Summary

Quantifizierung der pulmonalen mikrovaskulären Dichte bei Mäusen über Läppchen hinweg

Published: January 03, 2025
doi:

Summary

Hier beschreiben wir ein einfaches und wirtschaftliches Protokoll zur unvoreingenommenen Quantifizierung der pulmonalen mikrovaskulären Dichte für das Lungengewebe ganzer Mäuse unter Verwendung einer Einzelfärbung von Isolectin B4.

Abstract

Die abnormale Abwechslung der pulmonalen Angiogenese hängt mit der mikrovaskulären Dysfunktion der Lunge zusammen und ist eng mit der Integrität der Gefäßwand, der Regulierung des Blutflusses und dem Gasaustausch verbunden. In Mausmodellen weisen Lungenlappen signifikante Unterschiede in Größe, Form, Lage und Vaskularisation auf, doch bestehende Methoden berücksichtigen diese Unterschiede bei der Quantifizierung der mikrovaskulären Dichte nicht. Diese Einschränkung behindert die umfassende Untersuchung der mikrovaskulären Dysfunktion der Lunge und den möglichen Umbau der Mikrovaskulaturzirkulation über verschiedene Läppchen hinweg. Unser Protokoll schließt diese Lücke, indem es zwei Schnittmethoden anwendet, um Veränderungen der pulmonalen mikrovaskulären Dichte zu quantifizieren, wobei die Größe, Form und Verteilung der Atemwegsäste über verschiedene Lappen bei Mäusen genutzt werden. Anschließend verwenden wir die Isolectin B4 (IB4)-Färbung, um mikrovaskuläre Endothelzellen der Lunge auf verschiedenen Schichten zu markieren, gefolgt von einer unverzerrten mikrovaskulären Dichteanalyse mit der frei verfügbaren Software ImageJ. Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen unterschiedliche Grade von mikrovaskulären Dichteänderungen in den Lungenläppchen mit zunehmendem Alter, wobei junge und alte Mäuse verglichen werden. Dieses Protokoll bietet einen unkomplizierten und kostengünstigen Ansatz für die unvoreingenommene Quantifizierung der mikrovaskulären Dichte der Lunge und erleichtert die Erforschung sowohl physiologischer als auch pathologischer Aspekte der Mikrovaskulatur der Lunge.

Introduction

Endothelzellen (ECs) sind eine spezielle Art von Zellen, die sich auf der inneren Auskleidung von Blutgefäßen befinden, den gesamten Arterien- und Venenbaum bedecken und eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Stabilität von Blutgefäßen und Organen spielen1. Die Lunge ist ein stark vaskularisiertes Organ und spielt wesentliche physiologische und pathologische Rollen in der Lunge, wie z. B. die Bildung der Gefäßwand, die Regulierung des Blutflusses, die Erleichterung des Gasaustauschs, die Modulation von Entzündungsreaktionen, die Kontrolle der Blutplättchenaktivität, die Sekretion regulatorischer Substanzen, die am Gefäßwachstum, der Reparatur und der Aufrechterhaltung des Gerinnungsgleichgewichts beteiligt sind.

Mikrovaskuläre Endothelzellen (LMECs) der Lunge sind spezifische Endothelzellen des Lungengewebes, insbesondere in den Mikrogefäßen (Kapillaren) der Lunge, und unterscheiden sie von den allgemeineren arteriellen und venösen Endothelzellen in der Lunge. Diese Zellen haben verschiedene Funktionen, darunter die Regulierung des Gefäßtonus, die Kontrolle der Gefäßpermeabilität, die Beteiligung an der Regulierung von Entzündungsreaktionen und die Regulierung der Thrombusbildung. Sie spielen eine entscheidende Rolle bei der Lungenzirkulation, regulieren den Gasaustausch und den Transport von Nährstoffen und sind an verschiedenen physiologischen und pathologischen Prozessen im Zusammenhang mit der Lunge beteiligt, wahrscheinlich für das Altern2. Darüber hinaus hängt die abnormale Abwechslung der pulmonalen Angiogenese mit einer mikrovaskulären Dysfunktion der Lungezusammen 3. Unter Verwendung des konventionellen Endothelzellmarkers CD31 und der räumlichen Lokalisation (insbesondere der peripheren Regionen der Lunge) beobachteten Larissa L. et al. eine signifikante Abnahme der mikrovaskulären Endothelzelldichte bei gealterten Mäusen (18 Monate alt) im Vergleich zu ihren jüngeren Artgenossen (4 Monate alt)4. Im Zusammenhang mit der Lungenpathologie im Zusammenhang mit Asthma zeigten Makoto H. et al. eine signifikante Zunahme der Gefäßinduktion in Bronchialbiopsieproben, die mit Antikollagen IV von Asthmatikern gefärbt wurden, im Vergleich zu Kontrollpersonen5. Kürzlich berichteten Maximilian A. et al. durch die Einführung der Techniken der Transmissions- und Rasterelektronenmikroskopie über eine bemerkenswerte Zunahme der numerischen Dichte von Merkmalen im Zusammenhang mit der intussuszeptiven und keimenden Angiogenese bei Patienten, die an Covid-19 oder Influenza A (H1N1)6 starben. Offensichtlich ist die abnormale mikrovaskuläre Genese mit einer pulmonalen Dysfunktion verbunden. Allerdings gibt es derzeit keine einfache, kostengünstige Methode, um Veränderungen der mikrovaskulären Dichte zu quantifizieren.

In Mausmodellen wird die Lunge konventionell in fünf verschiedene Lappen unterteilt: rechter Schädel, rechter Mittellappen, rechter kaudaler, linker Schädel und linker Schwanzlappen. Jeder Lappen weist einzigartige Eigenschaften in Bezug auf Größe, Form, Lage und wahrscheinliche Vaskularisation auf und trägt zu einem effizienten Gasaustausch und einer potenziell synergistischen Regulation der Lungenzirkulation bei. Nach unserem besten Wissen gibt es jedoch keine Methoden, die die Unterschiede zwischen diesen Lungenlappen bei der Untersuchung der mikrovaskulären Veränderungen der Lunge berücksichtigen.

In dieser Studie wird eine neue Methode zum Schneiden von Läppchen bei Mäusen vorgestellt, bei der IB4, ein gut definierter Marker für Mikroendothelzellen der Lunge7, für eine unverzerrte quantitative Beurteilung der mikrovaskulären Dichte der Lunge verwendet wird. Dieser innovative Ansatz adressiert die Notwendigkeit eines umfassenderen Verständnisses mikrovaskulärer Veränderungen in der Lunge von Mäusen, indem er die unterschiedlichen Eigenschaften einzelner Lappen von Mäusen berücksichtigt. Als Demonstration wurde bei alternden Mäusen eine signifikante Verringerung der Lungenerkrankung
Die mikrovaskuläre Dichte wird spezifisch sowohl im Schwanzlappen als auch im linken Lappen beobachtet. Das Protokoll unterstreicht, wie wichtig es ist, lappenspezifische Analysen in die Untersuchung von Veränderungen in der mikrovaskulären Landschaft der murinen Lungen zu integrieren. Insbesondere bietet diese Methode wertvolle Forschungsreferenzen für Forscher, die ein umfassendes Verständnis sowohl des physiologischen als auch des pathologischen Verlaufs von Lungenentwicklungen und -läsionen suchen, das über die Angiogenese hinausgeht.

Protocol

Alle Versuche wurden nach den ethischen Richtlinien des Tierforschungsausschusses der Universität Sichuan (Nr. K2023023) durchgeführt. 1. Präparation von Paraffinschnitten für Lungenlappen der Maus Entnehmen Sie Lungengewebe von der Maus.Wählen Sie männliche C57Bl/6-Mäuse im Alter von 6 Wochen und 16 Monaten, um die mikrovaskuläre Dichte in der Lunge von Mäusen in verschiedenen Altersgruppen zu bestimmen. Verabreichen Sie Mäusen 100 mg/kg Pentobarbital-Natrium durch intraperitoneale Injektion. Euthanasieren Sie die Mäuse durch Zervixluxation nach der Anästhesie. Öffnen Sie die Brusthöhle und entnehmen Sie Lungengewebe. Paraffinabschnitte vorbereiten.Fixieren Sie das Gewebe, indem Sie es in eine 4%ige Paraformaldehydlösung legen, die das 10-fache des Volumens des Gewebes hat, um seine Morphologie und Struktur zu erhalten und eine Degradation zu verhindern.HINWEIS: Vor kurzem wurde eine neue Methode entwickelt, um Luft während der vaskulären Perfusionsfixierung in der Lunge von Mäusen aufzublasen. Es wird berichtet, dass diese Methode eine bessere Morphologie und Lage der Atemwege, der Alveolarzellen und des Interstitiums bewahrt, wodurch sie für histologische Lungenuntersuchungen besser geeignet sind. Diese Methode empfiehlt sich für Laboratorien mit entsprechender Ausstattung und Verbrauchsmaterialien mit selbst hergestellten Instrumenten8. Schneiden Sie den Lungenlappen, um die Einbettungsrichtung zu bestimmen (Abbildung 1).Nach 3 h Fixation trennen Sie die fünf Lungenlappen (unter direkter Beobachtung der Augen) und betten den Schädel-, Mittel- und Akzessorallappen der rechten Lunge getrennt ein, wobei die Abschnitte in Richtung der vertikalen Lappen-Bronchus-Verbindung ausgerichtet sind. Schneiden Sie den Schwanzlappen der rechten Lunge in 2 Stücke in einem Abstand von 4 mm von links nach rechts in Richtung senkrecht zur Lungenlappen-Bronchus-Verbindung und betten Sie die Scheiben mit der Schnittfläche nach oben in einen Wachsblock ein. Machen Sie drei Schnitte im linken Lungenlappen. Den ersten Schnitt quer über dem Hauptbronchialübergang machen, 2 mm unterhalb der Oberseite. Den zweiten Schnitt quer über dem Hauptbronchialübergang und 5 mm unterhalb der Oberseite machen. Machen Sie den dritten Schnitt am Ende des Ohrläppchens, 8 mm unterhalb der Oberseite. Entsorgen Sie das oberste Stück Gewebe und umhüllen Sie die restlichen drei Stücke mit der Schnittfläche nach oben in einem Wachsblock.HINWEIS: Wenn Sie mehrere Lungenteile miteinander einbetten, können Sie sie mit einem Mikroskop-Wischpapier umwickeln, bevor Sie sie in eine Gewebeeinbettbox legen, um den Dehydratisierungsprozess fortzusetzen. Fixieren Sie das Gewebe erneut für 24 h im Fixiermittel. Legen Sie den Taschentuchblock in einen Behälter und spülen Sie ihn 15 Minuten lang unter fließendem Wasser aus. Legen Sie das Gewebe nacheinander in die folgenden Lösungen: 65 % Ethanol für 30 min, 75 % Ethanol für 30 min, 85 % Ethanol für 30 min, 95 % Ethanol I für 60 min, 95 % Ethanol II für 60 min, absolutes Ethanol I für 60 min, absolutes Ethanol II für 60 min, 70 % Ethanol für 120 min, 80 % Ethanol für 120 min, 90% Ethanol für 120 min, 95% Ethanol für 120 min, absolutes Ethanol I für 120 min und absolutes Ethanol II für 120 min. Legen Sie das Gewebe für 30 min in Xylol I und 30 min in Xylol II. Legen Sie das Tuch 1 h lang in weiches Wachs unter 54 °C, 1 h in Hartwachs I bei 58 °C und 30 min in Hartwachs II bei 58 °C. Wählen Sie eine geeignete Formgröße, füllen Sie sie mit einer angemessenen Menge flüssigem Paraffin und positionieren Sie das Gewebe mit einer Pinzette im Einbettrahmen in der Mitte der Form in die richtige Richtung. Legen Sie die Form und das Gewebe in den Gefrierbereich der Einbettmaschine und drücken Sie das Gewebe vorsichtig mit einer Pinzette. Wenn das Paraffin leicht zu bleichen beginnt, positionieren Sie schnell den unbedeckten Einbettrahmen auf der Form und führen Sie die zweite Wachsinjektion durch, indem Sie die Löcher an der Unterseite des Einbettrahmens verschließen. Übertragen Sie die gesamte Form zum Formen auf den Gefriertisch. Nachdem Sie den Wachsblock auf dem Slicer befestigt haben und die glatte und flache Schnittfläche durch groben und feinen Beschnitt freigelegt haben, drehen Sie die Radkurbel des Mikrotoms, um Scheiben mit einer Dicke von 4 μm zu schneiden. Legen Sie die entfernten Abschnitte in nacheinander gleichmäßig auf die Wasseroberfläche. Sobald die Abschnitte vollständig ausgefahren sind, trennen Sie die gebrochenen Teile an den Verbindungsstellen zwischen den einzelnen Abschnitten. Kippen Sie eine Glasrutsche unter das Profil und heben Sie die Rutsche bei Kontakt langsam und gleichmäßig in einer vertikalen Bewegung aus der Wasseroberfläche an. Die Abschnitte haften an der Glasschiene. 2. Immunfluoreszenzfärbung zum Nachweis von pulmonalen Mikrogefäßen Die in Paraffin eingelegten Scheiben für 60 Min. in den 65 °C Ofen geben. Legen Sie die Scheiben auf ein Schiebegestell und führen Sie die folgenden Schritte in Färbegläsern durch: Tauchen Sie Xylol 1, Xylol 2 und Xylol 3 für jeweils 15 Minuten ein, gefolgt von einem Eintauchen in Xylol/Ethanol (1:1) für 5 Minuten, 100 % Ethanol #1, 100 % Ethanol #2, 85 % Ethanol, 75 % Ethanol und destilliertes Wasser für jeweils 5 Minuten. Verdünnen Sie die modifizierte Natriumcitrat-Antigen-Rückgewinnungslösung 50-fach mit deionisiertem Wasser. Heizen Sie die Mikrowelle auf hoher Stufe bis zum Sieden vor und legen Sie dann den Objektträger in den Antigenextrakt. Lassen Sie den Objektträger 15 Minuten lang im Antigenextrakt kochen und kühlen Sie ihn dann auf natürliche Weise auf Raumtemperatur ab. Waschen Sie die Objektträger zweimal mit PBS für jeweils 5 Minuten. Permeabilisieren Sie zweimal für jeweils 10 min mit 0,25 % Triton. Umkreisen Sie das Gewebe mit einem immunhistochemischen Stift und inkubieren Sie diesen mit 5 % BSA bei Raumtemperatur (RT) für 1 h. Waschen Sie die Objektträger einmal 5 Minuten lang mit PBS. Führen Sie Alexa-647 Fluor-konjugierte IB4 – und DAPI-Färbungen durch.Den IB4 auf Eis legen und 1:50 mit 1% BSA verdünnen. Entfernen Sie überschüssiges Wasser um den Kreis herum, geben Sie 50-100 μl des verdünnten IB4 in jeden Gewebeschnitt und inkubieren Sie über Nacht bei 4 °C (ab diesem Schritt führen Sie alle Eingriffe im Dunkeln durch). Waschen Sie die Objektträger dreimal mit PBS für jeweils 5 Minuten. Permeabilize mit 0,25% Triton für 10 min. Verdünnen Sie DAPI (10 μg/ml) mit PBS im Verhältnis 1:10 und fügen Sie 50-100 μl zu jedem Gewebeschnitt bei RT für 5 min hinzu. Waschen Sie die Objektträger dreimal mit PBS für jeweils 5 Minuten. Tragen Sie einen Tropfen Anti-Fade-Montagemedium auf die Dias auf und vermeiden Sie dabei Lichteinwirkung. Trocknen Sie den Objektträger an der Luft, beobachten und erfassen Sie dann Bilder des Zellkerns und der Zielsignale unter einem Fluoreszenzmikroskop. 3. Quantifizierung der pulmonalen mikrovaskulären Dichte Erfassen Sie Bilder.Beobachten Sie die mikrovaskulären Dichtesignale der Lunge und die DAPI-Signale unter einem 10-fachen Objektiv für jeden Lungenlappen sowohl in der jungen als auch in der alten Altersgruppe. Standardisieren Sie die Intensität der Lichtquelle und die Belichtungszeit für jeden Kanal basierend auf den Beobachtungsergebnissen. Erfassen Sie die Zweikanalbilder, die den gesamten Bereich jedes Lungenlappens abdecken. Speichern Sie das Bild im ND2-Format mit zwei Kanälen (Abbildung 2). Quantifizieren Sie mit Bild J (Ergänzende Abbildung 1).Starten Sie die ImageJ-Software. Importieren Sie die angegebenen Bilder in ImageJ, fahren Sie dann mit dem Laden und Auswählen fort. Teilen Sie die Kanäle entsprechend auf. Laden Sie eine Datei im ND2-Format sowohl für DAPI- als auch für IB4-Kanäle . Navigieren Sie zu Analysieren > Maßstab festlegen > konfigurieren Sie die Bildparameter auf 0,48 μm/Pixel (abhängig von den Fotoparametern) > Global > OK. Stellen Sie den gleichen Anzeigebereich ein, um den Bilddarstellungseffekt anzupassen. Bild auswählen> Passen Sie > eingestellte Helligkeit/Kontrast > an. Anzeigebereich für jeden der beiden Kanäle separat einstellen, IB4: 0-10000; DAPI: 0-20000. Um den Einfluss von Hintergrundsignalen zu eliminieren, fahren Sie mit den folgenden Schritten fort: Klicken Sie auf Verarbeiten > Rechnen > Subtrahieren; Subtrahieren Sie das Hintergrundsignal basierend auf den Signalwerten, die vom Zauberstab-Werkzeug im Hintergrund erkannt wurden, IB4: 3000; DAPI:300. Um den Schwellenwert auszuwählen, der am besten mit dem Originalbild übereinstimmt, gehen Sie zu Bild > Duplizieren. Wählen Sie sowohl das Original als auch das Duplikat des Bildes aus> geben Sie > 8 Bit ein. Wählen Sie einen geeigneten Schwellenwert, um die Mikrovaskulatur der Lunge genau zu identifizieren. Klicken Sie auf Bild > Anpassen > Schwellenwert > Intermodi (wählen Sie den realistischsten Schwellenwert im Vergleich zum Originaldiagramm), aktivieren Sie > dunklen Hintergrund > Anwenden. Eliminieren von positiven IB4-Signalen aus großen Blutgefäßen in der Lunge von Mäusen, einschließlich Arterien und Venen: Verwenden Sie den Zauberstab , um größere Blutgefäße im Vergleich zum duplizierten Bild auszuwählen, und klicken Sie dann auf “Löschen” (wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die positiven Signale von IB4 in den Endothelzellen größerer Blutgefäße entfernt wurden).HINWEIS: IB 4-Färbesignale werden in Endothelzellen von Arterien und Venen in der Lunge von Mäusen nachgewiesen. Um eine gezielte Untersuchung des Auftretens von pulmonalen Mikrovaskulaturen zu erreichen, empfiehlt es sich, die Signalherde in Endothelzellen größerer Blutgefäße gleichmäßig zu entfernen. Zählen Sie die Anzahl der Zielsignale, klicken Sie auf Analysieren > Messungen festlegen und markieren Sie Bereich, Auf Schwellenwert begrenzen und Beschriftung anzeigen. Wählen Sie dann Partikel analysieren und stellen Sie Größe: 0-unendlich ein; Zirkularität: 0,00-1,00; Show: Overly Masks; Markieren Sie Zusammenfassen und klicken Sie auf OK. Wählen Sie Ergebnisse zusammenfassen > Datei > Speichern unter. Datenanalyse und StatistikOrdnen Sie die Anzahl der positiven IB4-Brennpunkte bzw. der positiven DAPI-Brennpunkte im selben Bild in einer einheitlichen Tabelle ab und organisieren Sie sie. Fassen Sie die Gesamtzahl der positiven IB4-Herde und DAPI-positiven Herde für jeden Lappen in den angegebenen Jung- oder Altersgruppen zusammen.Berechnen Sie den Prozentsatz der IB4-positiven Foki (%), indem Sie die Gesamtzahl der positivenIB4-Foki durch die Gesamtzahl der DAPI-Färbefoki in jedem Lappen durch verschiedene Gruppen dividieren. Zeigen Sie die Anzahl der positiven IB4-Herde , die Anzahl der DAPI-Färbeherde und den Prozentsatz der positiven IB4-Herde (%), wie in Abbildung 3A dargestellt. Starten Sie die Datenanalysesoftware und erstellen Sie eine neue Spaltentabelle.HINWEIS: Für die statistische Analyse wurde hier GraphPad Prism 9 verwendet. Benennen Sie sie fortlaufend von Gruppe A bis Gruppe J als “Junger Schädellappen”, “Alter Schädellappen”, “Junger Mittellappen”, “Alter Mittellappen”, “Junger Schwanzlappen”, “Alter Schwanzlappen”, “Junger Zubehörlappen”, “Alter Akzessorallappen”, “Junger linker Lappen”, “Alter linker Lappen”. Geben Sie dann die entsprechenden positiven Brennpunkte (%) von IB4 in die Tabelle ein (Ergänzende Tabelle 1). Verwenden Sie ungepaarte t-Tests für den paarweisen Vergleich, um signifikante Unterschiede in den entsprechenden Regionen zwischen den beiden Altersgruppen zu bewerten. Führen Sie insgesamt fünf Vergleiche für fünf Lappen durch. Erstellen Sie ein Diagramm für die Ergebnisvisualisierung (Abbildung 3B). Entscheiden Sie sich für ein Balkendiagramm und beziehen Sie statistische Analysen in die Abbildung ein.

Representative Results

Um zwischen den Läsionen in den Hauptbronchien und den kleinen Atemwegsästen zu unterscheiden, ist es wichtig, dass die kontinuierliche Struktur der Läsionen in diesen beiden Arten von Atemwegen beobachtet wird. Dies kann erreicht werden, indem die in Abbildung 1 beschriebenen Verfahren zum Schneiden und Einbetten befolgt werden. Aufgrund der zahlreichen Lungenlappen bei Mäusen, die in verschiedene Richtungen ausgerichtet sind und eine netzartige Struktu…

Discussion

Die Untersuchung der pulmonalen mikrovaskulären Dichte hat erhebliche Auswirkungen auf das Verständnis pulmonalphysiologischer Prozesse und auch auf die Definition von Biomarkern für Atemwegserkrankungen. Der Lungenkreislauf zeichnet sich durch eine ausgedehnte Kapillaroberfläche aus, die von einer schlanken Schicht aus Endothelzellen umgeben ist. Das harmonische Nebeneinander dieser Zellen und Alveolarepithelzellen führt zu einer fragilen Alveolen-Kapillarmembran, die speziell entw…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren bedanken sich für die unschätzbare Unterstützung, die sie von der öffentlichen Experimentierplattform an der West China School of Pharmacy erhalten haben. Besondere Anerkennung gebührt Wendong Wang für seine kritischen und äußerst wertvollen Ratschläge zur Pathologie. Diese Forschung wurde durch die Finanzierung durch das Wissenschafts- und Technologieministerium der Provinz Sichuan (Zuschüsse 2023NSFSC0130 und 2023NSFSC1992) und die “Fundamental Research Funds for the Central Universities” für TJ ermöglicht.

Materials

4% Paraformaldehyde Biosharp BL539A Tissue Fixative
4',6-diamidino-2-phenylindole MCE HY-D0814 Nucleic Dyes
Alexa-647 Fluor Conjugated Isolectin B4 Thermo I32450 Binding Microvessels
Anti-fluorescent Tablet Sealer Abcam AB104135 Sample Fixation
Antigen Repair Fluid Biosharp BL151A Repair of Antigenic Sites
Biopsy Cassette ActivFlo 39LC-500-1 Fixing and Positioning Tissue Samples
Bovine Serum Albumin Sigma B2064-50G Sealing Solution
Cold Plate Leica HistoCore Arcadia H  Freezing Samples
Constant Temperature Electric Drying Oven Taisite 101-0AB High Temperature Repair
Disposable Microtome Blade Leica 14035838383 Cutting Tissue Samples to Prepare Sections
Embedding Molds Shitai 26155166627 Fixing Tissue Samples
Ethanol Kelong CAS 64-17-5 Tissue Dehydration Solution
Heated Paraffin Embedding Station Leica EG1150 Embedding Tssue Samples in Paraffin
HistoCore Water Bath Leica HI1220 Flatten and Fix Tissue Samples
ImageJ (Fiji)  NIH 1.54f Quantitative Tool
Immunohistochemistry Pens Biosharp BC004 Water-blocking Agent
Medical Forceps Shanghai Medical Equipment N/A Grasping, Manipulating, or Moving tissue samples
Microscope Nikon Ts2 Imaging Device
Mounting Media Jiangyuan Tasteless Fixing and Preserving Tissue Sections
Paraffin Wax SCHLEDEN 80200-0014 Fixing Tissue Structure
PBS Beyotime C0221A Wash Buffer
Pentobarbital Sodium Beijing Chemical Reagent Company Q/H82-F158-2002 Anesthetic
Rotary Microtome Biobase Bk-2258 Preparing Slices
Sterile Scissors Shanghai Medical Equipment N/A segmenting Tissue Samples
Surgical Scalpel Shanghai Medical Equipment N/A Cutting Tissue Samples
Triton  Solarbio T8200 Permeabilization Solution
Wash-Free Slide PLATINUM PRO PRO-04 Fixing Samples for Staining
Xylene SUM XK13-011-00031 Tissue De-waxing Solution

Referenzen

  1. Jia, T., et al. Fgf-2 promotes angiogenesis through a srsf1/srsf3/srpk1-dependent axis that controls vegfr1 splicing in endothelial cells. BMC Biol. 19 (1), 173 (2021).
  2. Schneider, J. L., et al. The aging lung: Physiology, disease, and immunity. Cell. 184 (8), 1990-2019 (2021).
  3. Rafii, S., Butler, J. M., Ding, B. S. Angiocrine functions of organ-specific endothelial cells. Nature. 529 (7586), 316-325 (2016).
  4. Lipskaia, L., et al. Induction of telomerase in p21-positive cells counteracts capillaries rarefaction in aging mice lung. bioRxiv. , (2022).
  5. Hoshino, M., Takahashi, M., Aoike, N. Expression of vascular endothelial growth factor, basic fibroblast growth factor, and angiogenin immunoreactivity in asthmatic airways and its relationship to angiogenesis. J Allergy Clin Immunol. 107 (2), 295-301 (2001).
  6. Ackermann, M., et al. Pulmonary vascular endothelialitis, thrombosis, and angiogenesis in covid-19. New Engl J Med. 383 (2), 120-128 (2020).
  7. Wertheim, B. M., et al. Isolating pulmonary microvascular endothelial cells ex vivo: Implications for pulmonary arterial hypertension, and a caution on the use of commercial biomaterials. PLoS One. 14 (2), e0211909 (2019).
  8. Thomas, S. M., Bednarek, J., Janssen, W. J., Hume, P. S. Air-inflation of murine lungs with vascular perfusion-fixation. J Vis Exp. (168), e62215 (2021).
  9. Ramasamy, S. K., Kusumbe, A. P., Adams, R. H. Regulation of tissue morphogenesis by endothelial cell-derived signals. Trends Cell Biol. 25 (3), 148-157 (2015).
  10. Amersfoort, J., Eelen, G., Carmeliet, P. Immunomodulation by endothelial cells – partnering up with the immune system. Nat Rev Immunol. 22 (9), 576-588 (2022).
  11. Niethamer, T. K., et al. Defining the role of pulmonary endothelial cell heterogeneity in the response to acute lung injury. eLife. 9, e53072 (2020).
  12. Corliss, B. A., Mathews, C., Doty, R., Rohde, G., Peirce, S. M. Methods to label, image, and analyze the complex structural architectures of microvascular networks. Microcirculation. 26 (5), e12520 (2019).
  13. Phillips, M. R., et al. A method for evaluating the murine pulmonary vasculature using micro-computed tomography. J Surg Res. 207, 115-122 (2017).
  14. Chadwick, E. A., et al. Vessel network extraction and analysis of mouse pulmonary vasculature via x-ray micro-computed tomographic imaging. PLoS Comput Biol. 17 (4), e1008930 (2021).

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Diesen Artikel zitieren
Li, C., Wang, Z., Du, J., Jia, T. Quantifying Pulmonary Microvascular Density in Mice Across Lobules. J. Vis. Exp. (215), e66681, doi:10.3791/66681 (2025).

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