Größe3 recht einfach durchgeführt werden. Retrobulbäre Injektionen von Adeno-assoziierten Viren (AAV) wurden erfolgreich in jungen, wachstumsverzögerten Mausmodellen genetischer Erkrankungen wie Methylmalonazidämie (MMA) und Niemann-Pick-Typ-C-Krankheiteingesetzt 4,5,6,7,8. (Dieses Verfahren kann auch zur Injektion von Neugeborenen 3,4,9,10 verwendet werden; diese Technik wird jedoch weder in diesem Protokoll noch im begleitenden Video ausführlich beschrieben.) Selbst hochgiftige Substanzen wie Doxorubicin können durch retrobulbäre Injektion sicher abgegeben werden11,12. Im Gegensatz zur TVI werden Mäuse während der retrobulbären Sinus-Injektionen anästhesiert, was das Verfahren für die Maus weniger belastend und für den Bediener einfacher macht, da er die Maus nicht physisch fixieren muss13,14. Ein weiteres Problem ist, dass TVI häufig eine Wärmelampe verwendet, um die Schwanzvene zu erweitern, was bei jungen Mäusen möglicherweise zu Dehydration führen könnte und in Mausmodellen für genetische Krankheiten, die eher auf hitzebedingten Stress zurückzuführen sind, problematisch sein könnte. Ein weiteres Problem, das bei der Verwendung von TVI auftreten kann, ist, dass die Schwanzvene bei hochpigmentierten Mäusen besonders schwierig zu visualisieren sein kann. Wie bei der TVI führt die retrobulbäre Sinus-Injektion jedoch zu einer breiten systemischen Biodistribution15,16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Während die retrobulbäre Injektion eine zuverlässige Methode zur Verabreichung von kleinen Molekülen, Proteinen und genomischen Therapien ist, ist das Üben der Technik mit einem Farbstoff notwendig, um sicherzustellen, dass eine zuverlässige und replizierbare systemische Verabreichung erreicht wird. Die Verwendung eines Farbstoffs wird dringend empfohlen, um retrobulbäre Injektionen bei Mäusen zu üben, bevor dieser Verabreichungsweg in Experimenten verwendet wird. Farbstoffe können im Mausgewebe visuell überprüft werden, um eine konsistente systemische Verabreichung zu gewährleisten.
Bei unserer Demonstration der retrobulbären Injektionstechnik wurde Isoflurangas verwendet, um die Mäuse vor dem Eingriff zu betäuben. Andere Formen der Anästhesie können vor dem Eingriff angewendet werden, aber es ist wichtig sicherzustellen, dass sich die Maus nicht von der Sedierung erholt, bevor die Injektion abgeschlossen ist. Glücklicherweise dauert die eigentliche Injektion in der Regel weniger als eine Minute und die Zeit, für die die Maus vollständig betäubt werden muss, ist kurz. Die Maus sollte während der Injektion vollständig sediert werden, und die Anästhesie sollte erneut verabreicht werden, wenn die Maus vor der Injektion das Bewusstsein erlangt. Da mit der Anwendung einer Anästhesie Risiken verbunden sind, sollte die Zeit, in der die Maus sediert wird, minimiert werden. Wir hatten keine Probleme bei der Verwendung von Isofluran zur Sedierung kleiner kranker Mäuse mit Methylmalon- und Propionazidämie. Einige Mausmodelle können jedoch empfindlicher auf Sedierung und bestimmte Anästhesie reagieren. Dieses potenzielle Problem sollte vor dem Versuch, eine Sedierung in einer Studie anzuwenden, in Betracht gezogen werden. Schließlich reduziert die Anwendung der Sedierung in Kombination mit der retrobulbären Injektion die scheinbare Belastung, die die Maus während des Injektionsprozesses zeigt, im Vergleich zur TVI, bei der die Sedierung nicht üblich ist, erheblich.
Wir haben keine Probleme im Zusammenhang mit der Nachinjektion beobachtet, obwohl eine Infektion bei jeder Injektion ein potenzielles Risiko darstellt. Um das Risiko einer Infektion zu verringern, werden eine sterile Einwegspritze und steriles PBS zur Verdünnung des gereinigten AAV verwendet. Alle Mäuse in unserer Tieranlage werden täglich auf Anzeichen möglicher Gesundheitsprobleme untersucht und erhalten tierärztliche Versorgung, um bei Bedarf gesundheitliche Probleme zu beheben.
Die Alternative zur retrobulbären Sinus-Injektion und die weiter verbreitete Methode der systemischen Verabreichung an juvenile und adulte Mäuse ist die TVI. TVI und retrobulbäre Sinus-Injektion führen zu einer ähnlichen Bioverteilung bei kleinen Molekülen und Antikörpern, und durch Extrapolation wäre dasselbe für virale Vektoren zu erwarten15,16. In der Literatur konnten jedoch keine Beispiele gefunden werden, die die systemische Verabreichung von Gentherapievektoren durch TVI und retrobulbäre Sinusinjektion vergleichen. Unserer Meinung nach sind retrobulbäre Sinus-Injektionen bei Mäusen mit einem verminderten Wachstumsphänotyp und/oder einer frühen Letalität einfacher durchzuführen.
TVI wird oft als analoger zur systemischen Verabreichung beim Menschen angesehen, obwohl der Mensch einen retrobulbären Sinus, aber keinen Schwanz hat. In einem Aspekt ähnelt die retrobulbäre Sinus-Injektion der systemischen Verabreichung beim Menschen insofern, als das Injektor in das obere Venensystem eintritt, so als ob ein Injektor einem Menschen durch einen peripher eingeführten Zentralkatheter (PICC-Leitung) oder einen intravenösen Katheter im Arm verabreicht würde. Umgekehrt gelangt das Injektor nach der Injektion in die Schwanzvene in das untere Venensystem einer Maus. Leider repliziert keine dieser Methoden genau die Methode(n), die für die systemische Verabreichung beim Menschen verwendet werden, aber beide sind wirksame Methoden der systemischen Verabreichung bei Mäusen.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir schätzen die Unterstützung der Mitarbeiter der NHGRI-Mauseinrichtung, des NCI Molecular Pathology Lab und insbesondere Andrew Warner. R.J.C. wird durch das Intramural Research Program des NHGRI im Rahmen von 1ZIAHG200318-16 unterstützt und diese Arbeit wurde teilweise vom National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS) finanziert. Abbildung 2C wurde mit BioRender erstellt.
Materials
| AAV8-CAG-eGFP | Univ. Penn. Vector Core | Special order | alternative sources of AAV reporters and alternative AAV reporters are available |
| Barrier (Filter) Tips, 20 μL size | ThermoFisher | AM12645 | for diluting AAV to disire injection volume and concentration |
| Barrier (Filter) Tips, 100 μL size (sterile) | ThermoFisher | AM12648 | for diluting AAV to disire injection volume and concentration |
| Dual Prodedure Circuit | VetEquip | 921400 | alternative anesthesia method can be used |
| Gilsen PIPETTEMAN Classic P20 pipette | Gilson | F123600 | for diluting AAV to disire injection volume and concentration |
| Gilsen PIPETTEMAN Classic P100 pipette | Gilson | F123615 | for diluting AAV to disire injection volume and concentration |
| Hand warmers (HOTHANDS) | ULINE | S-1497B | to keep mouse warm while anesthesized |
| Insulin syringes, 31 G, 8 mm length, 3/10 mL capacity | Becton Dickson | 328438 | used in video; one syringe per injection |
| Isoflurane (Fluriso) | VETONE | 502017 | alternative anesthesia can be used |
| Medline Protection Plus Disposable Underpads | ThermoFisher | 23-666-062 | to place mouse on durring injection |
| Oak Ridge Phlebotomy Sharps Container With Transparent Lid | ThermoFisher | 22-730-434 | for needle disposal |
| Phosphate buffered saline PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | To dilute AAV to desired concencentration and volume |
| Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes (sterile) | ThermoFisher | 3451 | for diluting AAV to disire injection volume and conentration |
| Sterile gauze sponge 4"x"4 | Covidien | 3033 | |
| Table-Top laboratory animal anesthesia system (LAAS) | VetEquip | 901806 | alternative anesthesia method can be used |
| Trecaine Hydrochloride Ophthalmic (0.5%) | Ocenanside Pharmaceuticals | AK102D5DS | local anesthetic |
| Tuberculin syringe with a 27.0 G (or smaller) | Any | N/A | alternative to insulin syringe used in video |
| VetEquip’s User Guide and Operating Manual for table top and mobile Laboratory Animal Anesthesia System. | VetEquip | chrome-extension://efaidnbmnnnibpcajpcglclefindmkaj/https://www.vetequip.com/pdfs/LAAS%20Manual.pdf | link to users guide and manual |
Referenzen
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