Hier beschreiben wir ein einfaches und wirtschaftliches Protokoll zur unvoreingenommenen Quantifizierung der pulmonalen mikrovaskulären Dichte für das Lungengewebe ganzer Mäuse unter Verwendung einer Einzelfärbung von Isolectin B4.
Die abnormale Abwechslung der pulmonalen Angiogenese hängt mit der mikrovaskulären Dysfunktion der Lunge zusammen und ist eng mit der Integrität der Gefäßwand, der Regulierung des Blutflusses und dem Gasaustausch verbunden. In Mausmodellen weisen Lungenlappen signifikante Unterschiede in Größe, Form, Lage und Vaskularisation auf, doch bestehende Methoden berücksichtigen diese Unterschiede bei der Quantifizierung der mikrovaskulären Dichte nicht. Diese Einschränkung behindert die umfassende Untersuchung der mikrovaskulären Dysfunktion der Lunge und den möglichen Umbau der Mikrovaskulaturzirkulation über verschiedene Läppchen hinweg. Unser Protokoll schließt diese Lücke, indem es zwei Schnittmethoden anwendet, um Veränderungen der pulmonalen mikrovaskulären Dichte zu quantifizieren, wobei die Größe, Form und Verteilung der Atemwegsäste über verschiedene Lappen bei Mäusen genutzt werden. Anschließend verwenden wir die Isolectin B4 (IB4)-Färbung, um mikrovaskuläre Endothelzellen der Lunge auf verschiedenen Schichten zu markieren, gefolgt von einer unverzerrten mikrovaskulären Dichteanalyse mit der frei verfügbaren Software ImageJ. Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen unterschiedliche Grade von mikrovaskulären Dichteänderungen in den Lungenläppchen mit zunehmendem Alter, wobei junge und alte Mäuse verglichen werden. Dieses Protokoll bietet einen unkomplizierten und kostengünstigen Ansatz für die unvoreingenommene Quantifizierung der mikrovaskulären Dichte der Lunge und erleichtert die Erforschung sowohl physiologischer als auch pathologischer Aspekte der Mikrovaskulatur der Lunge.
Endothelzellen (ECs) sind eine spezielle Art von Zellen, die sich auf der inneren Auskleidung von Blutgefäßen befinden, den gesamten Arterien- und Venenbaum bedecken und eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Stabilität von Blutgefäßen und Organen spielen1. Die Lunge ist ein stark vaskularisiertes Organ und spielt wesentliche physiologische und pathologische Rollen in der Lunge, wie z. B. die Bildung der Gefäßwand, die Regulierung des Blutflusses, die Erleichterung des Gasaustauschs, die Modulation von Entzündungsreaktionen, die Kontrolle der Blutplättchenaktivität, die Sekretion regulatorischer Substanzen, die am Gefäßwachstum, der Reparatur und der Aufrechterhaltung des Gerinnungsgleichgewichts beteiligt sind.
Mikrovaskuläre Endothelzellen (LMECs) der Lunge sind spezifische Endothelzellen des Lungengewebes, insbesondere in den Mikrogefäßen (Kapillaren) der Lunge, und unterscheiden sie von den allgemeineren arteriellen und venösen Endothelzellen in der Lunge. Diese Zellen haben verschiedene Funktionen, darunter die Regulierung des Gefäßtonus, die Kontrolle der Gefäßpermeabilität, die Beteiligung an der Regulierung von Entzündungsreaktionen und die Regulierung der Thrombusbildung. Sie spielen eine entscheidende Rolle bei der Lungenzirkulation, regulieren den Gasaustausch und den Transport von Nährstoffen und sind an verschiedenen physiologischen und pathologischen Prozessen im Zusammenhang mit der Lunge beteiligt, wahrscheinlich für das Altern2. Darüber hinaus hängt die abnormale Abwechslung der pulmonalen Angiogenese mit einer mikrovaskulären Dysfunktion der Lungezusammen 3. Unter Verwendung des konventionellen Endothelzellmarkers CD31 und der räumlichen Lokalisation (insbesondere der peripheren Regionen der Lunge) beobachteten Larissa L. et al. eine signifikante Abnahme der mikrovaskulären Endothelzelldichte bei gealterten Mäusen (18 Monate alt) im Vergleich zu ihren jüngeren Artgenossen (4 Monate alt)4. Im Zusammenhang mit der Lungenpathologie im Zusammenhang mit Asthma zeigten Makoto H. et al. eine signifikante Zunahme der Gefäßinduktion in Bronchialbiopsieproben, die mit Antikollagen IV von Asthmatikern gefärbt wurden, im Vergleich zu Kontrollpersonen5. Kürzlich berichteten Maximilian A. et al. durch die Einführung der Techniken der Transmissions- und Rasterelektronenmikroskopie über eine bemerkenswerte Zunahme der numerischen Dichte von Merkmalen im Zusammenhang mit der intussuszeptiven und keimenden Angiogenese bei Patienten, die an Covid-19 oder Influenza A (H1N1)6 starben. Offensichtlich ist die abnormale mikrovaskuläre Genese mit einer pulmonalen Dysfunktion verbunden. Allerdings gibt es derzeit keine einfache, kostengünstige Methode, um Veränderungen der mikrovaskulären Dichte zu quantifizieren.
In Mausmodellen wird die Lunge konventionell in fünf verschiedene Lappen unterteilt: rechter Schädel, rechter Mittellappen, rechter kaudaler, linker Schädel und linker Schwanzlappen. Jeder Lappen weist einzigartige Eigenschaften in Bezug auf Größe, Form, Lage und wahrscheinliche Vaskularisation auf und trägt zu einem effizienten Gasaustausch und einer potenziell synergistischen Regulation der Lungenzirkulation bei. Nach unserem besten Wissen gibt es jedoch keine Methoden, die die Unterschiede zwischen diesen Lungenlappen bei der Untersuchung der mikrovaskulären Veränderungen der Lunge berücksichtigen.
In dieser Studie wird eine neue Methode zum Schneiden von Läppchen bei Mäusen vorgestellt, bei der IB4, ein gut definierter Marker für Mikroendothelzellen der Lunge7, für eine unverzerrte quantitative Beurteilung der mikrovaskulären Dichte der Lunge verwendet wird. Dieser innovative Ansatz adressiert die Notwendigkeit eines umfassenderen Verständnisses mikrovaskulärer Veränderungen in der Lunge von Mäusen, indem er die unterschiedlichen Eigenschaften einzelner Lappen von Mäusen berücksichtigt. Als Demonstration wurde bei alternden Mäusen eine signifikante Verringerung der Lungenerkrankung
Die mikrovaskuläre Dichte wird spezifisch sowohl im Schwanzlappen als auch im linken Lappen beobachtet. Das Protokoll unterstreicht, wie wichtig es ist, lappenspezifische Analysen in die Untersuchung von Veränderungen in der mikrovaskulären Landschaft der murinen Lungen zu integrieren. Insbesondere bietet diese Methode wertvolle Forschungsreferenzen für Forscher, die ein umfassendes Verständnis sowohl des physiologischen als auch des pathologischen Verlaufs von Lungenentwicklungen und -läsionen suchen, das über die Angiogenese hinausgeht.
Die Untersuchung der pulmonalen mikrovaskulären Dichte hat erhebliche Auswirkungen auf das Verständnis pulmonalphysiologischer Prozesse und auch auf die Definition von Biomarkern für Atemwegserkrankungen. Der Lungenkreislauf zeichnet sich durch eine ausgedehnte Kapillaroberfläche aus, die von einer schlanken Schicht aus Endothelzellen umgeben ist. Das harmonische Nebeneinander dieser Zellen und Alveolarepithelzellen führt zu einer fragilen Alveolen-Kapillarmembran, die speziell entw…
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren bedanken sich für die unschätzbare Unterstützung, die sie von der öffentlichen Experimentierplattform an der West China School of Pharmacy erhalten haben. Besondere Anerkennung gebührt Wendong Wang für seine kritischen und äußerst wertvollen Ratschläge zur Pathologie. Diese Forschung wurde durch die Finanzierung durch das Wissenschafts- und Technologieministerium der Provinz Sichuan (Zuschüsse 2023NSFSC0130 und 2023NSFSC1992) und die “Fundamental Research Funds for the Central Universities” für TJ ermöglicht.
4% Paraformaldehyde | Biosharp | BL539A | Tissue Fixative |
4',6-diamidino-2-phenylindole | MCE | HY-D0814 | Nucleic Dyes |
Alexa-647 Fluor Conjugated Isolectin B4 | Thermo | I32450 | Binding Microvessels |
Anti-fluorescent Tablet Sealer | Abcam | AB104135 | Sample Fixation |
Antigen Repair Fluid | Biosharp | BL151A | Repair of Antigenic Sites |
Biopsy Cassette | ActivFlo | 39LC-500-1 | Fixing and Positioning Tissue Samples |
Bovine Serum Albumin | Sigma | B2064-50G | Sealing Solution |
Cold Plate | Leica | HistoCore Arcadia H | Freezing Samples |
Constant Temperature Electric Drying Oven | Taisite | 101-0AB | High Temperature Repair |
Disposable Microtome Blade | Leica | 14035838383 | Cutting Tissue Samples to Prepare Sections |
Embedding Molds | Shitai | 26155166627 | Fixing Tissue Samples |
Ethanol | Kelong | CAS 64-17-5 | Tissue Dehydration Solution |
Heated Paraffin Embedding Station | Leica | EG1150 | Embedding Tssue Samples in Paraffin |
HistoCore Water Bath | Leica | HI1220 | Flatten and Fix Tissue Samples |
ImageJ (Fiji) | NIH | 1.54f | Quantitative Tool |
Immunohistochemistry Pens | Biosharp | BC004 | Water-blocking Agent |
Medical Forceps | Shanghai Medical Equipment | N/A | Grasping, Manipulating, or Moving tissue samples |
Microscope | Nikon | Ts2 | Imaging Device |
Mounting Media | Jiangyuan | Tasteless | Fixing and Preserving Tissue Sections |
Paraffin Wax | SCHLEDEN | 80200-0014 | Fixing Tissue Structure |
PBS | Beyotime | C0221A | Wash Buffer |
Pentobarbital Sodium | Beijing Chemical Reagent Company | Q/H82-F158-2002 | Anesthetic |
Rotary Microtome | Biobase | Bk-2258 | Preparing Slices |
Sterile Scissors | Shanghai Medical Equipment | N/A | segmenting Tissue Samples |
Surgical Scalpel | Shanghai Medical Equipment | N/A | Cutting Tissue Samples |
Triton | Solarbio | T8200 | Permeabilization Solution |
Wash-Free Slide | PLATINUM PRO | PRO-04 | Fixing Samples for Staining |
Xylene | SUM | XK13-011-00031 | Tissue De-waxing Solution |