Anwendung der unüberwachten Multi-Omik-Faktorenanalyse zur Aufdeckung von Variationsmustern und molekularen Prozessen im Zusammenhang mit Herz-Kreislauf-Erkrankungen

Krankheitsmechanismen sind in der Regel komplex und werden durch das Zusammenspiel mehrerer unterschiedlicher molekularer Prozesse bestimmt. Die komplexen molekularen Mechanismen zu entschlüsseln, die zu bestimmten Krankheiten führen oder die Evolution einer Krankheit steuern, ist eine Aufgabe von hoher medizinischer Relevanz, da sie neue Erkenntnisse für das Verständnis und die Behandlung von Krankheiten liefern kann.

Jüngste technologische Fortschritte ermöglichen es, diese Prozesse mit höherer Auflösung (z.B. auf Einzelzellebene) und gleichzeitig auf verschiedenen biologischen Schichten (z.B. DNA, MRNA, Chromatinzugänglichkeit, DNA-Methylierung, Proteomik) zu messen. Dies führt dazu, dass zunehmend große mehrdimensionale biologische Datensätze generiert werden, die gemeinsam analysiert werden können, um mehr Einblicke in die zugrundeliegenden Prozesse zu gewinnen. Gleichzeitig bleibt die Kombination und Analyse der verschiedenen Datenquellen auf biologisch sinnvolle Weise eine herausfordernde Aufgabe¹.

Unterschiedliche technologische Grenzen, Geräusche und Variabilitätsbereiche zwischen verschiedenen Omics stellen eine Herausforderung dar. Zum Beispiel sind die Daten zur Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) sehr spärlich und werden oft von großen technischen oder Batch-Effekten beeinflusst. Darüber hinaus ist der Merkmalsraum oft sehr groß und erstreckt sich über mehrere tausend gemessene Gene oder Proteine, während die Stichprobengrößen begrenzt sind. Dies wird durch komplexe Designs weiter erschwert, die mehrere Krankheitszustände, Störfaktoren, Zeitpunkte und Auflösungen umfassen können. So standen im vorgestellten Anwendungsfall unterschiedliche Datentypen entweder auf Einzelzell- oder Stichprobenebene (Bulk) zur Verfügung. Darüber hinaus können die Daten unvollständig sein und nicht alle Messungen für alle analysierten Probanden verfügbar sein.

Aufgrund dieser Herausforderungen werden verschiedene Omics und enthaltene Merkmale immer noch oft nur separat analysiert², obwohl eine integrierte Analyse nicht nur ein vollständiges Bild des Prozesses liefern kann, sondern biologische und technische Geräusche von einem Omics auch durch andere Omics kompensiert werden können ^3,4. Um eine integrierte Analyse von Multi-Omics-Daten durchzuführen, wurden verschiedene Methoden vorgeschlagen, darunter Bayes’sche Methoden, netzwerkbasierte Methoden ^5,6, multimodales Deep Learning⁷ und Methoden zur Dimensionalitätsreduktion durch Matrixfaktorisierung ^8,9. Für Letzteres haben die Ergebnisse einer großen Benchmarking-Studie¹⁰ gezeigt, dass die MOFA^9-Methode (Multi-omic factor analysis) eines der besser geeigneten Instrumente ist, wenn Daten mit klinischen Annotationen verknüpft werden sollen.

Insbesondere in komplexen Umgebungen sind unüberwachte Matrixfaktorisierungsmethoden ein nützlicher Ansatz, um die Komplexität zu reduzieren und gemeinsame und komplementäre Signale aus verschiedenen Datenquellen und Merkmalen zu extrahieren. Durch die Zerlegung des komplexen Raums in latente Repräsentationen niedrigerer Ränge können die Hauptquellen der Varianz innerhalb der Daten schnell untersucht und mit bekannten Kovariaten verknüpft werden. Falls das gleiche Variationsmuster über mehrere Merkmale (z. B. Gene oder Proteine) hinweg auftritt, kann dies auf einige wenige Faktoren aggregiert werden, während das Rauschen reduziert wird. Die Regularisierung kann verwendet werden, um die Seltenheit der Modellkoeffizienten zu erhöhen, wodurch der Ansatz gut in Umgebungen geeignet ist, in denen der Merkmalsraum groß ist, während die Anzahl der Stichproben begrenzt ist⁹.

Dieses Protokoll stellt einen flexiblen Analyse-Workflow dar, der das MOFA-Modell verwendet, um zu zeigen, wie ein komplexer Multi-Omics-Datensatz schnell untersucht und die Hauptvariationsmuster herausgefiltert werden können, die diesen Datensatz charakterisieren. Der Workflow besteht aus drei Hauptschritten. Im ersten Schritt, Datenvorverarbeitung und -harmonisierung, werden verschiedene Strategien zur Datenvorverarbeitung auf Basis unterschiedlicher Eingabedatentypen (scRNA-seq, Proteomik, Zytokin, klinische Daten) vorgestellt. Das Protokoll erläutert, wie die Merkmale der verschiedenen Eingabedatensätze verarbeitet, Merkmale von geringer Qualität herausgefiltert und normalisiert werden, um ihre Verteilungen zu harmonisieren. Wir zeigen auch, wie sich diese Vorverarbeitungsentscheidungen auf die nachgelagerten Ergebnisse auswirken können. Im zweiten Schritt wird das MOFA-Modell auf die Daten angewendet, und die resultierende Varianzzerlegung kann verwendet werden, um die Integration der verschiedenen Datensätze zu bewerten. Der dritte Schritt zeigt, wie man die erfassten Faktoren mit Kovariaten verknüpft und die molekularen Programme aufdeckt, die diese Faktoren definieren. Mit dem vorgestellten Workflow konnten wir mehrere latente Faktoren, die mit klinischen Kovariaten verbunden sind, in einem Datensatz von Patienten mit Koronarsyndromen extrahieren und potenziell zugrunde liegende multizelluläre Immunprogramme aus einem früheren Projekt^{identifizieren 11}. Wir werden diesen Datensatz hier verwenden, aber das Protokoll kann leicht auf andere Kontexte angewendet werden, einschließlich anderer Omics.

Der Datensatz besteht aus Proben von Patienten mit stabilen chronischen Koronarsyndromen (CCS), akuten Koronarsyndromen (ACS) und einer Kontrollgruppe mit gesunden Koronarsyndromen (ohne CCS) (Abbildung 1). ACS wird durch eine Plaqueruptur bei bereits bestehendem CCS verursacht, die zu einer akuten Störung des Blutflusses zum Myokard und einer anschließenden ischämischen Verletzung des Herzens führt. Diese Schädigung führt zu einer Entzündungsreaktion des Immunsystems, gefolgt von einer Reparaturphase, die bis mehrere Tage nach dem akuten Ereignis andauert¹². Um diese Immunantwort bei ACS-Patienten charakterisieren zu können, wurden Blutproben zu vier verschiedenen Zeitpunkten entnommen: akut (TP1); nach Rekanalisation (14 [± 8] h) (TP2); 60 [± 12] h später (TP3); vor der Entlassung (6,5 [±1,5] Tage) (TP4) (Abbildung 1A). Für CCS und Patienten mit gesunden Herzkranzgefäßen stand nur ein Zeitpunkt zur Verfügung (TP0). Für alle Patienten und Zeitpunkte wurden verschiedene Assays auf Basis der Blutproben gemessen: klinische Marker für Entzündungen (Kreatinkinase (CK), CK-MB, Troponin, C-reaktives Protein (CRP)), scRNA-seq von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs), Zytokinanalyse, Plasmaproteomik und prime-seq^13-Daten von Neutrophilen.

Abbildung 1: Multi-OMIC-Eingabedatensatz für Myokardinfarkt. Eingabedatensatz: Die analysierten Daten umfassen Blutproben von Patienten (n = 62) mit akutem Koronarsyndrom (ACS), chronischem Koronarsyndrom (CCS) und Patienten mit gesunden Koronargefäßen (nicht-CCS). Bei ACS-Patienten wurden Blutproben zu vier verschiedenen Zeitpunkten (TP1-4) eingeschlossen, bei CCS- und Nicht-CCS-Patienten zu einem einzigen Zeitpunkt (TP0). Jede Kombination aus Patient und Zeitpunkt wird in der Analyse als separate Probe behandelt. An den Proben wurden verschiedene omische Assays gemessen: klinische Bluttests (n = 125), scRNA-seq (n = 121), Plasma-Proteomics (n = 119), Zytokin-Assay (n = 127) und neutrophile prime-seq (n = 121). Anschließend wurde das beschriebene Protokoll angewendet, um die Daten über alle Omics hinweg zu integrieren und mit Hilfe des MOFA-Modells und weiterer nachgelagerter Analysen (Faktorenanalyse, Pathway Enrichment) zu untersuchen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Als Input für den hier vorgestellten Workflow nehmen wir Rohzählungen aus scRNA-seq-Daten nach der Verarbeitung mit cellranger und Qualitätskontrolle (QC), wie z.B. im scanpy¹⁴ Preprocessing Tutorial beschrieben. Für die Zelltyp-Annotation haben wir die automatisierte Azimuth^15-Pipeline verwendet. Die Zählungen werden dann auf Stichprobenebene für jeden Zelltyp aggregiert, indem der Mittelwert für alle Zellen für jede Probe und jeden Zelltyp gemessen wird (Pseudobulk-Aggregation). Die Plasma-Proteomik wird als normalisierte und medianzentrierte Intensitäten eingeschlossen, und für Neutrophile nehmen wir die UMI-Exonzahlen (UMI) aus dem Prime-Seq. Bei den Zytokin- und klinischen Werten wurde keine vorherige Vorverarbeitung durchgeführt. Weitere Einzelheiten zur (experimentellen) Datengenerierung sind im entsprechenden Manuskript¹¹ enthalten. Da die hier vorgestellten Ergebnisse auf der Verwendung der automatisierten Azimut-Annotation für Zelltypen in den scRNA-seq-Daten basieren, verglichen mit der markerbasierten Strategie, die in der referenzierten Publikation verwendet wurde, sind die hier vorgestellten Ergebnisse ähnlich, aber nicht genau die gleichen wie in der Publikation. Im Manuskript konnte gezeigt werden, dass die Zelltyp-Annotationsstrategie die Hauptmuster und biologischen Interpretationen der Analyse nicht verändert, aber kleine Änderungen in den genauen Werten, die sich aus dem Modell ergeben, variieren können. Insgesamt handelte es sich bei den Eingabedaten um einen komplexen, mehrdimensionalen Datensatz mit verschiedenen Zeitpunkten und Messniveaus (Einzelzellen vs. Volumen) von mehr als 10.000 verschiedenen Merkmalen (Gene, Proteine, klinische Werte). Es hat sich gezeigt, dass eine strenge Vorverarbeitungs- und Datenharmonisierungsstrategie, gefolgt von einer MOFA-Analyse, ein nützliches und schnelles Werkzeug ist, um die Daten zu untersuchen und relevante Immunprogramme zu extrahieren. Jeder Zeitpunkt und jede Patientenkombination wird in der MOFA-Analyse als eigenständige Probe behandelt. Jeder Datentyp und jeder Zellentyp wird in der MOFA-Analyse als separate Ansicht betrachtet.

Dieses Protokoll enthält Anweisungen zum Vorbereiten der Eingabedaten für den Workflow, zum Ausführen der verschiedenen Workflow-Schritte, zum Anpassen von Konfigurationen, zum Interpretieren der resultierenden Zahlen und zum iterativen Anpassen der Konfigurationen auf der Grundlage der Interpretationen. Einen Überblick über die verschiedenen Schritte des Protokolls, die erforderlichen Eingabedatensätze bei jedem Schritt und die daraus resultierenden Zahlen und Datensätze bietet die technische Workflow-Übersicht (Abbildung 2).

Abbildung 2: Überblick über den technischen Workflow. Skizzierung des Workflows für die Analyse des Multi-Omics-Datensatzes. Die verschiedenen Elemente werden durch unterschiedliche Farben und Symbole hervorgehoben. Jupyter Notebooks, die zum Schritt Datenvorverarbeitung und -harmonisierung (1) gehören, sind blau eingefärbt. Jupyter Notebooks, die zur Stufe ‘MOFA Model’ (2) gehören, sind orange eingefärbt. Jupyter Notebooks, die zum Schritt “Downstream-Analyse” (3) gehören, sind grün eingefärbt. Ein Jupyter Notebook, das zum Vergleich der Ergebnisse verwendet werden soll, ist gelb eingefärbt. Konfigurationsdateien, in denen Parameter für die Ausführung des Workflows geändert werden können, sind violett hervorgehoben. Eingabedatasets, die zum Ausführen des Workflows erforderlich sind, werden durch das Datensatzsymbol gekennzeichnet und grau hervorgehoben. Alle Abbildungsausgaben, die während der Workflow-Ausführung erzeugt werden, sind durch das Lupensymbol gekennzeichnet. Datensätze, die während der Workflow-Ausführung generiert werden, werden als Tabellen angezeigt. Im Allgemeinen wird der Workflow sequentiell ausgeführt: (1) Die Datenvorverarbeitung und -harmonisierung besteht aus zwei Schritten: der ersten Generierung einer Pseudobulk-Tabelle auf der Grundlage der scRNA-seq-Eingabedaten (01_Prepare_Pseudobulk) und der anschließenden Integration und Normalisierung dieser Daten zusammen mit allen anderen Eingaben auf Probenebene (Bulk) (02_Integrate_and_Normalize_Data). Innerhalb dieses Schritts ist es über die Konfigurationsdateien möglich, für jeden Datensatz separat zu konfigurieren, welcher der angegebenen Vorverarbeitungs- und Normalisierungsschritte (z.B. Sample Filter) angewendet werden soll. (2) “MOFA-Modell”: führt das MOFA-Modell auf der generierten Eingabe des ersten Schritts mit den in der Konfigurationsdatei angegebenen Konfigurationen aus (03_MOFA_configs.csv). (3) “Downstream-Analyse”: besteht aus drei verschiedenen Notebooks, die unabhängig voneinander ausgeführt werden können, um Einblicke in die generierten MOFA-Ergebnisse zu generieren und sie mit Beispiel-Metadaten (Kovariaten) zu verknüpfen, die als Eingabe über die Datei “Sample Meta Data.csv” bereitgestellt werden. (4) “Modellvergleich”: ist ein kleiner separater Schritt, der zum Vergleich verschiedener in Schritt 2 erstellter Modelle verwendet werden kann. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Der Workflow besteht aus mehreren Jupyter Notebooks, die in R und Python geschrieben sind (Kenntnisse der Sprache R und Python sind zum Ausführen des Workflows nicht erforderlich, können aber hilfreich sein, falls Fehler auftreten). In verschiedenen Schritten des Protokolls werden Parameter über Konfigurationsdateien geändert (‘.csv’-Dateien, die den Zusatz ‘_Configs’ im Namen enthalten). Innerhalb des Protokolls skizzieren wir nur die Parameter, die ausgehend von der Standardkonfiguration geändert werden müssen.

Es können auch einige andere Parameter geändert werden, um beispielsweise die Vorverarbeitung anzupassen. Eine Dokumentation dieser Parameter und Erläuterungen finden Sie in der Datei ‘Documentation_Config_Parameter’, die im heruntergeladenen Repository enthalten ist.