الوصول إلى التمايز المبكر للخلية التائية المساعدة المسامية CD4 + الخاصة بالفيروس في الفئران المصابة بفيروس LCMV الحاد
Summary
تعرض الدراسة الحالية بروتوكولات لتقييم الالتزام المبكر بالمصير لخلايا TFH الخاصة بالفيروس والتلاعب بالتعبير الجيني في هذه الخلايا.
Abstract
ينظر إلى الخلايا التائية المساعدة المسامية (TFH) على أنها سلالة خلايا CD4 + T مستقلة تساعد الخلايا البائية المشابهة في إنتاج أجسام مضادة عالية التقارب ، وبالتالي إنشاء مناعة خلطية طويلة المدى. أثناء العدوى الفيروسية الحادة ، يتم تحديد التزام مصير الخلاياالتائية FH الخاصة بالفيروس في مرحلة العدوى المبكرة ، والتحقيقاتفي الخلايا التائية FH المتمايزة المبكرة أمر بالغ الأهمية في فهم المناعة الخلطية المعتمدة على الخلايا التائية وتحسين تصميم اللقاح. في الدراسة ، باستخدام نموذج فأر لعدوى فيروس التهاب المشيمة اللمفاوي الحاد (LCMV) وفأر SMARTA (SM) المعدل وراثيا TCR مع خلايا CD4 + T التي تتعرف على وجه التحديد على خاتمة البروتين السكري LCMV I-AbGP66-77 ، وصفنا إجراءات للوصول إلى التزام المصير المبكر لخلاياT FH الخاصة بالفيروس بناء على تلطيخ قياس التدفق الخلوي. علاوة على ذلك ، من خلال استغلال نقل الفيروسات القهقرية لخلايا SM CD4 + T ، يتم أيضا توفير طرق لمعالجة التعبير الجينيفي خلايا T FH الخاصة بالفيروس المتمايزة مبكرا. ومن ثم ، ستساعد هذه الطرق في الدراسات التي تستكشف الآلية (الآليات) الكامنة وراء الالتزام المبكر لخلاياT FH الخاصة بالفيروس.
Introduction
في مواجهة مسببات الأمراض أو التهديدات المختلفة ، تصمم الخلايا التائية CD4 + T الساذجة استجاباتها المناعية من خلال التمايز إلى مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا التائية المساعدة (TH) ذات وظائف متخصصة1. في سيناريو العدوى الفيروسية الحادة ، يتمايز جزء كبير من الخلايا التائية CD4 + الساذجة إلى خلايا T (T FH) المساعدة المسامية التي توفر المساعدة للخلايا البائية 2,3. تختلف الخلايا TFH عن المجموعات الفرعية الأخرى لخلايا CD4 + T H (على سبيل المثال ، خلايا TH1 و TH2 و TH9 و TH17) ، وتعبر عن مستوى كبير من CXCR5 ، وهو مستقبل الكيموكين للكيموكين CXCL13 للخلايا البائية الموجهة ، مما يمكن الخلايا التائيةFH من الهجرة إلى بصيلات الخلايا البائية. في بصيلات الخلايا البائية ، تساعد الخلايا التائيةFH الخلايا البائية المشابهة في بدء تفاعلات المركز الجرثومي والحفاظ عليها ، مما يتيح الإنتاج السريع للأجسام المضادة عالية التقارب والذاكرة الخلطية طويلة المدى 2,3.
عند الإصابة الفيروسية الحادة ، يحدث الالتزام المبكر بالمصير لخلاياT FH الخاصة بالفيروس في غضون 72 ساعة 4,5 ويتم التحكم فيه بواسطة سرطان الغدد الليمفاوية للخلايا البائية المثبطة للنسخ -6 (Bcl-6) 5،6،7،8 ، والتي تعمل بمثابة “المنظم الرئيسي” الذي يحكم قرارات مصير الخلاياالتائية FH. يؤدي نقص Bcl-6 إلى إضعاف تمايز الخلايا التائيةFH بشدة ، بينما يعزز تعبير Bcl-6 خارج الرحم بشكل كبير الالتزام بمصير الخلايا التائيةFH. بالإضافة إلى Bcl-6 ، تشارك جزيئات متعددة في توجيه الالتزام المبكر بمصير الخلاياالتائية FH. تبدأ عوامل النسخ TCF-1 و LEF-1 تمايز الخلايا التائيةFH عن طريق تحريض Bcl-69،10،11. إن تثبيط Blimp1 ، بواسطة كل من Bcl-6 و TCF-1 ، مطلوب للالتزام المبكر بمصير الخلاياالتائية FH 11,12. STAT1 و STAT3 مطلوبان أيضا لتمايز الخلايا التائيةFH المبكرة 13. إلى جانب ذلك ، تساعد التعديلات اللاجينية بواسطة هيستون ميثيل ترانسفيراز EZH214،15و m6A methyltransferase METTL316 على استقرار برامج نسخ الخلايا التائيةFH (خاصة Bcl6 و Tcf7) وبالتالي الالتزام المبكر بمصير الخلاياالتائية FH. في حين تم إحراز تقدم ، بما في ذلك الجزيئات المذكورة أعلاه وغيرها ، والتي تم تلخيصها في مكان آخر3 ، في فهم اللوائح النسخية واللاجينية للالتزام المبكر بمصير الخلاياالتائية FH ، لا يزال يتعين تعلم الجزيئات غير المعروفة سابقا.
في نموذج الفأر لعدوى فيروس التهاب المشيمية اللمفاوي الحاد (LCMV) ، تنتقل بالتبني خلايا SMARTA (SM) CD4 + T المتجانسة TCR المعدلة وراثيا ، والتي تتعرف على وجه التحديد على خاتمة البروتين السكري LCMV I-AbGP66-77 ، إما تمايز الخلايا TFH أو TH1 أثناء العدوى الفيروسية. يدعم نمط تمايز التشعب TFH / TH1 تقدم نموذج عدوى SM / LCMV الحاد في دراسة بيولوجيا خلايا TFH الخاصة بالفيروس. في الواقع ، تم استخدام نموذج عدوى SM / LCMV الحاد على نطاق واسع في مجال أبحاث الخلايا التائيةFH ولعب دورا حاسما في الاكتشافات البارزة في بيولوجيا الخلايا TFH. يتضمن ذلك تحديد Bcl-6 المذكور أعلاه كعامل نسخ محدد للنسب لخلايا TFH 5,6 ، بالإضافة إلى عوامل النسخ المهمة الأخرى (على سبيل المثال ، Blimp-16 و TCF-1 / LEF9،10،11 و STAT1 / STAT313 و STAT517 و KLF218 و Itch19) توجيه تمايز الخلايا TFH ، لوائح ما بعد النسخ ( على سبيل المثال ، METTL316 و miR-17 ~ 9220) من تمايز الخلايا التائيةFH ، ذاكرة الخلايا التائيةFH واللدونة21،22 ، واستراتيجيات التطعيم العقلانية التي تستهدف خلاياT FH (على سبيل المثال ، السيلينيوم23).
تصف الدراسة الحالية طرقا قابلة للتكرار للوصول إلى التزام المصير المبكر لخلايا TFH الخاصة بالفيروس ، بما في ذلك (1) إنشاء نموذج فأر SM chimera مصاب ب LCMV بشكل حاد مناسب للوصول إلى خلايا TFH المتمايزة مبكرا ، (2) إجراء تلطيخ قياس التدفق الخلوي للجزيئات المتعلقة بخلايا TFH المتمايزة مبكرا ، و (3) إجراء معالجة الجينات القائمة على ناقلات الفيروسات القهقرية في SM CD4 + الخلايا التائية. ستكون هذه الطرق مفيدة للدراسات التي تبحث في الالتزام المبكر بالمصير لخلاياT FH الخاصة بالفيروس.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم تسليط الضوء على البحث في مجال الخلاياالتائية FH منذ اكتشاف الوظيفة المتخصصة للخلاياالتائية FH في مساعدة الخلايا البائية. أشارت الدراسات المتراكمة إلى أن تمايز الخلايا التائيةFH هو عملية متعددة المراحل ومتعددة العوامل30 ، حيث يتم تحديد التزام مصير الخلايا ا…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 32300785 إلى X.C.) ، وبرنامج ما بعد الدكتوراه الوطني الصيني للمواهب المبتكرة (No. BX20230449 إلى X.C.) ، والمشروع الوطني الرئيسي للعلوم والتكنولوجيا (رقم 2021YFC2300602 إلى L.Y.).
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Corning | 25-052-CI | |
| 4% Paraformaldehyde Fix Solution, 4% PFA | Beyotime | P0099-500mL | |
| 70 μm cell strainer | Merck | CLS431751 | |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse TCR Vα2 (clone B20.1) | Biolegend | 127812 | 1:200 dilution |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.1 (clone A20) | Biolegend | 110724 | 1:200 dilution |
| APC anti-mouse CD25 (clone PC61) | Biolegend | 101910 | 1:200 dilution |
| B6 CD45.1 (B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ) mouse | The Jackson Laboratory | 002014 | |
| BeaverBeads Streptavidin | Beaver | 22321-10 | |
| Biotin anti-mouse F4/80 Antibody (clone BM8) | Biolegend | 123106 | 1:200 dilution |
| Biotin Rat anti-mouse CD11c (clone N418) | Biolegend | 117304 | 1:200 dilution |
| Biotin Rat anti-Mouse CD19 (clone 6D5) | Biolegend | 115504 | 1:200 dilution |
| Biotin Rat anti-Mouse CD8a (clone 53-6.7) | Biolegend | 100704 | 1:200 dilution |
| Biotin Rat anti-mouse NK-1.1 (clone PK136) | Biolegend | 108704 | 1:200 dilution |
| Biotin Rat anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (clone TER-119) | Biolegend | 116204 | 1:200 dilution |
| bovine serum albumin, BSA | Sigma | A7906 | |
| Brilliant Violet 421 anti-T-bet (clone 4B10) | Biolegend | 644816 | 1:100 dilution |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD279 (PD-1) (clone 29F.1A12) | Biolegend | 135220 | 1:200 dilution |
| C57BL/6J (B6) mouse | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| CXCR5-GFP knock-in reporter mouse | In house; the CXCR5-GFP knock-in mouse line was generated by the insertion of an IRES-GFP construct after the open reading frame of Cxcr5. | ||
| DMEM 10% medium | DMEM medium containing 10% FBS | ||
| DMEM medium | Gibco | 11885092 | |
| EDTA | Sigma | E9884 | |
| FACSFortesa | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine serum, FBS | Sigma | F8318 | |
| FlowJo (version 10.4.0) | BD Biosciences | ||
| Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set | Invitrogen | 00-5523-00 | The kit contains three reagents: a. Fixation/Permeabilization Concentrate (4X); b. Fixation / Permeabilization Diluent; c. Permeabilization Buffer. |
| Goat Anti-Rat IgG Antibody (H+L), Biotinylated | Vector laboratories | BA-9400-1.5 | 1:200 dilution |
| Invitrogen EVOS FL Auto Cell Imaging System | ThermoFisher Scientific | ||
| Isolation buffer | FACS buffer containing 0.5% BSA and 2mM EDTA | ||
| LCMV GP61-77 peptide (GLKGPDIYKGVYQFKSV) | Chinese Peptide Company | ||
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | 1:200 dilution |
| MigR1 | addgene | #27490 | |
| NaN3 | Sigma | S2002 | |
| Opti-MEM medium | Gibco | 31985070 | |
| pCL-Eco | addgene | #12371 | |
| PE anti-mouse CD69 (clone H1.2F3) | Biolegend | 104508 | 1:200 dilution |
| PE Mouse anti-Bcl-6 (clone K112-91) | BD Biosciences | 561522 | 1:50 dilution |
| Phosphate buffered saline, PBS | Gibco | 10010072 | |
| Polybrene | Solarbio | H8761 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CXCR5 (clone 2G8) | BD Biosciences | 551961 | 1:50 dilution |
| Rat monoclonal PerCP anti-mouse CD4 (clone RM4-5) | Biolegend | 100538 | 1:200 dilution |
| recombinant murine IL-2 | Gibco | 212-12-1MG | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Beyotime | C3702-500mL | |
| RPMI 1640 medium | Sigma | R8758 | |
| RPMI 2% | RPMI 1640 medium containing 2% FBS | ||
| SMARTA (SM) TCR transgenic mouse | SM TCR transgenic line in our lab is a gift from Dr. Rafi Ahmed (Emory University). Additionally, this mouse line can also be obtained from The Jackson Laboratory (stain#: 030450). | ||
| Staining buffer | PBS containing 2% FBS and 0.01% NaN3 | ||
| Streptavidin PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4317-82 | 1:200 dilution |
| TCF1/TCF7 (C63D9) Rabbit mAb (Alexa Fluor 488 Conjugate) | Cell signaling technology | 6444S | 1:400 dilution |
| TFH cell staining buffer | FACS buffer containing 1% BSA and 2% mouse serum | ||
| TransIT-293 reagent | Mirus Bio | MIRUMIR2700 |
Referenzen
- O’shea, J. J., Paul, W. E. Mechanisms underlying lineage commitment and plasticity of helper CD4+ T cells. Science. 327 (5969), 1098-1102 (2010).
- Crotty, S. T follicular helper cell biology: A decade of discovery and diseases. Immunity. 50 (5), 1132-1148 (2019).
- Vinuesa, C. G., Linterman, M. A., Yu, D., Maclennan, I. C. Follicular helper t cells. Annu Rev Immunol. 34, 335-368 (2016).
- Choi, Y. S., et al. ICOS receptor instructs T follicular helper cell versus effector cell differentiation via induction of the transcriptional repressor bcl6. Immunity. 34 (6), 932-946 (2011).
- Choi, Y. S., et al. Bcl6 expressing follicular helper CD4 T cells are fate committed early and have the capacity to form memory. J Immunol. 190 (8), 4014-4026 (2013).
- Johnston, R. J., et al. Bcl6 and BLIMP-1 are reciprocal and antagonistic regulators of T follicular helper cell differentiation. Science. 325 (5943), 1006-1010 (2009).
- Nurieva, R. I., et al. Bcl6 mediates the development of T follicular helper cells. Science. 325 (5943), 1001-1005 (2009).
- Yu, D., et al. The transcriptional repressor bcl-6 directs T follicular helper cell lineage commitment. Immunity. 31 (3), 457-468 (2009).
- Choi, Y. S., et al. LEF1 and TCF1 orchestrate T(FH) differentiation by regulating differentiation circuits upstream of the transcriptional repressor bcl6. Nat Immunol. 16 (9), 980-990 (2015).
- Wu, T., et al. TCF1 is required for the t follicular helper cell response to viral infection. Cell Rep. 12 (12), 2099-2110 (2015).
- Xu, L., et al. The transcription factor TCF-1 initiates the differentiation of T(FH) cells during acute viral infection. Nat Immunol. 16 (9), 991-999 (2015).
- Oestreich, K. J., Mohn, S. E., Weinmann, A. S. Molecular mechanisms that control the expression and activity of bcl-6 in th1 cells to regulate flexibility with a TFH-like gene profile. Nat Immunol. 13 (4), 405-411 (2012).
- Choi, Y. S., Eto, D., Yang, J. A., Lao, C., Crotty, S. Cutting edge: STAT1 is required for IL-6-mediated bcl6 induction for early follicular helper cell differentiation. J Immunol. 190 (7), 3049-3053 (2013).
- Chen, X., et al. The histone methyltransferase ezh2 primes the early differentiation of follicular helper T cells during acute viral infection. Cell Mol Immunol. 17 (3), 247-260 (2020).
- Li, F., et al. Ezh2 programs T(FH) differentiation by integrating phosphorylation-dependent activation of bcl6 and polycomb-dependent repression of p19ARF. Nat Commun. 9 (1), 5452 (2018).
- Yao, Y., et al. METTL3-dependent m(6)A modification programs T follicular helper cell differentiation. Nat Commun. 12 (1), 1333 (2021).
- Johnston, R. J., Choi, Y. S., Diamond, J., Yang, J. A., Crotty, S. STAT5 is a potent negative regulator of TFH cell differentiation. J Exp Med. 209 (2), 243-250 (2012).
- Lee, J. Y., et al. The transcription factor KLF2 restrains CD4+ T follicular helper cell differentiation. Immunity. 42 (2), 252-264 (2015).
- Xiao, N., et al. The e3 ubiquitin ligase itch is required for the differentiation of follicular helper t cells. Nat Immunol. 15 (7), 657-666 (2014).
- Baumjohann, D., et al. The microRNA cluster mir-17~92 promotes TFH cell differentiation and represses subset-inappropriate gene expression. Nat Immunol. 14 (8), 840-848 (2013).
- Wang, Y., et al. The kinase complex mTORC2 promotes the longevity of virus-specific memory CD4(+) T cells by preventing ferroptosis. Nat Immunol. 23 (2), 303-317 (2022).
- Hale, J. S., et al. Distinct memory CD4+ T cells with commitment to T follicular helper- and T helper 1-cell lineages are generated after acute viral infection. Immunity. 38 (4), 805-817 (2013).
- Yao, Y., et al. Selenium-GPX4 axis protects follicular helper t cells from ferroptosis. Nat Immunol. 22 (9), 1127-1139 (2021).
- Oxenius, A., Bachmann, M. F., Zinkernagel, R. M., Hengartner, H. Virus-specific MHC-class II-restricted TCR-transgenic mice: Effects on humoral and cellular immune responses after viral infection. Eur J Immunol. 28 (1), 390-400 (1998).
- Grosjean, C., et al. Isolation and enrichment of mouse splenic t cells for ex vivo and in vivo T cell receptor stimulation assays. STAR Protoc. 2 (4), 100961 (2021).
- Dowling, P., et al. Protocol for the bottom-up proteomic analysis of mouse spleen. STAR Protoc. 1 (3), 100196 (2020).
- Choi, Y. S., Crotty, S. Retroviral vector expression in TCR transgenic CD4+ T cells. Methods Mol Biol. 1291, 49-61 (2015).
- Wu, D., et al. A method for expansion and retroviral transduction of mouse regulatory T cells. J Immunol Methods. 488, 112931 (2021).
- He, R., et al. Follicular CXCR5- expressing CD8(+) T cells curtail chronic viral infection. Nature. 537 (7620), 412-428 (2016).
- Crotty, S. Follicular helper CD4 T cells (TFH). Annu Rev Immunol. 29, 621-663 (2011).
- Breitfeld, D., et al. Follicular B helper T cells express CXC chemokine receptor 5, localize to B cell follicles, and support immunoglobulin production. J Exp Med. 192 (11), 1545-1552 (2000).
- Xu, L., et al. The kinase mTORC1 promotes the generation and suppressive function of follicular regulatory t cells. Immunity. 47 (3), 538-551 (2017).
- Chen, X., et al. The phosphatase pten links platelets with immune regulatory functions of mouse T follicular helper cells. Nat Commun. 13 (1), 2762 (2022).
- Chen, J. S., et al. Flow cytometric identification of T(fh)13 cells in mouse and human. J Allergy Clin Immunol. 147 (2), 470-483 (2021).
