Summary

Konstruktion eines orthotopen Xenotransplantatmodells für nicht-kleinzelligen Lungenkrebs, der das Fortschreiten der Krankheit nachahmt und die Wirkstoffaktivität vorhersagt

Published: May 10, 2024
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Summary

In dieser Studie wird ein orthotopes Modell für nicht-kleinzelligen Lungenkrebs (NSCLC) vorgestellt, das auf der intrapulmonalen Inokulation von multizellulären Sphäroiden von fluoreszierenden A549-iRFP-Zellen basiert. Das Modell rekapituliert klinische NSCLC-Stadien und spricht auf Cisplatin an, entsprechend der dynamischen In-vivo-Überwachung der langwelligen Fluoreszenz.

Abstract

Nicht-kleinzelliger Lungenkrebs (NSCLC) ist eine hochgradig tödliche Erkrankung mit einer komplexen und heterogenen Tumormikroumgebung. Derzeit rekapitulieren gängige Tiermodelle, die auf der subkutanen Inokulation von Krebszellsuspensionen basieren, die Tumormikroumgebung bei NSCLC nicht. Darin beschreiben wir ein murines orthotopes Lungenkrebs-Xenotransplantatmodell, das die intrapulmonale Inokulation von dreidimensionalen multizellulären Sphäroiden (MCS) verwendet. Konkret wurden fluoreszierende humane NSCLC-Zellen (A549-iRFP) 3 Wochen lang in 96-Well-Mikrotiterplatten mit geringer Bindung mit Kollagen kultiviert, um MCS zu bilden, die dann interkostal in die linke Lunge von athymischen Nacktmäusen inokuliert wurden, um das orthotope Lungenkrebsmodell zu etablieren.

Im Vergleich zur ursprünglichen A549-Zelllinie reagierte die MCS der A549-iRFP-Zelllinie ähnlich auf Krebsmedikamente. Das langwellige Fluoreszenzsignal der A549-iRFP-Zellen korrelierte stark mit gängigen Markern des Krebszellwachstums, einschließlich des Sphäroidvolumens, der Zellviabilität und des zellulären Proteinspiegels, und ermöglichte so eine dynamische Überwachung des Krebswachstums in vivo durch Fluoreszenzbildgebung. Nach der Inokulation in Mäuse durchlief das A549-iRFP MCS-Xenotransplantat zuverlässig Phasen, die den klinischen Stadien des NSCLC sehr ähnlich waren, einschließlich der Expansion des Primärtumors, des Auftretens benachbarter Sekundärtumoren und der Metastasen von Krebszellen in die kontralaterale rechte Lunge und entfernte Organe. Darüber hinaus reagierte das Modell auf das Benchmark-Medikament gegen Lungenkrebs, Cisplatin, mit der erwarteten Toxizität und einem langsameren Fortschreiten des Krebses. Daher würde dieses murine orthotope Xenotransplantatmodell von NSCLC als Plattform dienen, um das Fortschreiten der Krankheit zu rekapitulieren und die Entwicklung potenzieller Krebsmedikamente zu erleichtern.

Introduction

Unter allen onkologischen Erkrankungen verursacht Lungenkrebs nicht nur den höchsten Lebensverlust, sondern fordert auch die zweithöchste Anzahl neuer Patienten pro Jahr in den USA1. Diese verheerende Malignität stellt ein großes Hindernis im modernen Gesundheitswesen dar und erfordert ein tieferes Verständnis ihrer komplizierten Biologie und wirksamere therapeutische Modalitäten2. Nicht-kleinzelliger Lungenkrebs (NSCLC) macht 85 % des Lungenkrebses aus und neigt dazu, sich zu soliden Tumoren zu entwickeln3. Eine der größten Herausforderungen bei Lungenkrebs ist die dynamische und heterogene Tumormikroumgebung, die das Fortschreiten des Krebses und das Ansprechen auf therapeutische Eingriffe tiefgreifend beeinflusst 4,5,6. Ein tieferes Verständnis des Zusammenspiels zwischen Krebszellen und ihrer Mikroumgebung in verschiedenen Stadien des NSCLC erfordert verfeinerte pathologische Modelle, die die histologischen Merkmale des NSCLC-Verlaufs rekapitulieren.

In dieser Hinsicht erweisen sich orthotope Tiermodelle als vielversprechender Weg für die NSCLC-Forschung. Im Gegensatz zu den üblicherweise verwendeten subkutanen Xenotransplantatmodellen7 weisen orthotope Modelle Krebszellen auf, die direkt in das Ursprungsorgan inokuliert werden. Bei Lungenkrebs bedeutet dies, Krebszellen direkt in das Lungengewebe zu implantieren 8,9. Folglich ahmen orthotope Modelle des Lungenkrebses die native Tumormikroumgebung, einschließlich der benachbarten Gewebe, Gefäße und Immunkomponenten, besser nach und verbessern so ihre physiologische und klinische Relevanz.

Dreidimensionale multizelluläre Sphäroide (MCS) stellen einen weiteren vielversprechenden Ansatz dar, um Merkmale der Tumorumgebung zu rekapitulieren. Die meisten Krebsarten zeichnen sich durch ihre komplexe Tumormikroumgebung aus, einschließlich der verschiedenen Zell-Zell-Interaktionen, der extrazellulären Matrix und der Gradienten in Sauerstoff und Nährstoffen10,11. Herkömmlichen 2D-Zellkulturen fehlt die räumliche und strukturelle Komplexität, um diese tumorspezifischen Merkmale zu rekapitulieren12. Im Gegensatz dazu weisen MCS geeigneter Größe eine heterogene Struktur mit einem hypoxischen und nekrotischen Kern auf, der nicht nur die intratumorale Mikroumgebung, sondern auch die physiologische Barriere gegen das Eindringen von Medikamenten rekapituliert, was ein wichtiger Mechanismus der Arzneimittelresistenz in der Krebstherapie ist 13,14,15.

Unter Ausnutzung sowohl der orthotopen Tiermodelle als auch der MCS-Kultivierungstechniken wurden MCS an immungeschwächte Mäuse geimpft, um erfolgreich orthotope Modelle von Brustkrebs und Prostatakrebs zu konstruieren 16,17. Darin berichten wir über die detaillierte Methodik zur Konstruktion und Charakterisierung eines murinen orthotopen Xenotransplantatmodells für Lungenkrebs. Bei dieser Methode wird die intrapulmonale Inokulation von 3D-MCS verwendet, das aus fluoreszierenden menschlichen Lungenkrebszellen (A549-iRFP) gewonnen wird18. Dieses Modell bietet eine außergewöhnliche Möglichkeit, das Fortschreiten von Lungenkrebs in vivo in Stadien zu beobachten, die eng mit den vier klinischen Stadien des NSCLC übereinstimmen. Darüber hinaus sprach der Xenotransplantatkrebs dieses Modells auf das klinisch etablierte Antilungenkrebsmedikament Cisplatin an.

Protocol

Die Tierstudie wurde mit Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der University of the Pacific durchgeführt (Tierprotokolle 19R10 und 22R10). Für die vorliegende Studie wurden acht männliche athyme Nacktmäuse im Alter von 5-6 Wochen mit einem Gewicht von 20-25 g verwendet, die mit der referenzierten Nagetierdiät gezüchtet und unter pathogenfreien (SPF) Bedingungen gehalten wurden. Käfige, Einstreu und Trinkwasser wurden autoklaviert und regelmäßig gewechselt. Ein Schema der Tumorin…

Representative Results

Charakterisierung von A549-iRFP MCSA549-iRFP MCS wurden erfolgreich in sphäroiden Mikrotiterplatten mit Hilfe von Kollagen und Zentrifugation kultiviert. Als MCS nach 1 Woche einen Durchmesser von etwa 500 μm erreichte, wurden sowohl A549 als auch A549-iRFP MCS 3 Tage lang einer Vielzahl von Krebsmedikamenten und -formulierungen ausgesetzt und dann für weitere 4 Tage in einem arzneimittelfreien Wachstumsmedium gehalten. Das A549-iRFP MCS zeigte ein Reaktionsmuster, das dem der A549-Elternzellen se…

Discussion

Die Konstruktion von A549-iRFP MCS ist ein unkompliziertes und hochgradig reproduzierbares Laborverfahren und kann auf die MCS-Bildung für mehrere Zelllinien übertragen werden. Das mit Hilfe von Zentrifugation und Kollagen erzeugte MCS weist innerhalb von 3-4 Tagen eine integralere und solidere, tumorähnliche Struktur auf. Diese Methode gewährleistet die Bildung robuster Sphäroide, die ihre integrale Struktur über längere Zeiträume beibehalten, typischerweise 2-3 Wochen oder sogar länger, bis kleine Knospen zu s…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch SAAG- und SEED-Stipendien der University of the Pacific unterstützt. Wir danken Dr. William Chan für die Gewährung des Zugangs zum Odyssey Infrared Imaging 205 System und Dr. John Livesey für den Zugang zum SpectraMax iD3 Plattenleser. Wir danken Dr. Melanie Felmlee für die fachliche Beratung zu den Tierprotokollen.

Materials

100 µL Glass Syringe Hamilton Part/REF #80601
20 G Needle Thermo Fisher Scientific Inc. 14 826D
96-well Ultra-Low-Attachment Spheroid Microplate  Corning 15-100-173
A549-iRFP Imanis Life Sciences  CL082-STAN
AIN-93M Mature Rodent Diet  Research Diets, Inc. D10012M
Athymic Nude Mouse Charles River Laboratories, Inc. Strain Code: 490; homozygous
BCA Pierce 23227
Buprenorphine Hydrochloride Patterson Veterinary NDC Number: 42023-179-05
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay Promega G9683
Collagen Gibco A1064401 
DMEM Corning MT10013CV
Fetal Bovine Serum (FBS) Cytiva HyClone SH3039603
ImageJ Open source tool (https://imagej.net/ij/) N/A
Image Studio  LI-COR Version 5.2
Isoflurane Patterson Veterinary NDC Number: 17033-0091-25
Ketamine Patterson Veterinary NDC Number: 50989-0161-06
Microscope  Keyence Model number: BZ-X710
Matrigel Corning CB-40234
Odyssey Infrared Imaging 205 System  LI-COR Model number: 9140
PBS Corning MT21040CV
Pearl Trilogy small animal imaging system  LI-COR Model number: 9430
Penicillin-Streptomycin  Corning MT30002CI
Puromycin Thermo Fisher Scientific Inc. AAJ67236XF
ReViSP software from MATLAB  Open source tool on Sourceforge (https://sourceforge.net/projects/revisp/) N/A
Surgical Clips–AutoClip System Fine Science Tools 12020-00
Xylazine Patterson Veterinary NDC Number: 61133-6017-01

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Diesen Artikel zitieren
Xu, Z., Huang, Y., Zhu, Y., Pei, X., Lu, Y., Zhao, S., Guo, X. Construction of An Orthotopic Xenograft Model of Non-Small Cell Lung Cancer Mimicking Disease Progression and Predicting Drug Activities. J. Vis. Exp. (207), e66787, doi:10.3791/66787 (2024).

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