Wir stellen ein Protokoll zur Herstellung synthetischer biomolekularer Kondensate vor, die aus amphiphilen DNA-Nanosternen bestehen, ausgehend von ihren DNA-Oligonukleotiden. Kondensate werden entweder aus einer einzelnen Nanosternkomponente oder aus zwei Komponenten hergestellt und so modifiziert, dass sie die In-vitro-Transkription von RNA aus einem eingebetteten DNA-Template aufrechterhalten.
Synthetische Tröpfchen und Kondensate werden immer häufiger Bestandteile fortschrittlicher biomimetischer Systeme und synthetischer Zellen, wo sie zur Etablierung von Kompartimenten und zur Aufrechterhaltung lebensechter Reaktionen verwendet werden können. Synthetische DNA-Nanostrukturen haben aufgrund ihrer programmierbaren Form, ihrer chemischen Funktionalisierung und ihres Selbstorganisationsverhaltens ein erhebliches Potenzial als kondensatbildende Bausteine gezeigt. Wir haben kürzlich gezeigt, dass amphiphile DNA-“Nanosterne”, die durch Markierung von DNA-Verbindungen mit hydrophoben Anteilen gewonnen werden, eine besonders robuste und vielseitige Lösung darstellen. Die resultierenden amphiphilen DNA-Kondensate können so programmiert werden, dass sie komplexe, mehrteilige interne Architekturen aufweisen, strukturell auf verschiedene externe Reize reagieren, Makromoleküle synthetisieren, Nutzlasten einfangen und freisetzen, morphologische Transformationen durchlaufen und mit lebenden Zellen interagieren. Hier demonstrieren wir Protokolle zur Herstellung amphiphiler DNA-Kondensate ausgehend von den DNA-Oligonukleotiden. Wir werden uns mit (i) Einkomponenten-Systemen befassen, die einheitliche Kondensate bilden, (ii) Zweikomponenten-Systemen, die Kern-Schale-Kondensate bilden, und (iii) Systemen, in denen die Kondensate modifiziert werden, um die In-vitro-Transkription von RNA-Nanostrukturen zu unterstützen.
Synthetische Zellen sind Geräte im Mikrometermaßstab (10-50 μm), die von unten nach oben konstruiert sind, um Funktionen und Strukturen bestehender biologischer Zellen nachzubilden 1,2. Synthetische Zellen sind häufig durch Membranen gebunden, die aus Lipid-Doppelschichtvesikeln 3,4,5,6,7, Polymersomen 8,9 oder Proteinosomen10,11 aufgebaut sind, die auch zur Etablierung einer internen Kompartimentalisierung verwendet werden können12,13. Inspiriert von den membranlosen Organellen, von denen bekannt ist, dass sie verschiedene Funktionalitäten in lebenden Zellen aufrechterhalten14, gewinnen Strukturen wie polymere Koazervate, biomolekulare Kondensate und Hydrogele als vielseitige und robuste Alternativen an Bedeutung, um sowohl die äußere als auch die innere Kompartimentierung in synthetischen Zellen zu etablieren 15,16,17,18.
Unter Nutzung des vielseitigen Toolkits der DNA-Nanotechnologie19 wurden mehrere Lösungen entwickelt, um synthetische Tröpfchen und Kondensate aus der Selbstorganisation künstlicher DNA-Nanostrukturen zu entwickeln, deren Größe, Form, Funktionalität, Wertigkeit und gegenseitige Wechselwirkungen genau programmiert werden können20. DNA-Tröpfchen oder -Kondensate sind biokompatibel und können als Gerüste sowohl für synthetische Zellen als auch für Organellen fungieren, chemische und biomolekulare Reaktionenbeherbergen 21, Informationen verarbeiten22,23, Ladungen einfangen und freisetzen24,25 und strukturelle Reaktionen aufrechterhalten26.
Unter den vielfältigen Designs kondensatbildender DNA-Nanostrukturen haben sich amphiphile DNA-Nanosterne – sogenannte C-Sterne – als robust und vielseitig erwiesen27. C-Sterne sind einfache verzweigte Motive, die aus einer festen DNA-Verbindung (typischerweise vierpolig) bestehen, aus der doppelsträngige (ds)DNA-Arme hervorgehen28. Die Arme werden dann mit hydrophoben Anteilen, typischerweise Cholesterin, bestückt, wodurch die Nanostrukturen amphiphil werden und ihre Kondensation nach einem einfachen Eintopfglühen angetrieben wird. C-Stern-Kondensate ermöglichen eine präzise strukturelle und funktionelle Programmierbarkeit, einschließlich der Möglichkeit, Mehrkammerarchitekturen29,30 zu etablieren, strukturell auf DNA- und Kationenauslöser31 zu reagieren, Makromoleküle29 zu synthetisieren, Nutzlasten einzufangen und freizusetzen32 und mit lebenden Zellenzu interagieren 33. Im Folgenden werden wir Protokolle zur Herstellung von C-Stern-Kondensaten ausgehend von ihren Oligonukleotiden beschreiben und diskutieren.
Das Protokoll fasst die Aufbereitung von unären (einkomponentigen) und binären (zweikomponentigen) Kondensaten zusammen, wobei drei verschiedene C-Star-Designs (Abbildung 1) verwendet werden: “Non-responsive”, “TMSD-responsive” und “RNA-templating”. Der “nicht reagierende” C-Stern (Feld A) besteht aus vier “Kernsträngen” mit unterschiedlichen Sequenzen, die den Vier-Wege-Übergang bilden. Vier identische cholesterinmodifizierte Oligonukleotide sind mit der Verbindung verbunden, wodurch sichergestellt wird, dass am Ende jedes Arms ein Cholesterinmolekül vorhanden ist. Die nicht reagierenden C-Sterne stellen einfache, inerte Gerüste für unäre und binäre Kondensate dar. Im “TMSD-responsiven” C-star (Panel B) wird die Verbindung zwischen den cholesterinisierten Strängen und der Verbindung durch einen “Toeholding Bridge”-Strang gewährleistet, der eine baumelnde einzelsträngige (ss)DNA “Toehold”-Domäne aufweist. In Gegenwart eines eingedrungenen DNA-Strangs mit einer komplementären Zehengriffdomäne kann eine Zehengriff-vermittelte Strangverdrängungsreaktion34 ausgelöst werden, wobei der Eindringling die Zehenhaltebrücke verdrängt, die Verbindung zwischen der Verbindung zwischen der Verbindung und den hydrophoben Einheiten unterbricht und die Demontage des DNA-Netzwerks32 auslöst. Schließlich enthält das “RNA Templating”-C-Profil (Panel C) eine “Base”-Modifikation, die zu einem “Bridge”-Strang komplementär ist, wobei letzterer das transkriptierbare ssDNA-Template für das Brokkoli-Aptamer29 verknüpft. Sequenzdetails der konstituierenden Oligonukleotide für die drei hier erwähnten Arten von C-Stern-Designs finden sich in der ergänzenden Tabelle 1 und in früheren Arbeiten29, 30, 32.
Abbildung 1. Schematische Darstellung von drei verschiedenen Designs von amphiphilen DNA-Nanosternen (C-Sternen). Oligonukleotidsequenzen für verschiedene Beispiele der hier beschriebenen C-Sterne finden Sie in der Ergänzenden Tabelle 1. (A) Schematische Darstellung eines C-Sterns, der zur Bildung von nicht responsiven Kondensaten ausgelegt ist, mit den Komponenten-Oligonukleotidsträngen “Core 1”, “Core 2”, “Core 3”, “Core 4” (in Rosatönen) und “Endcholesterin” (in Blautönen). Jede einzigartige Farbe stellt einen Oligonukleotidstrang mit einzigartiger Sequenz dar. “Core 1” und “Core 3” sind jeweils teilweise komplementär zu “Core 2” und “Core 4”, aber nicht komplementär zueinander. (B) Schematische Darstellung eines C-Sterns, der so konstruiert ist, dass er sich bei Zugabe eines eindringenden Strangs durch Zehengriff-vermittelte Strangverschiebung zerlegt, wie in der vorangegangenen Arbeit32 beschrieben. Dieser C-Stern besteht aus den Strängen “Core” und “Terminal Cholesterin” (grau gefärbt) sowie einem “Terminal complement” (in orange dargestellt) und einem “Toeholding bridge”-Strang (in dunklem Blaugrün dargestellt). Letzteres enthält einen Sechs-Nukleotid-Überhang, an den ein entsprechend gestalteter Eindringlingsstrang binden und anschließend den “Zehenhaltebrücken”-Strang vollständig verschieben kann, was die Dissoziation des zentralen Nanosternübergangs (bestehend aus “Kern 1”, “2”, “3” und “4”) von den Duplexen bewirkt, die aus den Strängen des “terminalen Komplements” und des “terminalen Cholesterins” bestehen. (C) Schematische Darstellung eines C-Sterns, der mit einem DNA-Template für ein RNA-Aptamer funktionalisiert wurde. Auch dieser setzt sich aus dem Strang “Terminales Cholesterin” und “Core 2, 3 und 4” (alle grau dargestellt) sowie einer erweiterten Version des “Core 1”-Strangs (pink dargestellt), einem “Base”-Strang (braun), einem “Bridge”-Strang (gelb) und dem “Aptamer-Template” (grün) zusammen. Der DNA-Duplex, der aus den beiden letztgenannten Strängen besteht, bildet die T7-Polymerase-Promotorregion, die die Startstelle der Transkription markiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
C-Stern-Kondensate bilden sich beim thermischen Glühen der konstituierenden Oligonukleotide, das in dem hier vorgestellten Protokoll in versiegelten Glaskapillaren mit einem rechteckigen Querschnitt mit hohem Aspektverhältnis durchgeführt wird. Diese Behälter bieten mehrere entscheidende Vorteile: i) Die Versiegelung stellt sicher, dass die Verdunstung über die (manchmal langsamen) Glühschritte vollständig verhindert wird; ii) Der flache Boden der Kapillaren in optischer Qualität ermöglicht die Abbildung der Selbstorganisation (oder Demontage) Transiente; iii) Das hohe Aspektverhältnis der Kapillaren stellt sicher, dass sich schwere Kondensate über eine breite, flache Fläche absetzen, wodurch die Wahrscheinlichkeit von Koaleszenz und Aggregation in späteren Stadien der Selbstorganisationstransiente, die in keilförmigen Behältern (z. B. Mikrozentrifugenröhrchen) auftreten würden, verringert wird und relativ monodisperse Kondensatpopulationen entstehen. iv) Das Glühen in einer länglichen Glaskapillare minimiert die Exposition der Probe gegenüber hydrophoben Grenzflächen (Luft, Kunststoff oder Öl), von denen beobachtet wurde, dass sie die Selbstorganisation stören, indem sie die amphiphilen cholesterinisierten Oligonukleotide rekrutieren. Sobald das Assemblierungsprotokoll abgeschlossen ist, können Kondensate aus Glaskapillaren extrahiert werden, um weitere Experimente durchzuführen, bei denen zusätzliche Reagenzien zum Einsatz kommen.
Das hier beschriebene Protokoll bietet einen Ansatz für die Herstellung von Ein- oder Zweikomponenten-Kondensaten aus amphiphilen DNA-Nanosternen, mit Designvariationen, um unterschiedliche Reaktionen in die Kondensate einzuführen. Das gegebene Protokoll erzeugt Kondensate in einer Pufferlösung von 0,3 M NaCl in TE, aber die Pufferbedingungen können durch entsprechende Modifikation der oben aufgeführten Volumina geändert werden. Frühere Arbeiten haben die Bildung von C-Stern-Kondensaten in 0,2 M NaCl in TE und 0,1…
The authors have nothing to disclose.
LM, LDM und DT danken der Unterstützung durch den Europäischen Forschungsrat (ERC) im Rahmen des Forschungs- und Innovationsprogramms Horizon 2020 (ERC-STG Nr. 851667 – NANOCELL). LDM bedankt sich für die Unterstützung durch ein Royal Society Research Grant for Research Fellows (RGF/R1/180043) und die Unterstützung durch ein Forschungsstipendium der Royal Society University (UF160152, URF/R/221009).
0.22 μm syringe filters | Sigma-Aldrich | SLGVR33RB | |
24 x 60 mm #1.5 Rectangular cover glasses, Menzel Gläser | VWR | 631-0853 | |
2-Propanol | Sigma-Aldrich | 34683 | |
6 L Ultrasonic Cleaner with Digital Timer and Heat, 230 VAC | Cole-Parmer | WZ-08895-11 | |
Araldite Rapid Adhesive 2 Part Epoxy Glue | RS | ARA-400005 | |
Bio-Rad C1000 thermal cycler | Bio-Rad | 1851197 | |
Brand Microcentrifuge Tube 2 mL with Locking Lid | Fisher Scientific | 15338665 | 2 mL microcentrifuge tubes for the extraction of C-star condensates |
Diamond Scribing Pen | RS | 394-217 | |
Difluoro-4-hydroxybenzylidene imidazolidinone (DFHBI) | Sigma-Aldrich | SML1627 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | |
Eppendorf PCR Clean Colorless Safe-Lock Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 0030123301 | 0.5 mL microcentrifuge tubes for the preparation of C-star mixtures |
Ethanol Absolute 99.8+% | Fisher Scientific | 10437341 | 70% ethanol is sufficient for cleaning purposes |
Fisherbrand ZX4 IR Vortex Mixer | Fisherbrand | 13284769 | |
Hellmanex III | Hellma | 9-307-011-4-507 | |
Hollow Rectangle Capillaries ID 0.40 x 4.00 mm, 50 mm in length | CM Scientific | 2540-50 | |
Mineral oil | Sigma-Aldrich | 69794 | |
Mini Centrifuge, 230 V | PRISM(TM) | Z763128 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
NanoDrop One Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | Used to measure absorbance of oligonucleotides for concentration calculations |
Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | Custom | Oligonucleotide sequences are unique to the C-star design required. |
ScriptGuard RNase inhibitor | CELLSCRIPT | C-SRI6310K | RNase inhibitor |
T7-FlashScribe Transcription Kit | Cambio | C-ASF3507 | |
Tris-EDTA buffer, 100x stock solution | Sigma-Aldrich | 574793 | |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Invitrogen | 10977035 | |
VWR Spec-Wipe 3 Wipers | VWR | 21914-758 |