Dieses Protokoll beschreibt Blut- und Urinproben zur Messung des Progesteron-/Östradiol- und Choriongonadotropinspiegels zur Bestimmung des Stadiums des Eierstockzyklus. Der Hormonspiegel wird verwendet, um den Zeitpunkt des Eisprungs vorherzusagen und zu bestimmen, und Hormone werden injiziert, um den Eierstockzyklus und das Eizellwachstum zu regulieren.
Weißbüschelaffen sind kleine Neuweltaffen. Da viele ihrer biologischen Mechanismen denen des Menschen ähneln, sind Weißbüschelaffen potenziell nützlich für die medizinische und humanbiologische Forschung in einer Reihe von Bereichen, wie z. B. Neurowissenschaften, regenerative Medizin und Entwicklung. Es fehlt jedoch an Literatur, die Methoden für viele grundlegende Experimente und Verfahren beschreibt. Im Folgenden werden detaillierte Methoden zur Bestimmung des Spiegels von Sexualhormonen (Progesteron, Östradiol und Choriongonadotropin) bei Weißbüschelaffen beschrieben. Die Messung dieser Hormone ermöglicht die Vorhersage des Stadiums im Eierstockzyklus, das bei Weißbüschelaffen typischerweise 26-30 Tage beträgt; Eine genaue Bestimmung ist unerlässlich für die Entnahme von Eizellen/Zygoten zum richtigen Zeitpunkt und für die Vorbereitung der Wirtsweibchen auf die Erzeugung von gentechnisch veränderten Weißbüschelaffen.
Darüber hinaus ist die Messung des Sexualhormonspiegels nützlich für endokrinologische und ethlogische, frühe Entwicklungs- und reproduktionsbiologische Studien. Dieses Protokoll enthält eine detaillierte Beschreibung der Verfahren zur Blutentnahme aus der Oberschenkelvene, zur Trennung von Plasma zur Hormonmessung, zur Messung des Choriongonadotropinspiegels mittels Urin und Plasma, zum Zurücksetzen des Eierstockzyklus durch Injektion eines Prostaglandin-F2α-Analogons zur Verkürzung und Synchronisierung des Zyklus und zur Förderung des Follikelwachstums und des Eisprungs durch Injektion von follikelstimulierendem Hormon und Choriongonadotropin. Mit Hilfe dieser Protokolle können die Stadien des Eierstockzyklus für die rechtzeitige Entnahme von Eizellen/Zygoten bestimmt werden.
Der Weißbüschelaffe (Callithrix jacchus) ist ein kleiner Neuweltaffe mit vielen ähnlichen Merkmalen wie der Mensch, und die Dauer seines Eierstockzyklus beträgt 26-30 Tage 1,2. Studien über die frühe Entwicklung und die Erzeugung von gentechnisch veränderten Weißbüschelaffen erfordern die Entnahme von Eizellen und Zygoten in bestimmten Stadien des Eierstockzyklus. Daher ist eine genaue Bestimmung des Stadiums von entscheidender Bedeutung und kann durch Messung der Blutspiegel der Hormone Progesteron (P4) und Östradiol (E2)2,3 abgeschätzt werden. Diese Hormone fördern das Wachstum der Gebärmutterschleimhaut, das für die Einnistung notwendig ist. P4 wird aus dem Gelbkörper hergestellt, der sich unmittelbar nach dem Eisprung in den Eierstöcken bildet. E2 wird von den Eierstockfollikeln als Reaktion auf das follikelstimulierende Hormon (FSH) aus dem Hypothalamus-Hypophysen-Komplex im Gehirn sezerniert. Der E2-Spiegel steigt mit zunehmender Reife des Follikels an und erreicht vor dem Eisprungseinen Höhepunkt 3. Hohe E2-Spiegel verursachen beim Menschen die pulsierende Freisetzung des luteinisierenden Hormons (LH) über den Hypothalamus-Hypophysen-Komplex; Dieser LH-Anstieg induziert den Eisprung. Bei Weißbüschelaffen erfuhr das LH-Gen jedoch im Laufe der Evolution eine Degeneration, und der Eisprung wird stattdessen durch die Freisetzung von Choriongonadotropin (CG) aus der Hypophyse induziert, das eine ähnliche Struktur wie LH hat 4,5.
Der Eierstockzyklus kann durch Hormoninjektionen gesteuert werden. FSH-Injektionen wirken beim Menschen auf die FSH-Rezeptoren der Eierstöcke und werden zur Förderung der Östrogensynthese und des Follikelwachstums eingesetzt6. Die Injektion von humanem CG (hCG) als Ersatz für LH am Ende der Follikelphase wird verwendet, um den Eisprung beim Menschen zu stimulieren7. CG-Injektionen werden auch zur Behandlung von menschlicher Unfruchtbarkeit eingesetzt, da CG das Corpus luteum in der Frühschwangerschaft stimuliert, was zu einer erhöhten P4-Produktion führt. Prostaglandin F2α (PGF2α) Injektionen setzen den Eierstockzyklus zurück8. Bei Hausrindern wird die PGF2α-Injektion verwendet, um die Lutealphase zu verkürzen und den Brunstzyklus für das Reproduktionsmanagement zu synchronisieren.
Obwohl Weißbüschelaffen und Menschen ähnliche biologische Mechanismen haben und damit ideale Modelltiere sind, fehlt es an Literatur, die grundlegende Methoden für viele häufig verwendete Techniken beschreibt. Die Blutentnahme ist eine der am häufigsten verwendeten Techniken 9,10,11,12. Anfänger haben jedoch manchmal Schwierigkeiten, die Vene zu finden. Daher wurden in dieser Studie anatomische Analysen der Venenregion femoralis durchgeführt. Basierend auf anatomischen Beobachtungen führt dieses Protokoll die proximale Region des Femurdreiecks als eine einfache Stelle für die Venenpunktion ein.
Die Lokalisierung der Vene ist der wichtigste Schritt bei der Blutentnahme. Basierend auf anatomischen Beobachtungen führt dieses Protokoll den proximalen Bereich im Femurdreieck als einfache Stelle für die Blutentnahme bei Weißbüschelaffen ein. In diesem Bereich kann problemlos eine Blutentnahme aus einer großen Vene durchgeführt werden. Selbst bei Verwendung dieses Protokolls kommt es jedoch manchmal zu einer Verletzung einer Arterie. Bei einer Verletzung einer Arterie wird empfo…
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Chunshen Shen, Hiroko Akutsu, Fumiyo Sugiki, Yuuna Hashimoto, Hina Naritomi, Yuuki Sakamoto und Mikiko Horigome für ihre Unterstützung bei der Etablierung dieses Protokolls und bei der täglichen Pflege der Weißbüschelaffen; Takayuki Mineshige für die Kommentare zum Manuskript; Yukiko Abe und den Mitgliedern des Aiba-Labors für den Austausch von Zygoten-Entnahmetechniken; CIEA für die Weitergabe von Informationen über die Behausung von Weißbüschelaffen und Experimente, die sie über 40 Jahre hinweg kultiviert haben. Diese Forschung wurde von AMED, JST und KAKENHI unter den Fördernummern JP19gm6310010, JP20gm6310010, JP21gm6310010 und JP22gm6310010 (AMED), JPMJPR228B (JST), 20H05764, 20H03177 und 22K18356 (KAKENHI) unterstützt.
AIA-360 | Tosoh Corporation | 0019945 | Hormone measurement (P4/E2) |
AIA-PACK DILUENT CONCENTRATE | Tosoh Corporation | 0020956 | Hormone measurement (P4/E2) |
AIA-PACK SUBSTRATE SET II | Tosoh Corporation | 0020968 | Hormone measurement (P4/E2) |
AIA-PACK WASH CONCENTRATE | Tosoh Corporation | 0020955 | Hormone measurement (P4/E2) |
CMS-1 | CLEA Japan | Marmoset food | |
Estrumate | MSD Animal Health | PGF2alpha analog (cloprostenol) | |
Gonal-f Subcutaneous Injection 150 | Merck Biopharma Co., Ltd. | FSH | |
Gonatropin for intramuscular injection 1000 | ASKA Pharmaceutical Co., Ltd. | 872413 | hCG |
Heparin sodium injection solution 5,000 units/5 mL | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. | 224122458 | Blood collection |
Immunochromatographic Test Kit for Detection of Common Marmoset Chorionic Gonadotropin (Dual Checker) | CLEA Japan, Inc. | Determining CG level | |
Low-profile double-arm microscope illumination LPF-SD | SHIOKAZE GIKEN | Desk lamp for blood collection | |
Marmoset blood collection restraint device | JIC Japan | JM-1006 | Blood collection http://www.jic-japan.jp/prd/marmoset/prd016.html email: vi@jic-japan.jp |
Metacam 0.05% | Boehringer Ingelheim Animal Health Japan Co., Ltd. | Hematoma treatment | |
Sample Cup, 3 mL, PS, for Tosoh 360 and AIA-600 II, 1000/Bag | Globe Scientific | 110913 | Hormone measurement (P4/E2) |
ST AIA-PACK iE2 | Tosoh Corporation | 0025224 | Hormone measurement (P4/E2) |
ST AIA-PACK iE2 CALIBRATOR SET | Tosoh Corporation | 0025324 | Hormone measurement (P4/E2) |
ST AIA-PACK iE2 SAMPLE DILUTING SOLUTION | Tosoh Corporation | 0025524 | Hormone measurement (P4/E2) |
ST AIA-PACK PROGIII | Tosoh Corporation | 0025240 | Hormone measurement (P4/E2) |
ST AIA-PACK PROGIII CALIBRATOR SET | Tosoh Corporation | 0025340 | Hormone measurement (P4/E2) |
ST AIA-PACK PROGIII SAMPLE DILUTING SOLUTION | Tosoh Corporation | 0025540 | Hormone measurement (P4/E2) |
Syringe with 25 G (0.50 x 25 mm) needle | TERUMO | SS-01T2525 | Blood collection |
Tensolvet 5.000 I.E. gel. | Dechra Pharmaceuticals | 14033492 | Hematoma treatment |
TOSOH MULTI-CONTROL SET | Tosoh Corporation | 0015965 | Hormone measurement (P4/E2) |