Summary

Blutentnahme und Hormonmessung zur Bestimmung des Stadiums im Eierstockzyklus bei Weißbüschelaffen

Published: July 05, 2024
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Summary

Dieses Protokoll beschreibt Blut- und Urinproben zur Messung des Progesteron-/Östradiol- und Choriongonadotropinspiegels zur Bestimmung des Stadiums des Eierstockzyklus. Der Hormonspiegel wird verwendet, um den Zeitpunkt des Eisprungs vorherzusagen und zu bestimmen, und Hormone werden injiziert, um den Eierstockzyklus und das Eizellwachstum zu regulieren.

Abstract

Weißbüschelaffen sind kleine Neuweltaffen. Da viele ihrer biologischen Mechanismen denen des Menschen ähneln, sind Weißbüschelaffen potenziell nützlich für die medizinische und humanbiologische Forschung in einer Reihe von Bereichen, wie z. B. Neurowissenschaften, regenerative Medizin und Entwicklung. Es fehlt jedoch an Literatur, die Methoden für viele grundlegende Experimente und Verfahren beschreibt. Im Folgenden werden detaillierte Methoden zur Bestimmung des Spiegels von Sexualhormonen (Progesteron, Östradiol und Choriongonadotropin) bei Weißbüschelaffen beschrieben. Die Messung dieser Hormone ermöglicht die Vorhersage des Stadiums im Eierstockzyklus, das bei Weißbüschelaffen typischerweise 26-30 Tage beträgt; Eine genaue Bestimmung ist unerlässlich für die Entnahme von Eizellen/Zygoten zum richtigen Zeitpunkt und für die Vorbereitung der Wirtsweibchen auf die Erzeugung von gentechnisch veränderten Weißbüschelaffen.

Darüber hinaus ist die Messung des Sexualhormonspiegels nützlich für endokrinologische und ethlogische, frühe Entwicklungs- und reproduktionsbiologische Studien. Dieses Protokoll enthält eine detaillierte Beschreibung der Verfahren zur Blutentnahme aus der Oberschenkelvene, zur Trennung von Plasma zur Hormonmessung, zur Messung des Choriongonadotropinspiegels mittels Urin und Plasma, zum Zurücksetzen des Eierstockzyklus durch Injektion eines Prostaglandin-F2α-Analogons zur Verkürzung und Synchronisierung des Zyklus und zur Förderung des Follikelwachstums und des Eisprungs durch Injektion von follikelstimulierendem Hormon und Choriongonadotropin. Mit Hilfe dieser Protokolle können die Stadien des Eierstockzyklus für die rechtzeitige Entnahme von Eizellen/Zygoten bestimmt werden.

Introduction

Der Weißbüschelaffe (Callithrix jacchus) ist ein kleiner Neuweltaffe mit vielen ähnlichen Merkmalen wie der Mensch, und die Dauer seines Eierstockzyklus beträgt 26-30 Tage 1,2. Studien über die frühe Entwicklung und die Erzeugung von gentechnisch veränderten Weißbüschelaffen erfordern die Entnahme von Eizellen und Zygoten in bestimmten Stadien des Eierstockzyklus. Daher ist eine genaue Bestimmung des Stadiums von entscheidender Bedeutung und kann durch Messung der Blutspiegel der Hormone Progesteron (P4) und Östradiol (E2)2,3 abgeschätzt werden. Diese Hormone fördern das Wachstum der Gebärmutterschleimhaut, das für die Einnistung notwendig ist. P4 wird aus dem Gelbkörper hergestellt, der sich unmittelbar nach dem Eisprung in den Eierstöcken bildet. E2 wird von den Eierstockfollikeln als Reaktion auf das follikelstimulierende Hormon (FSH) aus dem Hypothalamus-Hypophysen-Komplex im Gehirn sezerniert. Der E2-Spiegel steigt mit zunehmender Reife des Follikels an und erreicht vor dem Eisprungseinen Höhepunkt 3. Hohe E2-Spiegel verursachen beim Menschen die pulsierende Freisetzung des luteinisierenden Hormons (LH) über den Hypothalamus-Hypophysen-Komplex; Dieser LH-Anstieg induziert den Eisprung. Bei Weißbüschelaffen erfuhr das LH-Gen jedoch im Laufe der Evolution eine Degeneration, und der Eisprung wird stattdessen durch die Freisetzung von Choriongonadotropin (CG) aus der Hypophyse induziert, das eine ähnliche Struktur wie LH hat 4,5.

Der Eierstockzyklus kann durch Hormoninjektionen gesteuert werden. FSH-Injektionen wirken beim Menschen auf die FSH-Rezeptoren der Eierstöcke und werden zur Förderung der Östrogensynthese und des Follikelwachstums eingesetzt6. Die Injektion von humanem CG (hCG) als Ersatz für LH am Ende der Follikelphase wird verwendet, um den Eisprung beim Menschen zu stimulieren7. CG-Injektionen werden auch zur Behandlung von menschlicher Unfruchtbarkeit eingesetzt, da CG das Corpus luteum in der Frühschwangerschaft stimuliert, was zu einer erhöhten P4-Produktion führt. Prostaglandin F2α (PGF2α) Injektionen setzen den Eierstockzyklus zurück8. Bei Hausrindern wird die PGF2α-Injektion verwendet, um die Lutealphase zu verkürzen und den Brunstzyklus für das Reproduktionsmanagement zu synchronisieren.

Obwohl Weißbüschelaffen und Menschen ähnliche biologische Mechanismen haben und damit ideale Modelltiere sind, fehlt es an Literatur, die grundlegende Methoden für viele häufig verwendete Techniken beschreibt. Die Blutentnahme ist eine der am häufigsten verwendeten Techniken 9,10,11,12. Anfänger haben jedoch manchmal Schwierigkeiten, die Vene zu finden. Daher wurden in dieser Studie anatomische Analysen der Venenregion femoralis durchgeführt. Basierend auf anatomischen Beobachtungen führt dieses Protokoll die proximale Region des Femurdreiecks als eine einfache Stelle für die Venenpunktion ein.

Protocol

Alle Methoden, bei denen Weißbüschelaffen eingesetzt werden, basieren auf hohen ethischen und tierschutzrechtlichen Standards und wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des National Center for Child Health and Development genehmigt. Die Tiere, die hier eingesetzt wurden, waren Einzel- oder Paarställe (ein Weibchen und ein Männchen) mit 12 Stunden Licht pro Tag. 1. Blutentnahme der Oberschenkelvene Bereiten Sie ein…

Representative Results

Einzelheiten zu den in dieser Studie verwendeten Tieren sind in Tabelle 1 aufgeführt. Anatomische Analysen der Vena femoralisAnatomische Analysen der Oberschenkelvene wurden an einem 2-jährigen männlichen Weißbüschelaffen (I 7713M) durchgeführt, der sich einer Euthanasie unterziehen musste. Die Oberschenkelvenen und Arterien befinden sich im Femurdreieck. Das femorale Dreieck bildet sich an den Grenzen zwischen der B…

Discussion

Die Lokalisierung der Vene ist der wichtigste Schritt bei der Blutentnahme. Basierend auf anatomischen Beobachtungen führt dieses Protokoll den proximalen Bereich im Femurdreieck als einfache Stelle für die Blutentnahme bei Weißbüschelaffen ein. In diesem Bereich kann problemlos eine Blutentnahme aus einer großen Vene durchgeführt werden. Selbst bei Verwendung dieses Protokolls kommt es jedoch manchmal zu einer Verletzung einer Arterie. Bei einer Verletzung einer Arterie wird empfo…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Chunshen Shen, Hiroko Akutsu, Fumiyo Sugiki, Yuuna Hashimoto, Hina Naritomi, Yuuki Sakamoto und Mikiko Horigome für ihre Unterstützung bei der Etablierung dieses Protokolls und bei der täglichen Pflege der Weißbüschelaffen; Takayuki Mineshige für die Kommentare zum Manuskript; Yukiko Abe und den Mitgliedern des Aiba-Labors für den Austausch von Zygoten-Entnahmetechniken; CIEA für die Weitergabe von Informationen über die Behausung von Weißbüschelaffen und Experimente, die sie über 40 Jahre hinweg kultiviert haben. Diese Forschung wurde von AMED, JST und KAKENHI unter den Fördernummern JP19gm6310010, JP20gm6310010, JP21gm6310010 und JP22gm6310010 (AMED), JPMJPR228B (JST), 20H05764, 20H03177 und 22K18356 (KAKENHI) unterstützt.

Materials

AIA-360 Tosoh Corporation 0019945 Hormone measurement (P4/E2)
AIA-PACK DILUENT CONCENTRATE Tosoh Corporation 0020956 Hormone measurement (P4/E2)
AIA-PACK SUBSTRATE SET II Tosoh Corporation 0020968 Hormone measurement (P4/E2)
AIA-PACK WASH CONCENTRATE Tosoh Corporation 0020955 Hormone measurement (P4/E2)
CMS-1 CLEA Japan Marmoset food
Estrumate MSD Animal Health PGF2alpha analog (cloprostenol)
Gonal-f Subcutaneous Injection 150 Merck Biopharma Co., Ltd. FSH
Gonatropin for intramuscular injection 1000 ASKA Pharmaceutical Co., Ltd. 872413 hCG
Heparin sodium injection solution 5,000 units/5 mL Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. 224122458 Blood collection
Immunochromatographic Test Kit for Detection of Common Marmoset Chorionic Gonadotropin (Dual Checker) CLEA Japan, Inc. Determining CG level
Low-profile double-arm microscope illumination LPF-SD SHIOKAZE GIKEN Desk lamp for blood collection
Marmoset blood collection restraint device JIC Japan JM-1006 Blood collection
http://www.jic-japan.jp/prd/marmoset/prd016.html
email: vi@jic-japan.jp
Metacam 0.05% Boehringer Ingelheim Animal Health Japan Co., Ltd. Hematoma treatment
Sample Cup, 3 mL, PS, for Tosoh 360 and AIA-600 II, 1000/Bag Globe Scientific 110913 Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK iE2 Tosoh Corporation 0025224 Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK iE2 CALIBRATOR SET Tosoh Corporation 0025324 Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK iE2 SAMPLE DILUTING SOLUTION Tosoh Corporation 0025524 Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK PROGIII Tosoh Corporation 0025240 Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK PROGIII CALIBRATOR SET Tosoh Corporation 0025340 Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK PROGIII SAMPLE DILUTING SOLUTION Tosoh Corporation  0025540 Hormone measurement (P4/E2)
Syringe with 25 G (0.50 x 25 mm) needle TERUMO SS-01T2525 Blood collection
Tensolvet 5.000 I.E. gel. Dechra Pharmaceuticals 14033492 Hematoma treatment
TOSOH MULTI-CONTROL SET Tosoh Corporation 0015965 Hormone measurement (P4/E2)

Referenzen

  1. Kholkute, S. D. Plasma progesterone levels throughout the ovarian cycle of the common marmoset (Callithrix jacchus). Primates. 25 (1), 123-126 (1984).
  2. Harding, R. D., Hulme, M. J., Lunn, S. F., Henderson, C., Aitken, R. J. Plasma progesterone levels throughout the ovarian cycle of the common marmoset (Callithrix jacchus). J Med Primatol. 11 (1), 43-51 (1982).
  3. Gilchrist, R. B., Wicherek, M., Heistermann, M., Nayudu, P. L., Hodges, J. K. Changes in follicle-stimulating hormone and follicle populations during the ovarian cycle of the common marmoset. Biol Reprod. 64 (1), 127-135 (2001).
  4. Gromoll, J., et al. A new subclass of the luteinizing hormone/chorionic gonadotropin receptor lacking exon 10 messenger RNA in the New World monkey (Platyrrhini) lineage. Biol Reprod. 69 (1), 75-80 (2003).
  5. Müller, T., et al. Chorionic gonadotrophin beta subunit mRNA but not luteinising hormone beta subunit mRNA is expressed in the pituitary of the common marmoset (Callithrix jacchus). J Mol Endocrinol. 32 (1), 115-128 (2004).
  6. Pacchiarotti, A., et al. Ovarian stimulation protocol in IVF: an up-to-date review of the literature. Curr Pharm Biotechnol. 17 (4), 303-315 (2016).
  7. Ezcurra, D., Humaidan, P. A review of luteinising hormone and human chorionic gonadotropin when used in assisted reproductive technology. Reprod Biol Endocrinol. 12, 95 (2014).
  8. Lopez-Gatius, F. Ovarian response to prostaglandin F(2alpha) in lactating dairy cows: A clinical update. J Reprod Dev. 68 (2), 104-109 (2022).
  9. Marini, R. P., Wachtman, L. M., Tardif, S. D., Mansfield, K., Fox, J. G. . The Common Marmoset in Captivity and Biomedical Research. , (2018).
  10. Schultz-Darken, N. J. Sample collection and restraint techniques used for common marmosets (Callithrix jacchus). Comp Med. 53 (4), 360-363 (2003).
  11. Hopper, J., Kubik, M. Common marmosets. Handbook of Exotic Pet. , 27-42 (2020).
  12. Harlow, C. R., Hearn, J. P., Hodges, J. K. Ovulation in the marmoset monkey: endocrinology, prediction and detection. J Endocrinol. 103 (1), 17-24 (1984).
  13. Ludlage, E., Mansfield, K. Clinical care and diseases of the common marmoset (Callithrix jacchus). Comp Med. 53 (4), 369-382 (2003).
  14. Summers, P. M., Wennink, C. J., Hodges, J. K. Cloprostenol-induced luteolysis in the marmoset monkey (Callithrix jacchus). J Reprod Fertil. 73 (1), 133-138 (1985).
  15. Takahashi, T., et al. Birth of healthy offspring following ICSI in in vitro-matured common marmoset (Callithrix jacchus) oocytes. PLoS One. 9 (4), e95560 (2014).
  16. Tomioka, I., Takahashi, T., Shimada, A., Yoshioka, K., Sasaki, E. Birth of common marmoset (Callithrix jacchus) offspring derived from in vitro-matured oocytes in chemically defined medium. Theriogenology. 78 (7), 1487-1493 (2012).
  17. Abe, Y., et al. Efficient marmoset genome engineering by autologous embryo transfer and CRISPR/Cas9 technology. Sci Rep. 11 (1), 20234 (2021).
  18. Summers, P. M., Shephard, A. M., Taylor, C. T., Hearn, J. P. The effects of cryopreservation and transfer on embryonic development in the common marmoset monkey, Callithrix jacchus. J Reprod Fertil. 79 (1), 241-250 (1987).
  19. Thomson, J. A., Kalishman, J., Hearn, J. P. Nonsurgical uterine stage preimplantation embryo collection from the common marmoset. J Med Primatol. 23 (6), 333-336 (1994).
  20. Hanazawa, K., et al. Minimally invasive transabdominal collection of preimplantation embryos from the common marmoset monkey (Callithrix jacchus). Theriogenology. 78 (4), 811-816 (2012).
  21. Ishibashi, H., et al. Efficient embryo transfer in the common marmoset monkey (Callithrix jacchus) with a reduced transfer volume: a non-surgical approach with cryopreserved late-stage embryos. Biol Reprod. 88 (5), 115 (2013).
  22. Kishimoto, K., et al. Establishment of novel common marmoset embryonic stem cell lines under various conditions. Stem Cell Res. 53, 102252 (2021).
  23. Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. J Appl Toxicol. 21 (1), 15-23 (2001).
  24. Daskalaki, M., Drummer, C., Behr, R., Heistermann, M. The use of alfaxalone for short-term anesthesia can confound serum progesterone measurements in the common marmoset: a case report. Primate Biol. 9 (2), 23-28 (2022).
  25. Hodges, J. K., Cottingham, P. G., Summers, P. M., Liang, Y. N. Controlled ovulation in the marmoset monkey (Callithrix jacchus) with human chorionic gonadotropin following prostaglandin-induced luteal regression. Fertil Steril. 48 (2), 299-305 (1987).
  26. Barrett, J., Abbott, D. H., George, L. M. Extension of reproductive suppression by pheromonal cues in subordinate female marmoset monkeys, Callithrix jacchus. J Reprod Fertil. 90 (2), 411-418 (1990).
  27. Barrett, J., Abbott, D. H., George, L. M. Sensory cues and the suppression of reproduction in subordinate female marmoset monkeys, Callithrix jacchus. J Reprod Fertil. 97 (1), 301-310 (1993).

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Diesen Artikel zitieren
Takahashi, S., Watanabe, T. Blood Sampling and Hormone Measurement for Determining the Stage in the Ovarian Cycle in Marmosets. J. Vis. Exp. (209), e66691, doi:10.3791/66691 (2024).

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