Es wird ein Protokoll für die femorale Osteotomie unter Verwendung der internen Plattenfixation bei reifen Axolotln vorgestellt. Mit dem Verfahren können vergleichende Studien zur Regeneration und Frakturheilung von Gliedmaßen bei aquatischen Amphibien durchgeführt werden.
Der Axolotl (Ambystoma mexicanum) ist ein vielversprechender Modellorganismus für die regenerative Medizin aufgrund seiner bemerkenswerten Fähigkeit, verlorene oder beschädigte Organe wie Gliedmaßen, Gehirn, Herz, Schwanz und andere zu regenerieren. Studien an Axolotln geben Aufschluss über zelluläre und molekulare Signalwege, die die Aktivierung von Vorläuferzellen und die Gewebewiederherstellung nach Verletzungen steuern. Dieses Wissen kann angewendet werden, um die Heilung von regenerationsinkompetenten Verletzungen, wie z.B. Knochenpseudarthrose, zu erleichtern. Im aktuellen Protokoll wird die Stabilisierung der Femurosteotomie mittels eines internen Plattenfixationssystems beschrieben. Das Verfahren wurde für die Anwendung bei Wassertieren (Axolotl, Ambystoma mexicanum) angepasst. Es wurden ≥20 cm lange Axolotl von der Schnauze bis zur Schwanzspitze mit vollständig verknöcherten, mausgrößengroßen, vergleichbaren Femuren verwendet, wobei besonderes Augenmerk auf die Positionierung und Fixierung der Platte sowie auf die postoperative Versorgung gelegt wurde. Diese Operationstechnik ermöglicht eine standardisierte und stabilisierte Knochenfixierung und könnte für einen direkten Vergleich mit der Regeneration von Axolotl-Gliedmaßen und analogen Studien zur Knochenheilung bei Amphibien und Säugetieren nützlich sein.
Der Axolotl (Ambystoma mexicanum) ist ein wichtiges Modell für die Organregeneration, einschließlich des Schwanzes, des Rückenmarks, des Gehirns, des Herzens, der Kiemen und der Gliedmaßen 1,2,3,4,5. Detaillierte Studien zur Regeneration der Axolotl-Gliedmaßen deckten Mechanismen der Zelldedifferenzierung und der Bildung eines Stammzellpools, des Blastems, an der Amputationsstelle auf. Aufgrund der Fähigkeit der Blastemzellen, alle fehlenden Gliedmaßenteile, einschließlich eines gemusterten Skeletts 6,7, zu rekonstruieren, scheint der Axolotl ein attraktiver Modellorganismus für Knochenheilungsstudien zu sein. In jüngster Zeit konzentrierten sich mehrere Studien mehr auf die Knochenbiologie bei Axolotln und beschrieben die Skelettmorphologie, die zelluläre Zusammensetzung und die Ossifikationsdynamik.
Bei Säugetieren wurde festgestellt, dass der Knochenheilungsprozess in langen Knochen über die endochondrale Ossifikation erfolgt und aus mehreren Stadien besteht: Hämatom, Granulationsgewebe und Bildung von weichem Kallus, Kallusverknöcherung in harten Kallus und gewebten Knochen sowie Knochenumbau8. Eine kürzlich durchgeführte Studie hat gezeigt, dass ähnliche Stadien bei der Knochenheilung von Axolotln beobachtet werdenkönnen 9.
Bisher wurden Axolotl-Frakturen in einem unstabilisierten System untersucht, wobei der Knochen einfach mit einer Iridektomieschere geschnitten wird. Die großen Frakturen wurden beim Zeugopoden erzeugt, wo die Osteotomie an einem der Knochen durchgeführt wird, während der andere als Stütze dient10,11. Im Gegensatz dazu werden Frakturen routinemäßig bei Säugetieren, einschließlich Ratten und Mäusen, unter Verwendung zuverlässiger Fixationssysteme wie intramedulläre Stifte und Knochenausrichtungsplatten untersucht, um die Frakturgröße zu kontrollieren und die Knochenausrichtung sicherzustellen.
Die Methode zielt somit darauf ab, eine stabilisierte und gleichmäßige Fixierung des Axolotl-Femurs vor der Osteotomie zu gewährleisten. Um Axolotl-Studien besser mit Säugetieren, einschließlich Mäusen und Menschen, vergleichbar zu machen, wurden die intramedulläre Pin12, der externe Plattenfixateur13,14 und die interne Knochenausrichtungsplatte 15,16,17 in Betracht gezogen. Es hat sich gezeigt, dass letzteres eine korrekte Knochenfixierung gewährleistet und es ermöglicht, einen Spalt einer bestimmten Größe zu schaffen, indem ein oder zwei Schnitte mit einer Gigly-Säge mit einem bestimmten Durchmesser verwendet werden. Da Axolotl die aquatischen Larven von Ambystoma mexicanum darstellen, könnte der externe Fixateur aufgrund der offenen Wunde und des Kontakts mit Wasser postoperative Komplikationen verursacht haben. Da Axolotl auch sehr spät in ihrer Entwicklung (20 Jahrealt, 18) keine sekundären Ossifikationszentren entwickeln und daher der bei Mäusen verwendete Standard-Marknagel möglicherweise nicht daran gehindert werden kann, die Epiphysen zu punktieren, wurde die Entscheidung getroffen, eine interne Plattenfixationsmethode bei großen Axolotln anzuwenden. Bei großen Axolotln ähneln die Femurgröße und der Grad der Ossifikation denen einer erwachsenen Maus, was eine mittlere diaphysäre Osteotomie mit Titanplattenfixation ermöglicht1.
Die Größe des Frakturspalts bestimmt maßgeblich die Heilungsdynamik und das Ergebnis. Bei einer Maus heilen beispielsweise 0,25 mm stabilisierte Frakturen aufgrund ihrer geringen Größe und starren Stabilisierung hauptsächlich durch intramembranöse Ossifikation; eine 0,7 mm große Fraktur heilt durch endochondrale Ossifikation ab, wobei sich um die Fraktur ein knorpeliger Kallus bildet; Große Defekte, wie z. B. 3,5 mm Defekte mit kritischer Größe, heilen nicht vollständig und werden daher zur Modellierung von Knochenbrüchen ohne Pseudarthroseverwendet 16. In dieser Studie wurde das Plattenfixationsprotokoll des Axolotl-Femurs vor der Osteotomie am Beispiel eines 0,7 mm Frakturspaltes erstellt, mit dem ultimativen Ziel, die Knochenheilung des Axolotls mit der der Maus zu vergleichen9.
Nach der Osteotomie durchliefen die Frakturen den Prozess der endochondralen Ossifikation, wenn auch langsamer als bei Mäusen, möglicherweise aufgrund des aquatischen Lebensstils der Axolotl und der langsameren Zellteilungsraten. Bei der hier vorgestellten Methode wird die 0,7 mm Spaltosteotomie mit starrer Plattenfixation gezeigt; Es sind jedoch möglicherweise auch andere Spaltgrößen und halbflexible Fixatatoren sowie Platten aus unterschiedlichen Materialien möglich. Insgesamt kann die hier vorgestellte Methode für die standardisierte Knochenfixation verwendet werden und wird hilfreich für Studien sein, die die Regeneration der Axolotl-Gliedmaßen mit der Knochenheilung vergleichen oder die Knochenheilung bei Axolotln unter verschiedenen Bedingungen untersuchen, um eine standardisierte Frakturfixierung zu gewährleisten.
Die derzeit beschriebene Methode der Femurplattenfixation und Osteotomie ermöglicht die Anwendung bei Wassertieren, wie z.B. Ambystoma mexicanum (Axolotl). Diese chirurgische Methode wurde kürzlich verwendet, um die Frakturheilung und Regeneration der Gliedmaßen bei Axolotln mit der Frakturheilung bei Mäusenzu vergleichen 9. Wie bei Mäusen kann eine 4-Loch-Fixatorplatte mit selbstbrechenden Schrauben am Knochen befestigt werden, und mit einer Gigly-S…
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren danken Sabine Stumpp für die hervorragende technische Unterstützung und Lidia Grösser für die Unterstützung bei den Operationen. Diese Forschung wurde gefördert durch den österreichischen Wissenschaftsfonds [Hertha Firnberg Fellowship Nummer T-1219], ERC [Advanced Grant, 742046 RegGeneMems], DFG [SFB 1444].
0.66 mm Gigly wire saw | RISystem | RIS.590.120 | |
7.0 Optilene suture | Braun | C3090538 | |
Benzocaine | Sigma-Aldrich | E1501 | dilute to 0.03% prior to using |
Butorphanol (Butomidor 10 mg/mL) | Richter Pharma AG | – | dilute to 0.5 mg/L prior to using |
Drill bit 0.30 mm | RISystem | RIS.590.200 | |
Dumont #5 Forceps – Standard/Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | |
Hand drill | RISystem | RIS.390.130 | better to have at least 3 pieces |
Micro CT data analyzer | Bruker, Billerica, MA, USA | SkyScan NRecon software | |
Micro CT specimen scanner | Bruker, Billerica, MA, USA | SkyScan 1172 | |
Moria MC31b Iris forceps – smooth, curved, 10 cm | Fine Science Tools | 11373-12FST | 2 pieces |
MouseFix Drill-&Saw guide 1.75 mm, rigid | RISystem | RIS.301.102 | |
MouseFix plate 4 hole, rigid | RISystem | RIS.401.110 | |
MouseFix screw, L =2.00 mm | RISystem | RIS.401.100 | need 4 per bone |
Narrow Pattern Forceps | VWR | FSCI11002-12 | |
penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Ring forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | |
scalpel #15 | B Braun, Thermo Fischer Scientific | 5518032 | |
Square box wrench 0.50 mm | RISystem | RIS.590.111 | |
Sterile bone wax, 2.5 g | Ethicon, Johnson & Johnson | W810 | |
Student Fine Scissors – Straight/11.5cm | Fine Science Tools | 91460-11 |