Das Protokoll demonstriert eine Methode zur sequentiellen Entnahme von Blut aus Pfortadern und unterer Hohlvene von Mäusen, um die Produktion und Absorption von mikrobiellen Metaboliten im Darm zu bewerten.
Es ist bekannt, dass mikrobielle Produkte des Darms sowohl lokal im Darm wirken als auch in den Kreislauf aufgenommen werden, wo sich ihre Wirkung auf zahlreiche entfernte Organsysteme erstrecken kann. Kurzkettige Fettsäuren (SCFA) sind eine Klasse von Metaboliten, die von Darmmikroben während der Fermentation von unverdaulichen Ballaststoffen produziert werden. Sie sind heute als wichtige Faktoren dafür anerkannt, wie das Darmmikrobiom die extraintestinalen Organsysteme über die Darm-Lunge-, Darm-Gehirn- und andere Darm-Organ-Achsen im gesamten Wirt beeinflusst. SCFAs werden aus dem Dickdarm über das Darmgewebe in die Pfortader (PV) aufgenommen. Sie passieren dann die Leber und werden in verschiedenen Organen wie Gehirn, Muskeln, Fettgewebe und Lunge konsumiert. SCFAs lassen sich am einfachsten im ausgestoßenen Stuhl messen, genauere Messungen wurden jedoch aus dem intrakolonischen Stuhlinhalt gewonnen. Hier schlagen wir vor, dass die Probenahme von PV und systemischem zirkulierendem Plasma eines einzelnen Probanden für die Untersuchung der Absorption, des Transports und der systemischen Konzentrationen von SCFAs in Mäusen vorzuziehen ist. Wir stellen eine neue Technik zur effizienten Blutentnahme aus der PV und der Vena cava inferior (IVC) vor, die die Entnahme relativ großer Blutmengen aus dem portalen und systemischen Kreislauf ermöglicht. Dies wird durch die Ligatur des PV erreicht, wodurch die Erweiterung oder Vergrößerung des PV ermöglicht wird, wenn es sich aus den Mesenterialvenen, die in es abfließen, wieder füllt. Mit dieser Methode konnten wir die Rate der erfolgreichen Entnahme sowie die Gesamtmenge des entnommenen Blutes verbessern (bis zu 0,3 mL aus IVC und 0,5 mL aus PV).
Kurzkettige Fettsäuren (SCFA) sind eine Hauptklasse von Metaboliten, die von der Darmmikrobiota produziert werden. Ihre entscheidende Rolle in der Interaktion zwischen dem Darmmikrobiom und anderen entfernten Organen1 wurde durch Forschungen unterstützt, die beschreiben, wie sie Entzündungen modulieren, Signale über dedizierte Rezeptoren senden und als Substrate im Zellstoffwechsel dienen 2,3,4,5. Jüngste Arbeiten unserer Gruppe haben gezeigt, dass SCFAs in vivo wichtige Entzündungsregulatoren des Immuntonus der Lunge in vivo über die Darm-Lungen-Achsesind 6,7. Weitere Berichte haben ihren funktionellen Einfluss auf den Stoffwechsel über die Darm-Hirn-Achse beschrieben 8,9. Insgesamt wird der Einfluss von SCFAs auf die Physiologie und Pathologie des Wirts von zahlreichen Forschungsgruppen aus einem breiten Spektrum von Krankheitsprozessen aktiv und intensiv untersucht.
Acetat (C2), Propionat (C3) und Butyrat (C4) sind die primären SCFAs und werden von der Darmmikrobiota durch die Fermentation von einnehmbaren Ballaststoffen im Blinddarm und Dickdarm erzeugt. Alle drei SCFAs können auch direkt aus der Nahrung gewonnen werden, und nur Acetat darf auch von Säugetierzellen produziert werden. SCFAs werden im Dickdarm resorbiert und teilweise von Darmepithelzellen verwertet (als Energiequelle, zur lokalen Immunmodulation des Gewebes und zur Unterstützung der Aufrechterhaltung der Darmbarriere). Sie werden auch über das mesenteriale Venensystem10 in die Pfortader transportiert. Butyrat wird hauptsächlich von Darmepithelien konsumiert, Propionat von der Leber11,12, und es wurde berichtet, dass Acetat auf Muskel- und Fettgewebe wirkt, nachdem es in den peripheren Kreislauf gelangt ist13,14.
Eine umfassende Beurteilung der SCFA-Produktion, -Resorption und der funktionellen Aktivität erfordert die Kenntnis der SCFA-Spiegel im Dickdarmlumen, im Pfortaderkreislauf und im peripheren Blut. Dies kann durch Blutentnahme aus der Pfortader (PV) und systemische Zirkulation gleichzeitig oder nacheinander im selben Tier erreicht werden. Da SCFAs flüchtig15 sind, spiegelt die Messung ihrer Konzentrationen in ausgestoßenen Kotpellets möglicherweise nicht genau die Werte im Dickdarm wider. Darüber hinaus kann der Gehalt an SCFAs in der PV im Vergleich zu Messungen aus dem Dickdarminhalt die Nettosumme der vom Wirt absorbierten Steady-State-Spiegel im Vergleich zu den ungleichmäßigen Mengen, die vom Darmmikrobiom über die gesamte Länge des Dickdarms produziert werden, genauer widerspiegeln11. Diese PV-SCFA-Spiegel könnten daher relevanter und geeigneter sein, um die Auswirkungen von SCFAs auf die Physiologie und Pathologie des Wirts zu untersuchen, die über die lokalen Effekte im Darm hinausgehen.
Um die koordinierte und nahezu gleichzeitige Entnahme von PV und systemisch zirkulierendem Blut durchzuführen, sollte das Zwerchfell intakt bleiben, um eine normale Durchblutung aufrechtzuerhalten und die Spontanatmung zu unterstützen. Daher stellt die untere Hohlvene (IVC) eine ideale Stelle dar, um bei der Entnahme von PV-Blut systemisches Blutkreislauf zu gewinnen. Dieses IVC-Blut kann auch für andere Zwecke verwendet werden, z. B. zur Messung zirkulierender Zytokine zur Beurteilung systemischer Entzündungen.
Derzeit wurden bei größeren Nagetieren nur wenige Methoden zur Blutentnahme sowohl aus dem systemischen Kreislauf als auch aus der PV berichtet16,17. Herkömmliche Methoden, bei denen bei Ratten eine Kanülierung von Gefäßen erforderlich ist, sind bei Mäusen technisch schwierig durchzuführen. Darüber hinaus beträgt die maximale Menge an Blut, die mit diesen Methoden entnommen wird, in der Regel nicht mehr als 0,3 ml18.
In dieser Arbeit stellen wir eine neuartige Methode vor, die den Prozess der dualen Blutentnahme aus der IVC der Maus, gefolgt von PV, im selben Tier vereinfacht. Das Besondere an der Methode ist die Ligatur des PV in der Nähe des Leberhilums kurz vor der PV-Blutentnahme. Dieser Ansatz kann die Dimensionen des PV erweitern, wodurch die Erfolgsrate erheblich verbessert und das maximal entnahmebare Blutvolumen auf bis zu 0,5 ml erhöht wird.
Diese Arbeit beschreibt eine innovative in vivo Methode zur nahezu gleichzeitigen Entnahme von Blutproben aus dem IVC und PV in derselben experimentellen Maus. Diese Methode ist nützlich, um den Gehalt an durch die Darmmikrobiota erzeugten Produkten, wie z. B. SCFAs, zu messen, die den Pfortaderkreislauf durchlaufen. Das durchschnittliche maximale Blutvolumen, das während eines terminalen Eingriffs bei Mäusen (mit einem Gewicht von 25-30 g) entnommen werden kann, beträgt etw…
The authors have nothing to disclose.
AP wird durch einen R01-Preis des NIH/NHLBI (1R01HL146753) finanziert. DM wird durch ein T32-Stipendium des NIH und durch einen Trainee/Staff Pilot Award des UCSF Benioff Center for Microbiome Medicine finanziert.
2,2,2 Tribromoethanol, 97% (Avertin) | Sigma Aldrich | T48402-25G | Anesthetic agent |
Buprenorphine Hydrochloride Injection 0.3 mg/mL | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | Analgesic agent |
Dressing Forceps | Miltex | 6-100 | Dissection |
Graefe Forceps | Roboz | RS-5136 | Dissection |
Hepatin sodium 1000 USP units/mL | Hikma | NDC 0641-0391-12 | Blood sample syringes/tubes heparinization |
Prolene 7-0 | Ethicon | 8696G | Portal vein ligature |
Scissors | F.S.T | 14058-11 | Dissection |
Student Halsted-Mosquito Hemostats | F.S.T | 91308-12 | Dissection |
Surgical tape | 3M Transpore | 1527-1 | Mouse limbs fixation |
U-100 Insulin Syringe 28G1/2 | EXEL | 26027 | Blood sample collection |