Summary

Sequentielle Blutentnahme aus der Vena cava inferior, gefolgt von einer Pfortader zur Bewertung der mikrobiellen Metaboliten des Darms bei Mäusen

Published: June 21, 2024
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Summary

Das Protokoll demonstriert eine Methode zur sequentiellen Entnahme von Blut aus Pfortadern und unterer Hohlvene von Mäusen, um die Produktion und Absorption von mikrobiellen Metaboliten im Darm zu bewerten.

Abstract

Es ist bekannt, dass mikrobielle Produkte des Darms sowohl lokal im Darm wirken als auch in den Kreislauf aufgenommen werden, wo sich ihre Wirkung auf zahlreiche entfernte Organsysteme erstrecken kann. Kurzkettige Fettsäuren (SCFA) sind eine Klasse von Metaboliten, die von Darmmikroben während der Fermentation von unverdaulichen Ballaststoffen produziert werden. Sie sind heute als wichtige Faktoren dafür anerkannt, wie das Darmmikrobiom die extraintestinalen Organsysteme über die Darm-Lunge-, Darm-Gehirn- und andere Darm-Organ-Achsen im gesamten Wirt beeinflusst. SCFAs werden aus dem Dickdarm über das Darmgewebe in die Pfortader (PV) aufgenommen. Sie passieren dann die Leber und werden in verschiedenen Organen wie Gehirn, Muskeln, Fettgewebe und Lunge konsumiert. SCFAs lassen sich am einfachsten im ausgestoßenen Stuhl messen, genauere Messungen wurden jedoch aus dem intrakolonischen Stuhlinhalt gewonnen. Hier schlagen wir vor, dass die Probenahme von PV und systemischem zirkulierendem Plasma eines einzelnen Probanden für die Untersuchung der Absorption, des Transports und der systemischen Konzentrationen von SCFAs in Mäusen vorzuziehen ist. Wir stellen eine neue Technik zur effizienten Blutentnahme aus der PV und der Vena cava inferior (IVC) vor, die die Entnahme relativ großer Blutmengen aus dem portalen und systemischen Kreislauf ermöglicht. Dies wird durch die Ligatur des PV erreicht, wodurch die Erweiterung oder Vergrößerung des PV ermöglicht wird, wenn es sich aus den Mesenterialvenen, die in es abfließen, wieder füllt. Mit dieser Methode konnten wir die Rate der erfolgreichen Entnahme sowie die Gesamtmenge des entnommenen Blutes verbessern (bis zu 0,3 mL aus IVC und 0,5 mL aus PV).

Introduction

Kurzkettige Fettsäuren (SCFA) sind eine Hauptklasse von Metaboliten, die von der Darmmikrobiota produziert werden. Ihre entscheidende Rolle in der Interaktion zwischen dem Darmmikrobiom und anderen entfernten Organen1 wurde durch Forschungen unterstützt, die beschreiben, wie sie Entzündungen modulieren, Signale über dedizierte Rezeptoren senden und als Substrate im Zellstoffwechsel dienen 2,3,4,5. Jüngste Arbeiten unserer Gruppe haben gezeigt, dass SCFAs in vivo wichtige Entzündungsregulatoren des Immuntonus der Lunge in vivo über die Darm-Lungen-Achsesind 6,7. Weitere Berichte haben ihren funktionellen Einfluss auf den Stoffwechsel über die Darm-Hirn-Achse beschrieben 8,9. Insgesamt wird der Einfluss von SCFAs auf die Physiologie und Pathologie des Wirts von zahlreichen Forschungsgruppen aus einem breiten Spektrum von Krankheitsprozessen aktiv und intensiv untersucht.

Acetat (C2), Propionat (C3) und Butyrat (C4) sind die primären SCFAs und werden von der Darmmikrobiota durch die Fermentation von einnehmbaren Ballaststoffen im Blinddarm und Dickdarm erzeugt. Alle drei SCFAs können auch direkt aus der Nahrung gewonnen werden, und nur Acetat darf auch von Säugetierzellen produziert werden. SCFAs werden im Dickdarm resorbiert und teilweise von Darmepithelzellen verwertet (als Energiequelle, zur lokalen Immunmodulation des Gewebes und zur Unterstützung der Aufrechterhaltung der Darmbarriere). Sie werden auch über das mesenteriale Venensystem10 in die Pfortader transportiert. Butyrat wird hauptsächlich von Darmepithelien konsumiert, Propionat von der Leber11,12, und es wurde berichtet, dass Acetat auf Muskel- und Fettgewebe wirkt, nachdem es in den peripheren Kreislauf gelangt ist13,14.

Eine umfassende Beurteilung der SCFA-Produktion, -Resorption und der funktionellen Aktivität erfordert die Kenntnis der SCFA-Spiegel im Dickdarmlumen, im Pfortaderkreislauf und im peripheren Blut. Dies kann durch Blutentnahme aus der Pfortader (PV) und systemische Zirkulation gleichzeitig oder nacheinander im selben Tier erreicht werden. Da SCFAs flüchtig15 sind, spiegelt die Messung ihrer Konzentrationen in ausgestoßenen Kotpellets möglicherweise nicht genau die Werte im Dickdarm wider. Darüber hinaus kann der Gehalt an SCFAs in der PV im Vergleich zu Messungen aus dem Dickdarminhalt die Nettosumme der vom Wirt absorbierten Steady-State-Spiegel im Vergleich zu den ungleichmäßigen Mengen, die vom Darmmikrobiom über die gesamte Länge des Dickdarms produziert werden, genauer widerspiegeln11. Diese PV-SCFA-Spiegel könnten daher relevanter und geeigneter sein, um die Auswirkungen von SCFAs auf die Physiologie und Pathologie des Wirts zu untersuchen, die über die lokalen Effekte im Darm hinausgehen.

Um die koordinierte und nahezu gleichzeitige Entnahme von PV und systemisch zirkulierendem Blut durchzuführen, sollte das Zwerchfell intakt bleiben, um eine normale Durchblutung aufrechtzuerhalten und die Spontanatmung zu unterstützen. Daher stellt die untere Hohlvene (IVC) eine ideale Stelle dar, um bei der Entnahme von PV-Blut systemisches Blutkreislauf zu gewinnen. Dieses IVC-Blut kann auch für andere Zwecke verwendet werden, z. B. zur Messung zirkulierender Zytokine zur Beurteilung systemischer Entzündungen.

Derzeit wurden bei größeren Nagetieren nur wenige Methoden zur Blutentnahme sowohl aus dem systemischen Kreislauf als auch aus der PV berichtet16,17. Herkömmliche Methoden, bei denen bei Ratten eine Kanülierung von Gefäßen erforderlich ist, sind bei Mäusen technisch schwierig durchzuführen. Darüber hinaus beträgt die maximale Menge an Blut, die mit diesen Methoden entnommen wird, in der Regel nicht mehr als 0,3 ml18.

In dieser Arbeit stellen wir eine neuartige Methode vor, die den Prozess der dualen Blutentnahme aus der IVC der Maus, gefolgt von PV, im selben Tier vereinfacht. Das Besondere an der Methode ist die Ligatur des PV in der Nähe des Leberhilums kurz vor der PV-Blutentnahme. Dieser Ansatz kann die Dimensionen des PV erweitern, wodurch die Erfolgsrate erheblich verbessert und das maximal entnahmebare Blutvolumen auf bis zu 0,5 ml erhöht wird.

Protocol

Alle Schritte dieses Verfahrens ohne Überleben wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der University of California San Francisco genehmigt. Das verwendete Mausgeschlecht und der verwendete Stamm waren männliche C57BL/6J-Mäuse (mit einem Gewicht von 25-35 g und einem Alter von 12-15 Wochen). Weibliche und/oder andere Standard-Mausstämme können ebenfalls verwendet werden. 1. Anästhesie Wischen Sie die untere Hälfte des Bauches der Maus mit 70%igen Ethanoltupfern ab. Verabreichen Sie die Anästhesie durch intraperitoneale Injektion von Tribromethanol (250-400 mg/kg). Auch eine Ketamin/Xylazin- oder Isofluran-Anästhesie kann verwendet werden. Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen auf, um Hornhautschäden zu vermeiden. Injizieren Sie Buprenorphin (0,05-0,1 mg/kg) intraperitoneal zur Analgesie.HINWEIS: Buprenorphin ist wegen der mit der Laparotomie verbundenen Schmerzen erforderlich. 2. Laparotomie Legen Sie die betäubte Maus in Rückenlage auf die Operationsoberfläche (mit einem Heizkissen darunter). Befestigen Sie alle Gliedmaßen der Maus mit Klebeband auf der Operationsplatte. Vergewissern Sie sich, dass die angemessene Anästhesietiefe durch Einklemmen der Zehen ohne Pedalrückzugsreflex erreicht wurde. Heben Sie die Haut an und machen Sie mit einer Präparierschere einen Längsschnitt entlang der Mittellinie vom Nabel bis zum Processus xiphoideus und kaudal in Richtung der Basis des Bauches (äußeres Geschlechtsorgan). Machen Sie einen ähnlichen Schnitt in das Bauchfell mit einer Präparierschere, ohne den Darm, das Zwerchfell oder die Leber zu perforieren oder zu beschädigen. Erweitern Sie das Operationsfeld, indem Sie mit einer Schere auf beiden Seiten des Nabels einen durchgehenden Querschnitt (Verlängerung der Bauchbreite) vornehmen. Bewegen Sie den Dick- und Dünndarm auf die rechte Seite des Chirurgen mit einer sauberen, in warmem PBS getränkten Gaze, um die darunter liegende IVC freizulegen. 3. Ligaturvorbereitung für PV Manipulieren Sie die Darmsegmente innerhalb des Operationsfeldes vorsichtig mit einem Wattestäbchen, um das PV an der Wurzel des Mesenteriums zu lokalisieren. Führen Sie mit einem Präpariermikroskop zur Visualisierung der Gefäße und anderer abdominaler Strukturen vorsichtig eine 7-0-Prolenen-Naht hinter das PV in der Nähe des Leberhilums (zwischen der Vena duodenus und der Milzvene)19 , so dass sie für die Ligatur in Schritt 5 bereit ist (Abbildung 1).HINWEIS: Die Verwendung eines Mikroskops ab diesem Schritt ist nicht zwingend erforderlich, verbessert jedoch die Erfolgsquote des Eingriffs erheblich. 4. Entnahme von Blutproben aus der IVC Führen Sie die 28 G 1/2-Zoll-Nadel einer heparinisierten 1-cm³-Insulinspritze in die IVC ein. Entnehmen Sie 0,2-0,3 ml Blutprobe.HINWEIS: Wenn in diesem Schritt zu viel Blut entnommen wird, führt dies zu geringeren Mengen an PV-Blut, die in Schritt 5 entnommen werden. Lassen Sie die Nadel in der IVC, um Blutungen zu vermeiden, die bei der Entnahme auftreten würden. 5. Entnahme von Blutproben aus dem PV Binden Sie die 7-0 Prolene-Ligatur vorsichtig um den PV; Das PV sollte sich ausdehnen und erweitern, wenn es sich verfüllt. Führen Sie die 28G 1/2-Zoll-Nadel einer anderen heparinisierten 1-cm³-Insulinspritze in das PV ein. Aspirieren Sie langsam, um bis zu 0,3-0,5 ml Blut aus dem PV zu sammeln. Das PV kann kollabieren, sollte sich aber allmählich wieder ausdehnen, wenn das Blut aus dem mesenterialen Venensystem wieder aufgefüllt wird. 6. Lagerung der Proben Entfernen Sie nach der Blutentnahme die Nadeln aus der IVC und PV. Übertragen Sie die Blutproben aus den Spritzen in 1,5 mL heparinisierte Eppendorf-Röhrchen und legen Sie sie auf Eis, um sie später zur Lagerung und Analyse in Plasma zu verarbeiten. Euthanasieren Sie die Maus mit einer Überdosis Anästhetika, gefolgt von einer Gebärmutterhalsluxation (gemäß den von der UCSF IACUC genehmigten Richtlinien).

Representative Results

Mit der oben beschriebenen Methode können wir Blutproben aus der IVC und PV nacheinander in ein und derselben Maus mit einer Erfolgsquote von mehr als 95% entnehmen. Das durchschnittliche Volumen der entnommenen Blutproben beträgt 0,25 mL für die IVC und 0,35 mL für die PV. Mittels Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) haben wir die Konzentration von SCFAs in Kot, PV-Blut und IVC-Blut gemessen und konnten so die Absorption und den Transit von Acet…

Discussion

Diese Arbeit beschreibt eine innovative in vivo Methode zur nahezu gleichzeitigen Entnahme von Blutproben aus dem IVC und PV in derselben experimentellen Maus. Diese Methode ist nützlich, um den Gehalt an durch die Darmmikrobiota erzeugten Produkten, wie z. B. SCFAs, zu messen, die den Pfortaderkreislauf durchlaufen. Das durchschnittliche maximale Blutvolumen, das während eines terminalen Eingriffs bei Mäusen (mit einem Gewicht von 25-30 g) entnommen werden kann, beträgt etw…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

AP wird durch einen R01-Preis des NIH/NHLBI (1R01HL146753) finanziert. DM wird durch ein T32-Stipendium des NIH und durch einen Trainee/Staff Pilot Award des UCSF Benioff Center for Microbiome Medicine finanziert.

Materials

2,2,2 Tribromoethanol, 97% (Avertin) Sigma Aldrich  T48402-25G Anesthetic agent 
Buprenorphine Hydrochloride Injection 0.3 mg/mL PAR Pharmaceutical  NDC 42023-179-05 Analgesic agent
Dressing Forceps Miltex  6-100 Dissection 
Graefe Forceps Roboz RS-5136 Dissection 
Hepatin sodium 1000 USP units/mL Hikma NDC 0641-0391-12 Blood sample syringes/tubes heparinization
Prolene 7-0 Ethicon 8696G Portal vein ligature
Scissors F.S.T 14058-11 Dissection 
Student Halsted-Mosquito Hemostats F.S.T  91308-12 Dissection 
Surgical tape  3M Transpore 1527-1 Mouse limbs fixation
U-100 Insulin Syringe 28G1/2 EXEL 26027 Blood sample collection 

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Doan, T. N. M., Maruyama, D., Tian, X., Prakash, A. Sequential Blood Collection from Inferior Vena Cava Followed by Portal Vein to Evaluate Gut Microbial Metabolites in Mice. J. Vis. Exp. (208), e66673, doi:10.3791/66673 (2024).

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