Summary

Synthetische Kondensate und zellähnliche Architekturen aus amphiphilen DNA-Nanostrukturen

Published: May 31, 2024
doi:

Summary

Wir stellen ein Protokoll zur Herstellung synthetischer biomolekularer Kondensate vor, die aus amphiphilen DNA-Nanosternen bestehen, ausgehend von ihren DNA-Oligonukleotiden. Kondensate werden entweder aus einer einzelnen Nanosternkomponente oder aus zwei Komponenten hergestellt und so modifiziert, dass sie die In-vitro-Transkription von RNA aus einem eingebetteten DNA-Template aufrechterhalten.

Abstract

Synthetische Tröpfchen und Kondensate werden immer häufiger Bestandteile fortschrittlicher biomimetischer Systeme und synthetischer Zellen, wo sie zur Etablierung von Kompartimenten und zur Aufrechterhaltung lebensechter Reaktionen verwendet werden können. Synthetische DNA-Nanostrukturen haben aufgrund ihrer programmierbaren Form, ihrer chemischen Funktionalisierung und ihres Selbstorganisationsverhaltens ein erhebliches Potenzial als kondensatbildende Bausteine gezeigt. Wir haben kürzlich gezeigt, dass amphiphile DNA-“Nanosterne”, die durch Markierung von DNA-Verbindungen mit hydrophoben Anteilen gewonnen werden, eine besonders robuste und vielseitige Lösung darstellen. Die resultierenden amphiphilen DNA-Kondensate können so programmiert werden, dass sie komplexe, mehrteilige interne Architekturen aufweisen, strukturell auf verschiedene externe Reize reagieren, Makromoleküle synthetisieren, Nutzlasten einfangen und freisetzen, morphologische Transformationen durchlaufen und mit lebenden Zellen interagieren. Hier demonstrieren wir Protokolle zur Herstellung amphiphiler DNA-Kondensate ausgehend von den DNA-Oligonukleotiden. Wir werden uns mit (i) Einkomponenten-Systemen befassen, die einheitliche Kondensate bilden, (ii) Zweikomponenten-Systemen, die Kern-Schale-Kondensate bilden, und (iii) Systemen, in denen die Kondensate modifiziert werden, um die In-vitro-Transkription von RNA-Nanostrukturen zu unterstützen.

Introduction

Synthetische Zellen sind Geräte im Mikrometermaßstab (10-50 μm), die von unten nach oben konstruiert sind, um Funktionen und Strukturen bestehender biologischer Zellen nachzubilden 1,2. Synthetische Zellen sind häufig durch Membranen gebunden, die aus Lipid-Doppelschichtvesikeln 3,4,5,6,7, Polymersomen 8,9 oder Proteinosomen10,11 aufgebaut sind, die auch zur Etablierung einer internen Kompartimentalisierung verwendet werden können12,13. Inspiriert von den membranlosen Organellen, von denen bekannt ist, dass sie verschiedene Funktionalitäten in lebenden Zellen aufrechterhalten14, gewinnen Strukturen wie polymere Koazervate, biomolekulare Kondensate und Hydrogele als vielseitige und robuste Alternativen an Bedeutung, um sowohl die äußere als auch die innere Kompartimentierung in synthetischen Zellen zu etablieren 15,16,17,18.

Unter Nutzung des vielseitigen Toolkits der DNA-Nanotechnologie19 wurden mehrere Lösungen entwickelt, um synthetische Tröpfchen und Kondensate aus der Selbstorganisation künstlicher DNA-Nanostrukturen zu entwickeln, deren Größe, Form, Funktionalität, Wertigkeit und gegenseitige Wechselwirkungen genau programmiert werden können20. DNA-Tröpfchen oder -Kondensate sind biokompatibel und können als Gerüste sowohl für synthetische Zellen als auch für Organellen fungieren, chemische und biomolekulare Reaktionenbeherbergen 21, Informationen verarbeiten22,23, Ladungen einfangen und freisetzen24,25 und strukturelle Reaktionen aufrechterhalten26.

Unter den vielfältigen Designs kondensatbildender DNA-Nanostrukturen haben sich amphiphile DNA-Nanosterne – sogenannte C-Sterne als robust und vielseitig erwiesen27. C-Sterne sind einfache verzweigte Motive, die aus einer festen DNA-Verbindung (typischerweise vierpolig) bestehen, aus der doppelsträngige (ds)DNA-Arme hervorgehen28. Die Arme werden dann mit hydrophoben Anteilen, typischerweise Cholesterin, bestückt, wodurch die Nanostrukturen amphiphil werden und ihre Kondensation nach einem einfachen Eintopfglühen angetrieben wird. C-Stern-Kondensate ermöglichen eine präzise strukturelle und funktionelle Programmierbarkeit, einschließlich der Möglichkeit, Mehrkammerarchitekturen29,30 zu etablieren, strukturell auf DNA- und Kationenauslöser31 zu reagieren, Makromoleküle29 zu synthetisieren, Nutzlasten einzufangen und freizusetzen32 und mit lebenden Zellenzu interagieren 33. Im Folgenden werden wir Protokolle zur Herstellung von C-Stern-Kondensaten ausgehend von ihren Oligonukleotiden beschreiben und diskutieren.

Das Protokoll fasst die Aufbereitung von unären (einkomponentigen) und binären (zweikomponentigen) Kondensaten zusammen, wobei drei verschiedene C-Star-Designs (Abbildung 1) verwendet werden: “Non-responsive”, “TMSD-responsive” und “RNA-templating”. Der “nicht reagierende” C-Stern (Feld A) besteht aus vier “Kernsträngen” mit unterschiedlichen Sequenzen, die den Vier-Wege-Übergang bilden. Vier identische cholesterinmodifizierte Oligonukleotide sind mit der Verbindung verbunden, wodurch sichergestellt wird, dass am Ende jedes Arms ein Cholesterinmolekül vorhanden ist. Die nicht reagierenden C-Sterne stellen einfache, inerte Gerüste für unäre und binäre Kondensate dar. Im “TMSD-responsiven” C-star (Panel B) wird die Verbindung zwischen den cholesterinisierten Strängen und der Verbindung durch einen “Toeholding Bridge”-Strang gewährleistet, der eine baumelnde einzelsträngige (ss)DNA “Toehold”-Domäne aufweist. In Gegenwart eines eingedrungenen DNA-Strangs mit einer komplementären Zehengriffdomäne kann eine Zehengriff-vermittelte Strangverdrängungsreaktion34 ausgelöst werden, wobei der Eindringling die Zehenhaltebrücke verdrängt, die Verbindung zwischen der Verbindung zwischen der Verbindung und den hydrophoben Einheiten unterbricht und die Demontage des DNA-Netzwerks32 auslöst. Schließlich enthält das “RNA Templating”-C-Profil (Panel C) eine “Base”-Modifikation, die zu einem “Bridge”-Strang komplementär ist, wobei letzterer das transkriptierbare ssDNA-Template für das Brokkoli-Aptamer29 verknüpft. Sequenzdetails der konstituierenden Oligonukleotide für die drei hier erwähnten Arten von C-Stern-Designs finden sich in der ergänzenden Tabelle 1 und in früheren Arbeiten29, 30, 32.

Figure 1
Abbildung 1. Schematische Darstellung von drei verschiedenen Designs von amphiphilen DNA-Nanosternen (C-Sternen). Oligonukleotidsequenzen für verschiedene Beispiele der hier beschriebenen C-Sterne finden Sie in der Ergänzenden Tabelle 1. (A) Schematische Darstellung eines C-Sterns, der zur Bildung von nicht responsiven Kondensaten ausgelegt ist, mit den Komponenten-Oligonukleotidsträngen “Core 1”, “Core 2”, “Core 3”, “Core 4” (in Rosatönen) und “Endcholesterin” (in Blautönen). Jede einzigartige Farbe stellt einen Oligonukleotidstrang mit einzigartiger Sequenz dar. “Core 1” und “Core 3” sind jeweils teilweise komplementär zu “Core 2” und “Core 4”, aber nicht komplementär zueinander. (B) Schematische Darstellung eines C-Sterns, der so konstruiert ist, dass er sich bei Zugabe eines eindringenden Strangs durch Zehengriff-vermittelte Strangverschiebung zerlegt, wie in der vorangegangenen Arbeit32 beschrieben. Dieser C-Stern besteht aus den Strängen “Core” und “Terminal Cholesterin” (grau gefärbt) sowie einem “Terminal complement” (in orange dargestellt) und einem “Toeholding bridge”-Strang (in dunklem Blaugrün dargestellt). Letzteres enthält einen Sechs-Nukleotid-Überhang, an den ein entsprechend gestalteter Eindringlingsstrang binden und anschließend den “Zehenhaltebrücken”-Strang vollständig verschieben kann, was die Dissoziation des zentralen Nanosternübergangs (bestehend aus “Kern 1”, “2”, “3” und “4”) von den Duplexen bewirkt, die aus den Strängen des “terminalen Komplements” und des “terminalen Cholesterins” bestehen. (C) Schematische Darstellung eines C-Sterns, der mit einem DNA-Template für ein RNA-Aptamer funktionalisiert wurde. Auch dieser setzt sich aus dem Strang “Terminales Cholesterin” und “Core 2, 3 und 4” (alle grau dargestellt) sowie einer erweiterten Version des “Core 1”-Strangs (pink dargestellt), einem “Base”-Strang (braun), einem “Bridge”-Strang (gelb) und dem “Aptamer-Template” (grün) zusammen. Der DNA-Duplex, der aus den beiden letztgenannten Strängen besteht, bildet die T7-Polymerase-Promotorregion, die die Startstelle der Transkription markiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

C-Stern-Kondensate bilden sich beim thermischen Glühen der konstituierenden Oligonukleotide, das in dem hier vorgestellten Protokoll in versiegelten Glaskapillaren mit einem rechteckigen Querschnitt mit hohem Aspektverhältnis durchgeführt wird. Diese Behälter bieten mehrere entscheidende Vorteile: i) Die Versiegelung stellt sicher, dass die Verdunstung über die (manchmal langsamen) Glühschritte vollständig verhindert wird; ii) Der flache Boden der Kapillaren in optischer Qualität ermöglicht die Abbildung der Selbstorganisation (oder Demontage) Transiente; iii) Das hohe Aspektverhältnis der Kapillaren stellt sicher, dass sich schwere Kondensate über eine breite, flache Fläche absetzen, wodurch die Wahrscheinlichkeit von Koaleszenz und Aggregation in späteren Stadien der Selbstorganisationstransiente, die in keilförmigen Behältern (z. B. Mikrozentrifugenröhrchen) auftreten würden, verringert wird und relativ monodisperse Kondensatpopulationen entstehen. iv) Das Glühen in einer länglichen Glaskapillare minimiert die Exposition der Probe gegenüber hydrophoben Grenzflächen (Luft, Kunststoff oder Öl), von denen beobachtet wurde, dass sie die Selbstorganisation stören, indem sie die amphiphilen cholesterinisierten Oligonukleotide rekrutieren. Sobald das Assemblierungsprotokoll abgeschlossen ist, können Kondensate aus Glaskapillaren extrahiert werden, um weitere Experimente durchzuführen, bei denen zusätzliche Reagenzien zum Einsatz kommen.

Protocol

HINWEIS: Das Protokoll ist in drei Abschnitte unterteilt. Abschnitt 1 beschreibt die erforderlichen Schritte, einschließlich der Herstellung von DNA-Oligonukleotiden und Glaskapillaren. Abschnitt 2 beschreibt die Aufbereitung von C-Stern-Kondensaten unterschiedlicher Bauart, einschließlich Ein- und Zweikomponenten-Ausführungen, und deren Extraktion aus den Glaskapillaren. Abschnitt 3 beschreibt die Verwendung von Einkomponenten-RNA-Templating-C-Stern-Kondensaten für die Synthese eines RNA-Aptamers. Der Benutzer muss die gute Laborpraxis durchgehend befolgen, sicherstellen, dass alle erforderlichen Risikobewertungen und -minderungen vorhanden sind, und geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA) tragen, einschließlich Handschuhe, Schutzbrille und Laborkittel. Die Reinigung von Glaskapillarrohren erfordert deren Beschallung, zunächst in einer Tensidlösung und dann in Isopropanol oder Ethanol. Die Extraktion von C-Stern-Kondensaten aus Kapillarrohren erfordert die Verwendung eines Diamant-Ritzstifts, um das Glas zu ritzen und zu brechen, mit der damit verbundenen Verletzungsgefahr durch Glassplitter. Die wichtigsten Materialien, Geräte und verwendeten Reagenzien sind in der Materialtabelle aufgeführt. Die meisten nicht-funktionalisierten Oligonukleotide werden vom Lieferanten unter Verwendung der Standardentsalzung aufgereinigt, mit Ausnahme der Stränge “erweiterter Core 1” und “Aptamer-Matrize”, die mit Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)-Aufreinigung bestellt werden. Cholesterinmodifizierte Oligonukleotide werden vom Lieferanten mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) aufgereinigt. 1. Voraussetzungen HINWEIS: Die folgenden Lösungen sollten in ultrareinem Wasser (Typ I) hergestellt und mit 0,22 μm Spritzenvorsatzfiltern filtriert werden: Tris-EDTA (TE)-Puffer, bestehend aus 10 mM Tris, 1 mM EDTA, bei einem pH-Wert von ~8,0; TE-Puffer ergänzt mit 2 M NaCl; und TE-Puffer, ergänzt mit 0,3 M NaCl. Pufferlösungen sollten innerhalb von 2 Wochen nach der Zubereitung verwendet und bei Nichtgebrauch bei 4 °C gelagert werden. Zusätzlich wird eine 1 Vol.-% Lösung eines alkalischen optischen Reinigungsmittels in Reinstwasser zur Reinigung der Glaskapillaren verwendet. Herstellung von DNA-Oligonukleotiden aus lyophilisiertem ZustandZentrifugieren Sie die Röhrchen mit den lyophilisierten DNA-Oligonukleotiden kurz (2000 x g für 10-30 s), um sicherzustellen, dass sich die Pellets mit lyophilisierter DNA am Boden sammeln.HINWEIS: Die Zentrifugation erfolgt bei Raumtemperatur (RT) für 10-30 s. Die hier verwendete Mini-Zentrifuge ist standardmäßig auf 2000 x g (6000 U/min) eingestellt. Fügen Sie die entsprechende Menge TE-Puffer hinzu, um jedes Oligonukleotid bei 100 μM zu rekonstituieren. Vortex gründlich, um eine vollständige Auflösung sicherzustellen, und drehen Sie dann die Röhrchen nach unten, um die gesamte Flüssigkeit gemäß Schritt 1.1.1 aufzufangen. Für jede Stammlösung ist die Extinktion bei 260 nm zu messen und die Endkonzentration unter Verwendung des Extinktionskoeffizienten der zu prüfenden Oligonukleotidsequenz zu berechnen.HINWEIS: Der Extinktionskoeffizient für eine gegebene Oligonukleotidsequenz ist in der Regel auf dem Datenblatt des Lieferanten zu finden, kann aber auch mit Online-Tools unter Verwendung des Nearest-Neighbor-Modells35 oder tabellarischer Werte des Extinktionskoeffizienten einzelner Nukleotide36 berechnet werden. Lagern Sie die rehydrierten Oligonukleotide für kurze Zeit (bis zu 1 Woche) bei 4 °C oder bei -20 °C für eine längerfristige Lagerung (bis zu 6 Monate). Reinigung von GlaskapillarrohrenBeschallung in 1 % alkalischem optischem Reinigungsmittel für optische Komponenten in entionisiertem Wasser.Nehmen Sie die erforderliche Anzahl von zu reinigenden Glaskapillarröhrchen und legen Sie sie in ein hohes, schmales Gefäß (z. B. ein Becherglas oder ein 15/50 mL-Zentrifugenröhrchen), so dass die Kapillaren nicht flach auf dem Boden des Behälters aufliegen. Gib das Reinigungsmittel in den Behälter und fülle ihn knapp über dem Niveau der Kapillarrohre. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen in den Kapillarrohren befinden – klopfen Sie bei Bedarf zum Entfernen. Decken Sie den Behälter locker ab (z. B. in Alufolie oder mit dem Deckel des Zentrifugenröhrchens, wobei Sie darauf achten müssen, dass er nicht fest verschlossen ist). Stellen Sie ein Beschallungswasserbad auf 40 °C ein, stellen Sie das abgedeckte Gefäß aufrecht in das Bad und beschallen Sie es 30 Minuten lang. Stellen Sie sicher, dass die Folie, falls sie verwendet wird, nicht mit dem Wasser im Beschallungsbad in Berührung kommt.HINWEIS: Das in dieser Studie verwendete Beschallungsbad hat standardmäßig eine Beschallungsfrequenz von 60 Hz und eine Beschallungsleistung von 150 W.ACHTUNG: Fügen Sie niemals Gegenstände zu einem Beschallungsbad hinzu oder entfernen Sie es daraus, während es läuft. Pausieren Sie immer zuerst das Protokoll. Sobald die Beschallung abgeschlossen ist, schalten Sie das Heizelement des Beschallungswasserbads aus und spülen Sie dann die Kapillaren im Behälter gründlich mit entionisiertem oder Reinstwasser – mindestens fünfmal, wobei Sie das Spülwasser jedes Mal entsorgen. Ultraschall in Isopropanol oder Ethanol.Geben Sie zu den Glaskapillarröhrchen im Reinigungsbehälter Isopropanol oder Ethanol (mindestens 70 %) und füllen Sie sie bis knapp über das Niveau der Kapillarröhrchen. Wie in Schritt 1.2.1.2 ist darauf zu achten, dass sich keine Luftblasen in den Kapillarrohren befinden, und den Behälter locker abdecken. Stellen Sie den Behälter aufrecht in das Beschallungsbad und beschallen Sie ihn 15-30 min lang.ACHTUNG: Isopropanol und Ethanol sind brennbar und haben Flammpunkte unterhalb der RT. Minimieren Sie die Menge an Lösungsmitteln, die während der Reinigung verwendet werden, indem Sie einen Behälter mit geeigneter Größe wählen, sicherstellen, dass die Behälter locker abgedeckt sind, und das Beschallungsbad während dieser Phase nicht unbeaufsichtigt lassen. Sobald die Beschallung abgeschlossen ist, entsorgen Sie das Isopropanol oder Ethanol ordnungsgemäß und trocknen Sie die Kapillaren unter Stickstoff, indem Sie sie mit einem fusselfreien Tuch behandeln. 2. Aufbereitung und Extraktion von C-Profil-Kondensaten (Abbildung 2) Abbildung 2: Beladung von C-Stern-Gemischen und Absaugung von Kondensaten aus Glaskapillarrohren. In allen Paneelen wurde das C-Stern-Gemisch durch eine wässrige Lösung von 25 mM Calcein ersetzt, um die Sichtbarkeit zu verbessern. (A-E) Wichtigste Schritte, die vor dem Glühen zu unternehmen sind, entsprechend den Protokollabschnitten 2.1 und 2.2. (F-J) Wichtige Schritte, die nach dem Glühen durchzuführen sind, entsprechend Protokollabschnitt 2.3. Während der Extraktion (Paneele (I-J)) sedimentieren DNA-Kondensate aus der Kapillare in das Pufferreservoir, solange das Mikrozentrifugenröhrchen vertikal gelagert wird. Kondensate sind mit bloßem Auge nicht sichtbar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Aufbereitung von C-Stern-Gemischen für Einkomponenten-KondensateANMERKUNG: Sequenzdetails für verschiedene Designs einzelner Komponenten finden sich in der Ergänzenden Tabelle 1 und in den früheren Arbeiten29, 30, 32. Die in den Schritten 2.1.9 und 2.2.2 definierten Slow-Annealing-Protokolle wurden entwickelt, um die Relaxation der Nanostar-Netzwerke in kompakte Morphologien zu gewährleisten, da die stark temperaturabhängigen rheologischen Eigenschaften der Nanostar-Netzwerke37 berücksichtigt werden.Die Oligonukleotid- und Pufferkomponenten variieren je nach gewünschtem C-Profil-Design. Bereiten Sie eine 60-μl-Mischung aus Einkomponenten-C-Stern-Kondensaten in einer Konzentration von 5 μM entweder für den nicht responsiven vierarmigen C-star, den TMSD-responsiven C-star oder den RNA-Templating-C-star vor. Pipettieren Sie für jedes Design die entsprechenden Komponenten, die in der ergänzenden Tabelle 2 aufgeführt sind, in ein separates Mikrozentrifugenröhrchen und mischen Sie es gründlich durch Pipettieren.HINWEIS: Es wird davon ausgegangen, dass alle Oligonukleotid-Stammlösungen eine Konzentration von 100 μM in TE aufweisen. Entnehmen Sie die gesamten 60 μl C-Stern-Lösung und pipettieren Sie vorsichtig, um die Mischung in das gereinigte, trockene Glaskapillarröhrchen zu injizieren, wie in Abbildung 2A gezeigt, wobei darauf zu achten ist, dass keine Luftblasen entstehen. Injizieren Sie mit einer Pipette etwa 9-12 μl Mineralöl in jedes Ende des Kapillarröhrchens und verschließen Sie die Probe so, dass keine freie Grenzfläche zwischen der C-Profil-Lösung und der Luft vorhanden ist (siehe Abbildung 2B). Trocknen Sie dann das Kapillarrohr vorsichtig mit Seidenpapier ab, um sicherzustellen, dass sich kein Öl auf der Außenseite befindet (Abbildung 2C), und achten Sie darauf, dass kein Mineralöl oder C-Stern-Lösung aus dem Kapillarrohr herauskommt. Das Endergebnis ist in Abbildung 2D dargestellt. Bereiten Sie eine kleine Charge zweikomponentigen Epoxidklebers vor, um jedes Ende des Kapillarrohrs mit der flachen Seite nach unten auf einen Glasabdeckglas zu kleben. Stellen Sie sicher, dass die Öffnungen des Rohrs vollständig mit Klebstoff bedeckt sind, um eine durchgehende Abdichtung zu bilden, wie in Abbildung 2E gezeigt. Zum Aushärten mindestens 3 Stunden beiseite stellen, vorzugsweise jedoch über Nacht. Überprüfen Sie nach ~30 min Aushärtung die Leimschicht auf Lücken in der Dichtung, die durch Luftblasen verursacht wurden. Wenn diese vorhanden sind, versiegeln Sie sie mit einer kleinen Menge Kleber. Wickeln Sie das auf das Deckglas geklebte Kapillarrohr in Alufolie ein und achten Sie darauf, dass die Folie an der Unterseite des Glasdeckglases flach bleibt. Die Folie sorgt für einen guten thermischen Kontakt zwischen derselben und dem Heizelement des Thermocyclers (siehe nächster Schritt). Legen Sie die eingewickelte Probe in einen Thermocycler und glühen Sie sie nach folgendem Protokoll: 30 Minuten lang bei 95 °C halten, dann von 85 °C auf 50 °C bei -0,04 °C·min-1 abkühlen und dann von 50 °C auf RT bei -0,5 °C·min-1 abkühlen.Lagern Sie die geglühten C-Profil-Kondensate über längere Zeiträume (Monate) bei 4 °C oder RT, solange die Kapillare verschlossen bleibt, da das thermische Glühen die Probe effektiv sterilisiert und Nukleasen denaturiert. Halten Sie die Kapillare während der Lagerung und Handhabung flach, um zu verhindern, dass Kondensate zu einem Ende hin sedimentieren und sich ansammeln. Aufbereitung von C-Stern-Gemischen für binäre KondensateHINWEIS: Um die Auswahl der C-Stern-Populationen für Doppelsternsysteme zu informieren, beziehen Sie sich auf die Arbeit von Malouf et al., die die Designregeln und das erwartete Phasenverhalten von C-Stern-Doppelsternkondensaten30 beschreibt.Zur Herstellung von binären Kondensaten werden 30 μl Volumen der in Schritt 2.1 beschriebenen C-Stern-Mischungen zu einem Gesamtvolumen von 60 μl kombiniert, gründlich gemischt, in die Kapillaren geladen und die Schritte 2.1.4 bis 2.1.8 befolgt. Legen Sie die verpackte Probe in einen Thermocycler und glühen Sie sie nach folgendem Protokoll: 30 Minuten lang bei 95 °C halten, dann von 85 °C auf 40 °C bei -0,01 °C-min-1 abkühlen und dann von 40 °C auf RT bei -0,1 °C-min-1 abkühlen. Extraktion von C-Stern-Kondensaten aus Kapillarrohren.Bereiten Sie ein großes (1,5 mL oder 2,0 mL) Mikrozentrifugenröhrchen mit 60 μl 0,3 M NaCl in TE-Puffer vor. Wickeln Sie die Kapillarprobe aus und ritzen Sie mit einem Diamant-Ritzstift die Unterseite des Deckglases an jedem inneren Ende des geklebten Bereichs ein (Abbildung 2F). Brechen Sie das Deckglas in diesem Bereich ab und entsorgen Sie es entsprechend. Reinigen Sie die Kapillarröhrchen gründlich mit Ethanol und trocknen Sie sie. Ritzen Sie jedes Ende der Kapillarrohre mit dem Diamantritzstift ein, zuerst mit der Unterseite (Abbildung 2G), dann drehen Sie die Röhren um und ritzen Sie sie mit der richtigen Seite nach oben.Stellen Sie sicher, dass sich die Schnittlinien nicht mit der Öl-Wasser-Schnittstelle überlappen. Sie müssen sich im wässrigen Bereich befinden, um zu verhindern, dass Öl in der extrahierten Probe verbleibt. Brechen Sie die Enden der Kapillarröhrchen ab (Abbildung 2H), behalten Sie den mittleren Teil des Röhrchens bei und entsorgen Sie den Rest. Legen Sie das geschnittene Kapillarröhrchen in das in Schritt 2.3.1 vorbereitete Mikrozentrifugenröhrchen und achten Sie darauf, dass der Boden des Kapillarröhrchens mit der Pufferlösung in Kontakt kommt (Abbildung 2I). Die Kondensate sedimentieren durch die Schwerkraft aus dem Rohr in das Pufferreservoir; Lassen Sie dies mindestens 10 Minuten lang stattfinden (Abbildung 2J). Entfernen Sie das abgeschnittene Kapillarrohr und entsorgen Sie es ordnungsgemäß. Dieser schonende Extraktionsansatz begrenzt das Risiko einer Kondensataggregation. 3. Transkription eines RNA-Aptamers aus RNA-Templating C-Stern-Kondensaten HINWEIS: Für die Herstellung des Brokkoli-RNA-Aptamers wird eine Lösung von Difluor-4-hydroxybenzyliden-Imidazolidinon (DFHBI) benötigt – DFHBI-Pulver wird zunächst als Stammlösung bei 10 mM in Dimethylsulfoxid (DMSO) hergestellt, das dann in RNase- und DNase-freiem Wasser auf 600 μM verdünnt wird. Waschen von RNA-Templating C-Stern-KondensatenHINWEIS: C-Stern-Kondensate mit RNA-Templating werden dreimal gewaschen, um sicherzustellen, dass ungebundene Template-Oligonukleotide entfernt werden.Lassen Sie die Lösung der extrahierten Kondensate mindestens 5 Minuten lang absetzen und entfernen Sie dann etwa die Hälfte des Volumens des Überstands.Bei einem Volumen von 60 μl extrahierter Kondensate entfernen Sie zwischen 25 und 30 μl des Überstands. Pipettieren Sie von der Oberseite des Flüssigkeitsspiegels, um die Anzahl der während dieses Schritts entfernten Kondensate zu minimieren. Geben Sie das gleiche Volumen von 0,3 M NaCl in TE zu, um den entfernten Überstand zu ersetzen, und mischen Sie durch Pipettieren. Wiederholen Sie die beiden vorherigen Schritte für insgesamt drei Zyklen. Herstellung des T7-TranskriptionsgemischesHINWEIS: Das T7-Transkriptionsgemisch wird mit dem CellScript T7-FlashScribe Transkriptionskit hergestellt. Schritt 3.2.2 ist eine Modifikation des Protokolls des Herstellers, das hier zu finden ist38. Hier beschreiben wir die Transkription des Brokkoli-RNA-Aptamers, das bei Bindung die Fluoreszenz in DFHBI induziert. Bei anderen leuchtenden Aptameren ist das in Schritt 3.2.2 beschriebene Volumen von DFHBI durch das entsprechende Fluorogen zu ersetzen. Bei anderen Transkripten entfernen Sie diese Komponente vollständig.Bereiten Sie eine Stammlösung von 10 mM DFHBI in DMSO vor und verdünnen Sie dann ein Aliquot auf eine Endkonzentration von 600 μM mit RNase- und DNase-freiem Wasser. Tauen Sie die Komponenten des Transkriptionskits auf Eis auf und pipettieren Sie dann Folgendes mit sterilen Pipettenspitzen bei Raumtemperatur in ein autoklaviertes Mikrozentrifugenröhrchen: 2 μl 10x T7-Transkriptionspuffer (im Transkriptionskit enthalten), 1,8 μl 100 mM ATP, 1,8 μl 100 mM CTP, 1,8 μl 100 mM UTP, 1,8 μl 100 mM GTP, 2 μl 100 mM DTT, 2 μl 600 μM DFHBI, 0,5 μl RNase-Inhibitor, 2 μl T7-Enzymlösung (im Transkriptionskit enthalten). Mischen Sie die Lösung vorsichtig durch Pipettieren. Verwenden Sie die Transkriptionsmischung für Schritt 3.3 (Synthese des RNA-Transkripts) unmittelbar nach der Vorbereitung. Synthese des RNA-TranskriptsIn eine für die Mikroskopie geeignete Kammer pipettieren Sie 3,3 μl der gewaschenen Kondensate, die aus RNA-Templating-C-Sternen hergestellt wurden, und fügen Sie das Gesamtvolumen des zuvor hergestellten Transkriptionsgemisches hinzu. Nehmen Sie Mikroskopiebilder für eine Dauer von 18 Stunden auf, beginnend unmittelbar nach der Zugabe des Transkriptionsgemisches zu den Kondensaten.HINWEIS: Die Mikroskopieeinstellungen hängen vom vorbereiteten System ab. Stellen Sie sicher, dass die entsprechenden Anregungs- und Emissionseinstellungen für alle Fluorophore in der Probe verwendet werden, zusammen mit den Expositionszeiten, die im Verlauf der Transkription nicht zu einer Sättigung führen. Wie bei jedem Zeitraffer sollte ein Kompromiss zwischen einer ausreichend hohen Laser- oder LED-Leistung für ein gutes Signal und der Minimierung des Risikos von Photobleaching gefunden werden. Photobleaching über lange Zeiträume wird bei LED-basierten Systemen im Vergleich zu laserbasierten Systemen minimiert. Empfohlene Bildgebungsintervalle: 20 Minuten für die ersten 2 Stunden und 30 Minuten danach.

Representative Results

Nach dem Glühen können C-Stern-Kondensate direkt im Kapillarrohr oder nach der Extraktion abgebildet werden, um ihre Bildung zu bestätigen. Bei allen C-Profil-Designvarianten sollte man unterschiedliche kugelförmige oder polyedrische Kondensate mit einem Durchmesser von etwa 10-50 μm beobachten, wobei sich letztere bei der Kristallisation bilden 28,32. Bei Einkomponenten-Kondensaten sollten die Kondensate diskret und gleichmäßig aussehen und können je nac…

Discussion

Das hier beschriebene Protokoll bietet einen Ansatz für die Herstellung von Ein- oder Zweikomponenten-Kondensaten aus amphiphilen DNA-Nanosternen, mit Designvariationen, um unterschiedliche Reaktionen in die Kondensate einzuführen. Das gegebene Protokoll erzeugt Kondensate in einer Pufferlösung von 0,3 M NaCl in TE, aber die Pufferbedingungen können durch entsprechende Modifikation der oben aufgeführten Volumina geändert werden. Frühere Arbeiten haben die Bildung von C-Stern-Kondensaten in 0,2 M NaCl in TE und 0,1…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

LM, LDM und DT danken der Unterstützung durch den Europäischen Forschungsrat (ERC) im Rahmen des Forschungs- und Innovationsprogramms Horizon 2020 (ERC-STG Nr. 851667 – NANOCELL). LDM bedankt sich für die Unterstützung durch ein Royal Society Research Grant for Research Fellows (RGF/R1/180043) und die Unterstützung durch ein Forschungsstipendium der Royal Society University (UF160152, URF/R/221009).

Materials

0.22 μm syringe filters Sigma-Aldrich SLGVR33RB
24 x 60 mm #1.5 Rectangular cover glasses, Menzel Gläser VWR 631-0853
2-Propanol Sigma-Aldrich 34683
6 L Ultrasonic Cleaner with Digital Timer and Heat, 230 VAC Cole-Parmer WZ-08895-11
Araldite Rapid Adhesive 2 Part Epoxy Glue RS ARA-400005
Bio-Rad C1000 thermal cycler Bio-Rad 1851197
Brand Microcentrifuge Tube 2 mL with Locking Lid Fisher Scientific 15338665 2 mL microcentrifuge tubes for the extraction of C-star condensates
Diamond Scribing Pen RS 394-217
Difluoro-4-hydroxybenzylidene imidazolidinone (DFHBI) Sigma-Aldrich SML1627
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich 472301
Eppendorf PCR Clean Colorless Safe-Lock Centrifuge Tubes Fisher Scientific 0030123301 0.5 mL microcentrifuge tubes for the preparation of C-star mixtures
Ethanol Absolute 99.8+% Fisher Scientific 10437341 70% ethanol is sufficient for cleaning purposes
Fisherbrand ZX4 IR Vortex Mixer Fisherbrand 13284769
Hellmanex III Hellma 9-307-011-4-507
Hollow Rectangle Capillaries ID 0.40 x 4.00 mm, 50 mm in length CM Scientific 2540-50
Mineral oil Sigma-Aldrich 69794
Mini Centrifuge, 230 V PRISM(TM) Z763128
NaCl Sigma-Aldrich S3014
NanoDrop One Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-ONE-W Used to measure absorbance of oligonucleotides for concentration calculations
Oligonucleotides Integrated DNA Technologies Custom Oligonucleotide sequences are unique to the C-star design required.
ScriptGuard RNase inhibitor CELLSCRIPT C-SRI6310K RNase inhibitor
T7-FlashScribe Transcription Kit Cambio C-ASF3507
Tris-EDTA buffer, 100x stock solution Sigma-Aldrich 574793
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water Invitrogen 10977035
VWR Spec-Wipe 3 Wipers VWR 21914-758

Referenzen

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Malouf, L., Tanase, D. A., Di Michele, L. Synthetic Condensates and Cell-Like Architectures from Amphiphilic DNA Nanostructures. J. Vis. Exp. (207), e66738, doi:10.3791/66738 (2024).

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