Hier stellen wir die Schritt-für-Schritt-Vorbereitung von vorgemischten, lyophilisierten rekombinasebasierten isothermen Amplifikationen und Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-basierten Reaktionen vor, die für den Nachweis von Nukleinsäure-Biomarkern von Krankheitserregern oder anderen genetischen Markern von Interesse verwendet werden können.
Die molekulare Diagnostik durch CRISPR-basierte Detektion (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) weist eine hohe diagnostische Genauigkeit und Eigenschaften auf, die für den Einsatz in Point-of-Care-Umgebungen geeignet sind, wie z. B. schnelle Durchlaufzeiten für Ergebnisse, bequeme, einfache Auslesungen und keine komplizierten Instrumente. Die Reaktionen können jedoch aufgrund ihrer vielen Komponenten und manuellen Handhabungsschritte am Point-of-Care umständlich durchzuführen sein. Darin bieten wir ein schrittweises, optimiertes Protokoll für den robusten Nachweis von Krankheitserregern und genetischen Markern mit rekombinasebasierter isothermer Amplifikation und CRISPR-basierten Reagenzien, die vorgemischt und dann in leicht zu lagernden und gebrauchsfertigen Formaten gefriergetrocknet werden. Vorgemischte, gefriergetrocknete Reagenzien können für den sofortigen Einsatz rehydriert werden und behalten eine hohe Amplifikations- und Nachweiseffizienz bei. Wir bieten auch einen Leitfaden zur Fehlerbehebung für häufig auftretende Probleme bei der Vorbereitung und Verwendung von vorgemischten, gefriergetrockneten Reagenzien für die CRISPR-basierte Diagnostik, um die Nachweisplattform für die breitere Diagnostik-/Gentest-Community zugänglicher zu machen.
CRISPR-basierte Diagnostika zum Nachweis von Nukleinsäure-Biomarkern wurden erstmals im Jahr 2017 berichtet 1,2,3,4 und haben sich seitdem in mehreren Ländern in mehreren Ländern als Diagnostika der nächsten Generation mit von der Food and Drug Administration (FDA) zugelassenen Tests bewährt, insbesondere für den Nachweis von RNA des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) 5,6,7,8 . Über die Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19) hinaus haben sich die Technologien als wirksam für den Nachweis verschiedener Viren und Bakterien 9,10,11,12,13, genetischer Krankheitsmutationen und Deletionen erwiesen und können zum Nachweis von Protein- und niedermolekularen Biomarkern entwickelt werden 2,12. CRISPR-basierte Diagnostika kombinieren häufig isotherme Amplifikationsmethoden wie die Rekombinase-Polymerase-Amplifikation (RPA) oder die schleifenvermittelte isotherme Amplifikation (LAMP)14,15 mit der CRISPR-basierten Detektion unter Verwendung von RNA-gesteuerten CRISPR-assoziierten (Cas) Enzymen mit “kollateraler” Endonuklease-Aktivität nach Zielerkennung3. Die doppelte Verwendung von isothermer Amplifikation und CRISPR-basierter Detektion verleiht den Technologien mehrere wünschenswerte Eigenschaften, insbesondere eine hohe diagnostische Genauigkeit, die sich der der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) als Goldstandard annähert, und die Fähigkeit, kleine Sequenzunterschiede, einschließlich Einzelnukleotid-Polymorphismen, zu multiplexen und zu detektieren 1,9.
Die genauesten Versionen der CRISPR-basierten Diagnostik enthalten jedoch mehrere Komponenten und Schritte und können mit Laien oder am Point-of-Care (POC) kompliziert durchzuführen sein. Um dieser Herausforderung zu begegnen, den Einsatz hochpräziser CRISPR-basierter Diagnostik auf POC-Umgebungen auszuweiten, haben wir Protokolle zur Herstellung von vorgemischten, lyophilisierten, rekombinasebasierten isothermen Amplifikations- und CRISPR-basierten Nachweisreaktionen entwickelt, die einfach zu verwenden und zu lagern sind7. Diese Protokolle sollten bestehende ausgezeichnete Protokolle zur CRISPR-basierten Diagnostik14 ergänzen, die zusätzliche Informationen über die Herstellung biochemischer Komponenten, die für die CRISPR-basierte Diagnostik benötigt werden7, Designrichtlinien1 und Formulierungen unter Verwendung alternativer isothermer Amplifikationstechniken 2,14,15,16 und Cas-Enzyme12 enthalten. Letztendlich hoffen wir, dass die CRISPR-basierte Diagnostik dazu beitragen kann, einen schnellen, kostengünstigen und sensitiven Nukleiniknachweis in Umgebungen zu realisieren, in denen tragbare und instrumentenfreie Analysen erforderlich sind 1,9,17.
Wir verwenden in unseren Protokollen hauptsächlich die Kombination aus RPA- und Cas13-basierter Detektion. RPA funktioniert bei Umgebungstemperaturen (37-42 °C) und hat daher einen geringen Energie- und Gerätebedarf. Andere isotherme Amplifikationsreaktionen erfordern höhere Temperaturen (LAMP, 60-65 °C; Strang-Verschiebungs-Amplifikation (SDA), 60 °C; exponentielle Amplifikationsreaktion (EXPAR), 55 °C; und helikaseabhängige Amplifikation (HDA), 65 °C)2. Das Design von RPA-Primern ist im Gegensatz zu LAMP-Primern ebenfalls nicht komplex und kann auf Multiplex-Amplifikation erweitert werden 7,9,14. Auch wenn das Multiplexen über zwei Ziele mit RPA in der Praxis schwierig ist, gibt es klare Richtlinien für die Gestaltung von Multiplex-RPA-Primern, um Interferenzen zu minimieren18.
Während Verschleppungskontaminationen im zweistufigen Arbeitsablauf ein großes Problem bleiben, sind die generierten Amplikons von RPA klein und verursachen im Vergleich zu großen konkatemerischen Amplikons aus LAMP14 weniger wahrscheinlich eine Verschleppungskontamination. RPA-Primer können nach den Standardrichtlinien14 ausgelegt werden: Sie sind in der Regel 25-35 Nukleotide lang und haben Schmelztemperaturen von 54 bis 67 °C. Die Amplikongröße sollte kleiner als 200 Basenpaare sein. Das reverse Transkriptase-Enzym (RT) kann zu RPA hinzugefügt werden, um die Amplifikation aus RNA zu ermöglichen, und bei der reversen Transkriptions-RPA (RT-RPA) wird ein weiteres Enzym, Ribonuklease H (RNase H), typischerweise in kleinen Mengen hinzugefügt, um die Auflösung des resultierenden RNA-DNA-Hybrids zu unterstützen und die Amplifikationsreaktion zu fördern 5,19. Um die T7-Transkription für den Cas13-basierten Nachweis zu ermöglichen, kann der T7-RNA-Polymerase-Promotor am 5′-Ende des vorderen RPA-Primers platziert werden.
Nachdem Amplikons aus RPA erzeugt wurden, können sie mit crRNA-programmierten Cas-Enzymen nachgewiesen werden. Unter den verschiedenen Cas-Enzymen, die für die Amplikondetektion verwendet werden können, bevorzugen wir RNA-targetende Cas13-Varianten aufgrund ihrer hohen Spaltungsaktivität1 und gut charakterisierten Polynukleotid-Spaltpräferenzen 7,9, von denen letztere für die Multiplexdetektion verwendet werden können. Die crRNA-Sequenz für Cas13 ist so konzipiert, dass sie komplementär (reverse komplementär) zur Zielstelle in der produzierten RNA mit Spacer- und Direct Repeat (DR)-Sequenzen ist. Die crRNA-Sequenz und die RPA-Primer sollten sich nicht überlappen, um einen unerwünschten Cas-basierten Nachweis von Off-Target-Amplifikationsprodukten zu vermeiden, der die Hintergrund- und Falsch-Positiv-Ergebnisse erhöht14.
Der Cas-basierte Nachweis beruht auf verschiedenen Nachweismodalitäten, um die Spaltung von Reporter-Nukleinsäuremolekülen (RNA-Reporter für Cas13-basierte Reaktionen) zu überwachen1,2,14. Zu den verschiedenen Detektionsmodalitäten gehören Kolorimetrie, elektrochemische Auslesungen, Fluoreszenz, Sequenzieranzeigen und Lateral-Flow-Strips2. Wir konzentrieren uns auf die Fluoreszenzauslesung bei einer Vielzahl von Fluorophoren und Reportern wie Cyanin 5 (Cy5), Rhodamin X (ROX) und Carboxyfluorescein (FAM), die mit einer einzigen blauen LED-Lichtquelle effektiv angeregt werden können, und deren Fluoreszenz mit einem Mikroplatten-Reader oder einem Echtzeit-Thermocycler analysiert wird 7,14. Darüber hinaus ist die Fluoreszenzauslesung einfach einzurichten und ermöglicht eine kontinuierliche Überwachung, die eine Quantifizierung in Echtzeit ermöglicht. Die Multiplex-RPA-Präamplifikation und die Multiplex-Cas13-basierte Detektion unter Verwendung von Cas-Enzymen können mit mehrfarbigen Fluoreszenzauslesungen für den gleichzeitigen Nachweis mehrerer genetischer Ziele kombiniert werden 2,7.
In unseren Protokollen amplifizieren wir zunächst RNA isotherm mit RT-RPA, indem wir die RNA-Probe zur lyophilisierten Form des RT-RPA-Reagenzes hinzufügen (Abbildung 1). Während der RT-RPA wird der T7-Promotor an das erzeugte doppelsträngige DNA-Amplikon angehängt. Danach werden die RPA-Produkte auf den lyophilisierten Cas13-basierten Nachweis übertragen, der auch die T7-RNA-Polymerase enthält. Diese Nachweisreaktion wandelt DNA-Amplikons in RNA um (über die T7-RNA-Polymerase), die mit crRNA-programmiertem Cas13 leicht nachgewiesen werden kann. Target-aktiviertes Cas13 spaltet Reportermoleküle, um ein nachweisbares Fluoreszenzsignal zu erzeugen 2,7,14. Während sich die Protokolle hier auf den Nachweis durch Leptotrichia wadei (LwaCas13a) beziehen, können sie auf den gleichzeitigen, multiplexierten Nachweis von bis zu vier Zielen unter Verwendung orthogonaler Cas13- und Cas12-Enzyme erweitert werden 7,9. RPA- und Cas-basierte Nachweisreaktionen können ebenfalls in einem einzigen Röhrchen kombiniert werden, wenn auch mit einem Verlust an Empfindlichkeit14.
Abbildung 1: Arbeitsablauf bei der CRISPR-basierten Detektion. Der Workflow veranschaulicht den Nachweis von zwei Zielgenen. Zunächst werden interessante Regionen innerhalb des DNA-Ziels mit RPA isotherm amplifiziert; Die Reaktion kann mit reverser Transkription (RT-RPA) beim Nachweis von RNA-Zielen durchgeführt werden. Danach wandelt die T7-Transkription dsDNA-Amplikons in RNAs um, die wiederum von Cas13-crRNA-Komplexen erkannt werden, die in der Lage sind, kollaterale RNase-Aktivität bei der Zielbindung auszulösen. Die Spaltung von abgeschreckten Fluoreszenzreportern erzeugt Fluoreszenzsignale, die mit einem Mikroplatten-Reader überwacht, durch einen LED-Transilluminator visualisiert oder mit einem Echtzeit-Thermocycler verwendet werden können. Abkürzungen: CRISPR = Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats; RT = reverse Transkription; RPA = Rekombinase-Polymerase-Amplifikation; Cas = CRISPR-assoziiertes Protein; LED = Leuchtdiode. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Die Hauptmerkmale der hier vorgestellten Protokolle sind die Vormischformulierungen für die Lyophilisation. Das Vormischen vereinfacht die Anwendung der Reaktion und verbessert die Reproduzierbarkeit, aber viele Komponenten der RPA- und Cas-basierten Detektion, insbesondere die reverse Transkription und einige labile Cofaktoren wie ATP, sind in Lösung nicht stabil. Daher formulieren wir die vorgemischten Lösungen so, dass sie für die Langzeitlagerung und den einfachen Transport und Einsatz gefriergetrocknet werden können 1,9,20. Vorgemischte, gefriergetrocknete Reagenzien tragen ebenfalls zur Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit bei, da ein höheres Probenvolumen (und damit ein höherer DNA/RNA-Input) hinzugefügt werden kann, um die Reaktion zu rekonstituieren10. In unseren Formulierungen verwenden wir hauptsächlich Trehalose21 als Kryoprotektivum in lyophilisierten RPA- und Cas-basierten Nachweisreaktionen7. Neben der Konservierung der Reagenzien fördert Trehalose auch die Reaktionen durch Erhöhung der Enzymstabilisierung 16,22,23,24 und Senkung der Schmelztemperaturen von dsDNA23. Die Erforschung anderer Stabilisatoren 5,7,21,25,26 über Trehalose hinaus kann zu noch optimaleren Formulierungen für verschiedene Anwendungsszenarien führen.
Dieses Protokoll enthält wichtige Schritte. Für die Bereichstrennung wird empfohlen, separate Räume für die Nukleinsäureextraktion, die Mastermix-Vorbereitung (Bereich vor der Amplifikation), die Probenzugabe und die Amplikondetektion (Bereich nach der Amplifikation) zu verwenden. Jeder Bereich sollte mit einem separaten Satz von Werkzeugen und Geräten eingestellt werden. Bringen Sie keine Werkzeuge von einem Bereich in einen anderen, insbesondere nicht aus dem Bereich nach der Ver…
The authors have nothing to disclose.
C.U. bedankt sich für die Finanzierung durch die Siam Commercial Bank im Rahmen des VISTEC-Siriraj Frontier Research Center und durch den Thailand Science Research and Innovation (TSRI), Fundamentalfonds, Geschäftsjahr 2024, Fördernummer FRB670026/0457. R.K. und M.P. werden durch Stipendien- bzw. Forschungsassistenzmittel von VISTEC unterstützt.
Material | |||
Betaine solution | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
DEPC-Treated water | Invitrogen | AM9915G | |
Dithiothreitol (DTT) | Merck | 3870-25GM | |
EpiScript reverse transcriptase | Lucigen | ERT12925K | |
Gly-Gly-Gly | Sigma-Aldrich | SIA-50239-1G | |
LwaCas13a | Producing in-house | Strain name:Leptotrichia wadei, Abbreviation: Lwa, Protein name: LwaCas13a | |
Magnesium chloride solution, 1M | Sigma-Aldrich | M1028-10X1ML | |
NxGenT7 RNA polymerase | Lucigen | 30223-2 | |
Poly(ethylene glycol) | Sigma-Aldrich | 81300-1KG | |
Potassium acetate solution, 5M | Sigma-Aldrich | 95843-100ML-F | |
Riobnucleotide Solution Mix | NEB | N0466L | |
RNase H | NEB | M0297L | |
Sucrose | TCI | TCI-S0111-500G | |
Trehalose Dihydrate | Sigma-Aldrich | SIA-90210-50G | |
Trizma hydrochloride solution, 1M, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2194-100ML | |
TwistAmp Basic kit | TwistDx | TABAS03KIT | |
Equipment | |||
BluPAD Dual LED Blue/White light transilluminator | Bio-Helix | BP001CU | |
Dry Bath Dual Block | ELITE | 4-2-EL-02-220 | Model: EL-02 |
Fluorescence microplate reader | Tecan | 30050303 | Model: Infinite 200 Pro |
Freeze dryer | LABCONCO | 794001030 | FreeZone Triad Benchtop Freeze Dryer |
Microplate 384-well | Greiner | GDE0784076 | F-Bottom, small volume, Hibase, Med. Binding, Black |
Real-time thermal cycler (CFX Connect Real-Time PCR System) | Bio-Rad | 185-5201 | Model: CFX Connect Optics Module |
Oligonucleotide | |||
s-gene forward RPA primer | IDT | GAAATTAATACGACTCAC TATAGGGAGGTTTCAAAC TTTACTTGCTTTACATAGA |
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s-gene reverse RPA primer | IDT | TCCTAGGTTGAAGA TAACCCACATAATAAG |
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n-gene forward RPA primer | IDT | GAAATTAATACGACTC ACTATAGGAACTTCTC CTGCTAGAATGGCTG |
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n-gene reverse RPA primer | IDT | CAGACATTTTGCTCTC AAGCTGGTTCAATC |
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LwaCas13a-crRNA for the s gene | Synthego | GAUUUAGACUACCCCAAAAAC GAAGGGGACUAAAACGCAGCA CCAGCUGUCCAACCUGAAGAAG |
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LwaCas13a-crRNA for the n gene | Synthego | GAUUUAGACUACCCCAAAAACG AAGGGGACUAAAACAAAGCAAG AGCAGCAUCACCGCCAUUGC |
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FAM-polyU-IABkFQ reporter | IDT | 56-FAM/rUrUrUrUrU/3IABkFQ | |
O-hannah_cytb_F RPA primer | IDT | GAAATTAATACGACTCACTA TAGGGTACGGATGAACCATA CAAAACCTTCACGCAATCG |
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O-hannah_cytb_R RPA primer | IDT | AAGATCCATAGTAGATTC CTCGTGCGATGTGGATA |
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synT7crRNA13a_ O_hannah | IDT | GCGCATCCATATTCTTCAT CTGCATTTAGTTTTAGTCC CCTTCGTTTTTGGGGTA GTCTAAATCCCCTATAGT GAGTCGTATTAATTTC |