急性LCMV感染マウスにおけるウイルス特異的濾胞性ヘルパーCD4+ T細胞の早期分化へのアクセス
Summary
現在の研究では、ウイルス特異的TFH 細胞の早期運命コミットメントを評価し、これらの細胞における遺伝子発現を操作するためのプロトコルを示しています。
Abstract
濾胞性ヘルパーT(TFH)細胞は、同族のB細胞が高親和性抗体を産生するのを助ける独立したCD4+ T細胞系統として認識され、したがって長期的な液性免疫を確立します。急性ウイルス感染時には、ウイルス特異的TFH細胞の運命コミットメントは感染初期段階で決定され、早期分化型TFH細胞の研究は、T細胞依存性体液性免疫を理解し、ワクチン設計を最適化するために重要です。本研究では、急性リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)感染のマウスモデルと、LCMV糖タンパク質エピトープI-AbGP66-77を特異的に認識するCD4+ T細胞を持つTCRトランスジェニックSMARTA(SM)マウスを用いて、フローサイトメトリー染色に基づくウイルス特異的TFH細胞の早期運命コミットメントにアクセスする手順を記述しました。さらに、SM CD4+ T細胞のレトロウイルス形質導入を利用することにより、早期分化型ウイルス特異的TFH細胞の遺伝子発現を操作する方法も提供されています。したがって、これらの方法は、ウイルス特異的TFH細胞の早期関与の根底にあるメカニズムを探求する研究に役立ちます。
Introduction
さまざまな病原体や脅威に遭遇すると、ナイーブなCD4+ T細胞は、特殊な機能を持つさまざまなヘルパーT(TH)細胞サブセットに分化することにより、免疫応答を調整します1。急性ウイルス感染のシナリオでは、ナイーブCD4+ T細胞の大部分が、B細胞2,3を助ける濾胞性ヘルパーT(TFH)細胞に分化します。他のCD4+ TH細胞サブセット(例えば、TH1、TH2、TH9、およびTH17細胞)とは異なり、TFH細胞は、B細胞ホーミングケモカインCXCL13のケモカイン受容体であるCXCR5をかなり発現し、TFH細胞がB細胞卵胞に移動することを可能にします。B細胞濾胞では、TFH細胞は同族のB細胞が胚中心反応を開始および維持するのを助け、したがって、迅速な高親和性抗体産生と長期体液性記憶を可能にする2,3。
急性ウイルス感染時には、ウイルス特異的TFH細胞の早期運命コミットメントは72時間以内に起こります 4,5 転写抑制因子B細胞リンパ腫-6(Bcl-6)5,6,7,8によって制御されます。Bcl-6の欠損はTFH細胞の分化を著しく鈍化させますが、異所性Bcl-6の発現はTFH細胞の運命関与を実質的に促進します。Bcl-6に加えて、複数の分子が初期のTFH細胞の運命コミットメントの指示に関与しています。転写因子TCF-1およびLEF-1は、Bcl-6 9,10,11の誘導を介してTFH細胞分化を開始する。Bcl-6およびTCF-1の両方によるBlimp1の阻害は、初期のTFH細胞運命コミットメント11,12に必要である。STAT1およびSTAT3は、初期のTFH細胞分化にも必要です13。さらに、ヒストンメチルトランスフェラーゼEZH214,15およびm6AメチルトランスフェラーゼMETTL316によるエピジェネティックな修飾は、TFH細胞の転写プログラム(特にBcl6およびTcf7)を安定化し、したがって早期のTFH細胞の運命コミットメントをプライムするのに役立ちます。前述の分子などを含む進歩は、他の場所で要約されています3が、初期のTFH細胞の運命関与の転写およびエピジェネティックな制御を理解する上で行われてきましたが、これまで知られていなかった分子はまだ学習されていません。
急性リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)感染のマウスモデルでは、LCMV糖タンパク質エピトープI-AbGP66-77を特異的に認識する養子移植されたコンジェニックTCRトランスジェニックSMARTA(SM)CD4+ T細胞は、ウイルス感染中にTFHまたはTH1細胞分化を受けます。この TFH/T H1 分岐分化パターンは、ウイルス特異的 TFH 細胞の生物学を研究する際の SM/急性 LCMV 感染モデルの進歩をサポートします。実際、SM/急性LCMV感染モデルは、TFH細胞研究分野で広く使用されており、TFH細胞生物学における画期的な発見において重要な役割を果たしてきました。これには、TFH細胞5,6の系統決定転写因子としての前述のBcl-6の同定、ならびに他の重要な転写因子(例えば、Blimp-16、TCF-1/LEF 9,10,11、STAT1/STAT313、STAT517、KLF218、およびItch19)の同定が含まれ、TFH細胞の分化、転写後調節(例えば、METTL316 および miR-17~9220) の TFH 細胞分化、TFH 細胞の記憶と可塑性21,22、および TFH 細胞を標的とする合理的なワクチン接種戦略 (例えば、セレン23)。
本研究では、(1)早期分化型TFH細胞へのアクセスに適した急性LCMV感染SMキメラマウスモデルの確立、(2)早期分化型TFH細胞に関連する分子のフローサイトメトリー染色の実施、(3)SM CD4+におけるレトロウイルスベクターベースの遺伝子操作の実施など、ウイルス特異的TFH細胞の早期運命コミットメントにアクセスするための再現性の高い方法が説明されていますT細胞。これらの方法は、ウイルス特異的TFH細胞の早期の運命関与を調査する研究に役立ちます。
Protocol
Representative Results
Discussion
TFH 細胞の分野における研究は、B細胞を助ける上でのTFH 細胞の特殊な機能の発見以来、注目されてきました。蓄積された研究は、TFH 細胞の分化が多段階かつ多因子のプロセス30であり、ここでTFH 細胞の運命コミットメントが初期段階で決定されることを示しました5。したがって、早期分化型TFH 細胞の根底にあるメ…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、中国国家自然科学基金会(No. 32300785 to X.C.)、China National Postdoctoral Program for Innovative Talents(中国国家革新的才能博士課程プログラム)からの助成金を受けて行われました。BX20230449からX.C.)、および国立科学技術メジャープロジェクト(No.2021YFC2300602からL.Y.)。
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Corning | 25-052-CI | |
| 4% Paraformaldehyde Fix Solution, 4% PFA | Beyotime | P0099-500mL | |
| 70 μm cell strainer | Merck | CLS431751 | |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse TCR Vα2 (clone B20.1) | Biolegend | 127812 | 1:200 dilution |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.1 (clone A20) | Biolegend | 110724 | 1:200 dilution |
| APC anti-mouse CD25 (clone PC61) | Biolegend | 101910 | 1:200 dilution |
| B6 CD45.1 (B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ) mouse | The Jackson Laboratory | 002014 | |
| BeaverBeads Streptavidin | Beaver | 22321-10 | |
| Biotin anti-mouse F4/80 Antibody (clone BM8) | Biolegend | 123106 | 1:200 dilution |
| Biotin Rat anti-mouse CD11c (clone N418) | Biolegend | 117304 | 1:200 dilution |
| Biotin Rat anti-Mouse CD19 (clone 6D5) | Biolegend | 115504 | 1:200 dilution |
| Biotin Rat anti-Mouse CD8a (clone 53-6.7) | Biolegend | 100704 | 1:200 dilution |
| Biotin Rat anti-mouse NK-1.1 (clone PK136) | Biolegend | 108704 | 1:200 dilution |
| Biotin Rat anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (clone TER-119) | Biolegend | 116204 | 1:200 dilution |
| bovine serum albumin, BSA | Sigma | A7906 | |
| Brilliant Violet 421 anti-T-bet (clone 4B10) | Biolegend | 644816 | 1:100 dilution |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD279 (PD-1) (clone 29F.1A12) | Biolegend | 135220 | 1:200 dilution |
| C57BL/6J (B6) mouse | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| CXCR5-GFP knock-in reporter mouse | In house; the CXCR5-GFP knock-in mouse line was generated by the insertion of an IRES-GFP construct after the open reading frame of Cxcr5. | ||
| DMEM 10% medium | DMEM medium containing 10% FBS | ||
| DMEM medium | Gibco | 11885092 | |
| EDTA | Sigma | E9884 | |
| FACSFortesa | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine serum, FBS | Sigma | F8318 | |
| FlowJo (version 10.4.0) | BD Biosciences | ||
| Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set | Invitrogen | 00-5523-00 | The kit contains three reagents: a. Fixation/Permeabilization Concentrate (4X); b. Fixation / Permeabilization Diluent; c. Permeabilization Buffer. |
| Goat Anti-Rat IgG Antibody (H+L), Biotinylated | Vector laboratories | BA-9400-1.5 | 1:200 dilution |
| Invitrogen EVOS FL Auto Cell Imaging System | ThermoFisher Scientific | ||
| Isolation buffer | FACS buffer containing 0.5% BSA and 2mM EDTA | ||
| LCMV GP61-77 peptide (GLKGPDIYKGVYQFKSV) | Chinese Peptide Company | ||
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | 1:200 dilution |
| MigR1 | addgene | #27490 | |
| NaN3 | Sigma | S2002 | |
| Opti-MEM medium | Gibco | 31985070 | |
| pCL-Eco | addgene | #12371 | |
| PE anti-mouse CD69 (clone H1.2F3) | Biolegend | 104508 | 1:200 dilution |
| PE Mouse anti-Bcl-6 (clone K112-91) | BD Biosciences | 561522 | 1:50 dilution |
| Phosphate buffered saline, PBS | Gibco | 10010072 | |
| Polybrene | Solarbio | H8761 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CXCR5 (clone 2G8) | BD Biosciences | 551961 | 1:50 dilution |
| Rat monoclonal PerCP anti-mouse CD4 (clone RM4-5) | Biolegend | 100538 | 1:200 dilution |
| recombinant murine IL-2 | Gibco | 212-12-1MG | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Beyotime | C3702-500mL | |
| RPMI 1640 medium | Sigma | R8758 | |
| RPMI 2% | RPMI 1640 medium containing 2% FBS | ||
| SMARTA (SM) TCR transgenic mouse | SM TCR transgenic line in our lab is a gift from Dr. Rafi Ahmed (Emory University). Additionally, this mouse line can also be obtained from The Jackson Laboratory (stain#: 030450). | ||
| Staining buffer | PBS containing 2% FBS and 0.01% NaN3 | ||
| Streptavidin PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4317-82 | 1:200 dilution |
| TCF1/TCF7 (C63D9) Rabbit mAb (Alexa Fluor 488 Conjugate) | Cell signaling technology | 6444S | 1:400 dilution |
| TFH cell staining buffer | FACS buffer containing 1% BSA and 2% mouse serum | ||
| TransIT-293 reagent | Mirus Bio | MIRUMIR2700 |
Referenzen
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