Isolierung, Expansion und Differenzierung von fibro-adipogenen Vorläuferzellen aus dem Modell der stacheligen Maus
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von fibro-adipogenen Vorläuferzellen (FAPs) des Skelett- und Herzmuskels aus stacheligen Mäusen (Acomys) durch enzymatische Dissoziation und fluoreszenzaktivierte Zellsortierung. Die aus diesem Protokoll gewonnenen FAPs können effektiv zu Myofibroblasten und Adipozyten erweitert und differenziert werden.
Abstract
Aufgrund ihres außergewöhnlichen Reparaturprogramms ist die Stachelmaus ein aufstrebendes Forschungsmodell für die regenerative Medizin. Fibro-adipogene Vorläuferzellen sind geweberesidente Zellen, die in der Lage sind, sich in Adipozyten, Fibroblasten und Chondrozyten zu differenzieren. Fibro-adipogene Vorläuferzellen sind von grundlegender Bedeutung für die Orchestrierung der Geweberegeneration, da sie für den Umbau der extrazellulären Matrix nach Verletzungen verantwortlich sind. Diese Studie konzentriert sich auf die Untersuchung der spezifischen Rolle von fibro-adipogenen Vorläuferzellen bei der Herzreparatur und der Regeneration der Skelettmuskulatur der Stachelmaus. Zu diesem Zweck wurde ein Protokoll für die Aufreinigung von fibro-adipogenen Vorläuferzellen der Stachelmaus mittels Durchflusszytometrie aus enzymatisch dissoziierten Skelett- und Herzmuskeln optimiert. Die aus diesem Protokoll erhaltene Population ist in der Lage, sich in vitro zu vermehren und kann zu Myofibroblasten und Adipozyten differenziert werden. Dieses Protokoll bietet Forschern ein wertvolles Werkzeug, um die charakteristischen Eigenschaften der Stachelmaus zu untersuchen und sie mit dem Mus musculus zu vergleichen. Dies wird Erkenntnisse liefern, die das Verständnis der regenerativen Mechanismen in diesem faszinierenden Modell voranbringen könnten.
Introduction
Ursprünglich für ihre außergewöhnlich empfindliche Haut und ihre bemerkenswerte Fähigkeit, Hautverletzungen zu reparieren, bekannt, hat die Stachelmaus im Vergleich zu Mus musculuseine überlegene Regenerationsfähigkeit in verschiedenen Organsystemen wie Bewegungsapparat, Nieren, Zentralnervensystem und Herz-Kreislauf gezeigt 1,2.
Fibro-adipogene Vorläuferzellen (FAPs) sind eine Untergruppe von Stromazellen, die in verschiedenen Geweben beheimatet sind, einschließlich Skelett- und Herzmuskeln. Diese Zellen besitzen eine einzigartige Fähigkeit, sich in vivo und in vitro an fibrogene und adipogene Linien zu binden 3,4. FAPs spielen eine entscheidende Rolle bei der Geweberegeneration, indem sie die extrazelluläre Matrix modulieren und die Funktionen anderer Zelltypen unterstützen, die am Reparaturprozess beteiligt sind. In der Skelettmuskulatur werden FAPs als Reaktion auf Verletzungen aktiviert und erleichtern die Differenzierung von Muskelstammzellen und die Myogenese 5,6. Bei ischämischen Verletzungen des Herzens legen FAPs Narbengewebe ab, um die Integrität des Myokards zu erhalten. Im Gegensatz zu Muskeln werden kardiale FAPs chronisch aktiviert und tragen zum pathologischen Umbau bei 7,8.
Frühere Studien haben gezeigt, dass die extrazelluläre Matrix der Stachelmaus im Vergleich zu Mus musculus eine andere Zusammensetzung, Struktur und Eigenschaften aufweist, die die Regeneration unterstützen. Bei Muskel- und Herzverletzungen wurde festgestellt, dass FAPs zu einer überlegenen Heilung bei Stachelmäusen beitragen 11,12,13. Das Verständnis des Verhaltens und der regulatorischen Kontrolle von stacheligen Maus-FAPs und Stroma könnte Aufschluss über den Mechanismus hinter ihren regenerativen Fähigkeiten geben. Während FAPs in anderen Tiermodellen, wie z. B. in Mus musculus14,15, ausführlich untersucht werden, gibt es derzeit keine veröffentlichten Protokolle für die Isolierung von stacheligen Maus-FAPs. Die Entwicklung eines solchen Protokolls würde eine bedeutende Lücke auf diesem Gebiet schließen und es den Forschern ermöglichen, die zellulären und molekularen Mechanismen zu untersuchen, die dem regenerativen Potenzial der Stachelmaus zugrunde liegen.
Dieses Protokoll beschreibt ein robustes und reproduzierbares Protokoll zur Isolierung, Erweiterung und Differenzierung von Skelett- und Herzmuskel-FAPs aus stacheligen Mäusen. Das hier beschriebene Protokoll liefert qualitativ hochwertige Einzelzellsuspensionen, die für die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) geeignet sind. Durch die Verwendung von rh-TGFβ1 oder einem kompatiblen kommerziell erhältlichen Medium, zwei Methoden, die häufig zur Differenzierung von Mus musculus FAPs16 verwendet werden, behalten die sortierten stacheligen FAPs ihre Fähigkeit zur Differenzierung entlang der fibrogenen bzw. adipogenen Linie bei (Abbildung 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Stachelmausgewebe reagiert empfindlicher auf die Spannungen bei der Dissoziation des Gewebes, und es gibt mehrere Aspekte dieses Protokolls, die darauf abzielen, Stress zu minimieren, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu verbessern. Für die Probenvorbereitung wird die serielle enzymatische Dissoziationstechnik eingesetzt, um die Konzentration des erforderlichen Enzyms zu senken. Mit fortschreitender enzymatischer Verdauung nimmt die enzymatische Aktivität ab. Durch den Ersatz durch fr…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Andy Johnson und Justin Wong, UBC flow core, für ihre Expertise und Hilfe bei der Optimierung des FACS-Protokolls sowie den Mitarbeitern der Tiereinrichtung des UBC Biomedical Research Center für die Pflege von Stachelmäusen. Abbildung 1 wurde mit Biorender erstellt. Abbildung 2 wurde mit der FlowJo-Software erstellt.
Materials
| 0.5M EDTA | Invitrogen | 15575–038 | |
| 1.7 mL Microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
| 15 mL centrifuge tube | Falcon | 352096 | |
| 1x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14190-144 | |
| 20 mL syringe | BD | 309661 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | D3571 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 48 well flat-bottom tissue culture plate | Falcon | 53078 | |
| 5 mL polypropylene | Falcon | 352063 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
| 5 mL syringe | BD | 309646 | |
| 50 mL centrifuge tube | Falcon | 352070 | |
| 60 mm Petri dish | Falcon | 353002 | |
| 96 well V-bottom tissue culture plate | Corning | 3894 | |
| Acomys dimidiatus mice (spiny mice) | kindly gifted by Dr. Ashley W. Seifert (University of Kentucky). | ||
| Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Anti-perilipin (1:100) | Sigma | P1873 | |
| Anti-SMA (1:100) | Invitrogen | 14-9760-82 | |
| APC PDGFRa (1:800) | Abcam | ab270085 | |
| BD PrecisionGlide Needle 18 G | BD | 305195 | |
| BD PrecisionGlide Needle 23 G | BD | 305145 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7906-100g | |
| BV605 CD31 (1:500) | BD biosciences | 744359 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| Donkey anti-mouse Alexa 555 (1:1000) | Invitrogen | A31570 | |
| Donkey anti-rabbit Alexa 647 (1:1000) | Invitrogen | A31573 | |
| Donkey serum | Sigma | S30-100ML | |
| FACS sorter – MoFlo Astrios 5 lasers | Beckman coulter | B52102 | |
| Fetal bovine serum | Gemini | 100-500 | |
| Fine scissors | FST | 14058-11 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Forceps | FST | 11051-10 | |
| Hemostat | FST | 91308-12 | |
| human FGF-basic recombinant protein (bFGF) | Gibco | 13256029 | |
| Human TGF beta 1 recombinant protein (TGFb1) | eBiosciences | 14-8348-62 | |
| Incubator – Heracell 160i CO2 | ThermoFisher | 51033557 | |
| Inverted microscope – Revolve | ECHO | n/a | |
| Liberase | Roche | 5401127001 | |
| Mouse MesenCult Adipogenic Differentiation 10x Supplement | STEMCELL technologies | 5507 | |
| Mouse on mouse (MOM) blocking reagent | Vector Laboratories | MKB-2213 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P1648-500g | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140–122 | |
| PicoLab Mouse Diet 20 | LabDiet | 3005750-220 | |
| Propidium iodide (PI) | Invitrogen | P3566 | |
| Transport vial 5mL tube | Caplugs Evergreen | 222-3005-080 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9036-19-5 |
Referenzen
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