Summary

Stabilisierung einer Femurosteotomie mit einer Plattenfixation bei Ambystoma mexicanum

Published: April 12, 2024
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Summary

Es wird ein Protokoll für die femorale Osteotomie unter Verwendung der internen Plattenfixation bei reifen Axolotln vorgestellt. Mit dem Verfahren können vergleichende Studien zur Regeneration und Frakturheilung von Gliedmaßen bei aquatischen Amphibien durchgeführt werden.

Abstract

Der Axolotl (Ambystoma mexicanum) ist ein vielversprechender Modellorganismus für die regenerative Medizin aufgrund seiner bemerkenswerten Fähigkeit, verlorene oder beschädigte Organe wie Gliedmaßen, Gehirn, Herz, Schwanz und andere zu regenerieren. Studien an Axolotln geben Aufschluss über zelluläre und molekulare Signalwege, die die Aktivierung von Vorläuferzellen und die Gewebewiederherstellung nach Verletzungen steuern. Dieses Wissen kann angewendet werden, um die Heilung von regenerationsinkompetenten Verletzungen, wie z.B. Knochenpseudarthrose, zu erleichtern. Im aktuellen Protokoll wird die Stabilisierung der Femurosteotomie mittels eines internen Plattenfixationssystems beschrieben. Das Verfahren wurde für die Anwendung bei Wassertieren (Axolotl, Ambystoma mexicanum) angepasst. Es wurden ≥20 cm lange Axolotl von der Schnauze bis zur Schwanzspitze mit vollständig verknöcherten, mausgrößengroßen, vergleichbaren Femuren verwendet, wobei besonderes Augenmerk auf die Positionierung und Fixierung der Platte sowie auf die postoperative Versorgung gelegt wurde. Diese Operationstechnik ermöglicht eine standardisierte und stabilisierte Knochenfixierung und könnte für einen direkten Vergleich mit der Regeneration von Axolotl-Gliedmaßen und analogen Studien zur Knochenheilung bei Amphibien und Säugetieren nützlich sein.

Introduction

Der Axolotl (Ambystoma mexicanum) ist ein wichtiges Modell für die Organregeneration, einschließlich des Schwanzes, des Rückenmarks, des Gehirns, des Herzens, der Kiemen und der Gliedmaßen 1,2,3,4,5. Detaillierte Studien zur Regeneration der Axolotl-Gliedmaßen deckten Mechanismen der Zelldedifferenzierung und der Bildung eines Stammzellpools, des Blastems, an der Amputationsstelle auf. Aufgrund der Fähigkeit der Blastemzellen, alle fehlenden Gliedmaßenteile, einschließlich eines gemusterten Skeletts 6,7, zu rekonstruieren, scheint der Axolotl ein attraktiver Modellorganismus für Knochenheilungsstudien zu sein. In jüngster Zeit konzentrierten sich mehrere Studien mehr auf die Knochenbiologie bei Axolotln und beschrieben die Skelettmorphologie, die zelluläre Zusammensetzung und die Ossifikationsdynamik.

Bei Säugetieren wurde festgestellt, dass der Knochenheilungsprozess in langen Knochen über die endochondrale Ossifikation erfolgt und aus mehreren Stadien besteht: Hämatom, Granulationsgewebe und Bildung von weichem Kallus, Kallusverknöcherung in harten Kallus und gewebten Knochen sowie Knochenumbau8. Eine kürzlich durchgeführte Studie hat gezeigt, dass ähnliche Stadien bei der Knochenheilung von Axolotln beobachtet werdenkönnen 9.

Bisher wurden Axolotl-Frakturen in einem unstabilisierten System untersucht, wobei der Knochen einfach mit einer Iridektomieschere geschnitten wird. Die großen Frakturen wurden beim Zeugopoden erzeugt, wo die Osteotomie an einem der Knochen durchgeführt wird, während der andere als Stütze dient10,11. Im Gegensatz dazu werden Frakturen routinemäßig bei Säugetieren, einschließlich Ratten und Mäusen, unter Verwendung zuverlässiger Fixationssysteme wie intramedulläre Stifte und Knochenausrichtungsplatten untersucht, um die Frakturgröße zu kontrollieren und die Knochenausrichtung sicherzustellen.

Die Methode zielt somit darauf ab, eine stabilisierte und gleichmäßige Fixierung des Axolotl-Femurs vor der Osteotomie zu gewährleisten. Um Axolotl-Studien besser mit Säugetieren, einschließlich Mäusen und Menschen, vergleichbar zu machen, wurden die intramedulläre Pin12, der externe Plattenfixateur13,14 und die interne Knochenausrichtungsplatte 15,16,17 in Betracht gezogen. Es hat sich gezeigt, dass letzteres eine korrekte Knochenfixierung gewährleistet und es ermöglicht, einen Spalt einer bestimmten Größe zu schaffen, indem ein oder zwei Schnitte mit einer Gigly-Säge mit einem bestimmten Durchmesser verwendet werden. Da Axolotl die aquatischen Larven von Ambystoma mexicanum darstellen, könnte der externe Fixateur aufgrund der offenen Wunde und des Kontakts mit Wasser postoperative Komplikationen verursacht haben. Da Axolotl auch sehr spät in ihrer Entwicklung (20 Jahrealt, 18) keine sekundären Ossifikationszentren entwickeln und daher der bei Mäusen verwendete Standard-Marknagel möglicherweise nicht daran gehindert werden kann, die Epiphysen zu punktieren, wurde die Entscheidung getroffen, eine interne Plattenfixationsmethode bei großen Axolotln anzuwenden. Bei großen Axolotln ähneln die Femurgröße und der Grad der Ossifikation denen einer erwachsenen Maus, was eine mittlere diaphysäre Osteotomie mit Titanplattenfixation ermöglicht1.

Die Größe des Frakturspalts bestimmt maßgeblich die Heilungsdynamik und das Ergebnis. Bei einer Maus heilen beispielsweise 0,25 mm stabilisierte Frakturen aufgrund ihrer geringen Größe und starren Stabilisierung hauptsächlich durch intramembranöse Ossifikation; eine 0,7 mm große Fraktur heilt durch endochondrale Ossifikation ab, wobei sich um die Fraktur ein knorpeliger Kallus bildet; Große Defekte, wie z. B. 3,5 mm Defekte mit kritischer Größe, heilen nicht vollständig und werden daher zur Modellierung von Knochenbrüchen ohne Pseudarthroseverwendet 16. In dieser Studie wurde das Plattenfixationsprotokoll des Axolotl-Femurs vor der Osteotomie am Beispiel eines 0,7 mm Frakturspaltes erstellt, mit dem ultimativen Ziel, die Knochenheilung des Axolotls mit der der Maus zu vergleichen9.

Nach der Osteotomie durchliefen die Frakturen den Prozess der endochondralen Ossifikation, wenn auch langsamer als bei Mäusen, möglicherweise aufgrund des aquatischen Lebensstils der Axolotl und der langsameren Zellteilungsraten. Bei der hier vorgestellten Methode wird die 0,7 mm Spaltosteotomie mit starrer Plattenfixation gezeigt; Es sind jedoch möglicherweise auch andere Spaltgrößen und halbflexible Fixatatoren sowie Platten aus unterschiedlichen Materialien möglich. Insgesamt kann die hier vorgestellte Methode für die standardisierte Knochenfixation verwendet werden und wird hilfreich für Studien sein, die die Regeneration der Axolotl-Gliedmaßen mit der Knochenheilung vergleichen oder die Knochenheilung bei Axolotln unter verschiedenen Bedingungen untersuchen, um eine standardisierte Frakturfixierung zu gewährleisten.

Protocol

Das folgende Verfahren wurde mit Genehmigung des Magistrats Wien (GZ: MA 58-65248-2021-26) durchgeführt. 5-8 Jahre alt, ≥ 20 cm lange Axolotl (Ambystoma mexicanum) von der Schnauze bis zur Schwanzspitze (Ambystoma mexicanum) wurden für Frakturoperationen und Amputationen verwendet. Für die Operationen wurden sowohl Männer als auch Frauen eingesetzt. Axolotl wurden in der Einrichtung des Forschungsinstituts für Molekulare Pathologie gezüchtet. Schmerzen und Infektionsrisiko wurden mit geeigneten Analgetika und Antibiotika behandelt, um ein erfolgreiches Ergebnis zu gewährleisten. Die für die Studie verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt. 1. Vorbereitung der Tiere Baden Sie das Tier etwa 15-20 Minuten lang in 0,03%iger Benzocainlösung, bis die vollständige Sedierung erreicht ist und es keine reflexartigen Bewegungen mehr gibt, wenn die Gliedmaßen mit der Pinzette berührt werden. Legen Sie das Tier mit der Bauchseite nach unten auf feuchte, in 0,03%ige Benzocainlösung getränkte Papiertücher und decken Sie es mit Benzocain-getränkten Papiertüchern ab. Die Haut von Wassertieren wie Axolotln reagiert empfindlich auf Austrocknung, daher ist es wichtig, die Körperoberfläche zu bedecken, um Austrocknung zu verhindern und die Hautatmung (Haut) zu gewährleisten. Strecken Sie die Hintergliedmaße aus, um sie mit einer Ringzange zu bedienen. Verwende keine Desinfektionsmittel wie Ethanol, da Axolotl-Haut empfindlich auf Chemikalien reagiert und leicht gereizt werden kann. Verwenden Sie stattdessen 0,7x PBS (A-PBS) mit 50 U/mL Penicillin und 20 μg/mL Streptomycin zur Reinigung der Gliedmaße und später zur Knochenspülung beim Sägen.HINWEIS: Die Infektion ist im Allgemeinen kein Problem für die Operationen, die an Axolotln durchgeführt werden. Aufgrund des aquatischen Charakters dieser Tiere und der auf der Hautoberfläche platzierten Nähte empfehlen wir jedoch den Einsatz von Antibiotika, um eine Kontamination der Operationsstelle zu verhindern. 2. Chirurgie HINWEIS: Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente. Hierfür eignen sich gängige Sterilisationsmethoden wie Hitzesterilisation, Autoklavieren und Waschen in 70%igem Ethanol mit anschließender gründlicher Entfernung der Alkoholreste. Wenn Sie an mehreren Tieren arbeiten, sterilisieren Sie die Werkzeuge zwischendurch mit einem Heißperlensterilisator oder 70 % Ethanol. Machen Sie einen seitlichen Längsschnitt (1,5-2 cm) mit einem Skalpell über dem Oberschenkelknochen, der den gesamten Oberschenkel in der oberen hinteren Extremität überspannt. Um dies zu tun, tasten Sie den Knochen ab, bevor Sie die Haut schneiden. Verschieben Sie die Muskeln und Nerven vorsichtig von der Operationsstelle, ohne zu schneiden. Verwenden Sie eine gebogene Pinzette, um dies effizient zu tun. Legen Sie vorsichtig eine gebogene Pinzette unter den Oberschenkelknochen, um ihn für die Operation freizulegen. Legen Sie eine starre 7,75 mm 4-Loch-Fixatorplatte zusammen mit der Femurdiaphyse, vermeiden Sie es, die Gelenke zu berühren, und befestigen Sie sie mit einer Pinzette in der ausgerichteten Position. Verwenden Sie vier 2 mm Titanschrauben, um den Knochen an der Platte zu befestigen.HINWEIS: Die in diesem Protokoll verwendeten Schrauben haben ein komplexes Design und bestehen aus 4 Teilen: dem Hauptteil (wird in den Knochen eingeschraubt), dem Schraubenkopf (ermöglicht das Entfernen der Schrauben und der Platte mit dem quadratischen Ringschlüssel), dem schmaleren Hals (wird als Bruchstelle verwendet, sobald die Schraube im Knochen festgezogen ist) und einem Schraubengriff (wird zur Befestigung am Schraubendreher und der Sägeführungsvorrichtung verwendet). Die Reihenfolge der Schraubbefestigung ist wichtig. Beginnen Sie zuerst mit den inneren Schrauben und dann mit den beiden äußeren Schrauben, um sicherzustellen, dass die Platte mit der Knochenachse ausgerichtet ist. Verwenden Sie einen manuellen Bohrer, um das erste Loch in den Knochen zu bohren, um die Schraube leicht einsetzen zu können, gefolgt von der 1. Schraubenplatzierung . Bohren Sie in der Mitte des Knochenumfangs, um auf einer Seite dünneren Knochen zu vermeiden, der zu einem spontanen Knochenbruch führen kann. Verwenden Sie während des Bohrens eine Bewässerung mit 0,7x PBS + 1 % Stift/Streptokokken. Brechen Sie den Griff der 1. (optional: 1. und 2.) Schraube(n) nicht ab. Setzen Sie die Sägeführungsvorrichtung auf die 1. (optional : 1. und 2. ) Schraube(n) auf und richten Sie sie mit Knochen und Platte aus.HINWEIS: In diesem Protokoll werden eine Platte, Schrauben, eine Sägeführungsvorrichtung und eine Säge vom selben Hersteller bereitgestellt und so optimiert, dass sie zueinander passen. Die Sägeführungsvorrichtung kann in verschiedenen Größen erhältlich sein, um mit verschiedenen Platten und Sägegrößen kompatibel zu sein. Verwenden Sie die Sägeführungsvorrichtung, um die restlichen Schrauben zu bohren und einzusetzen. Stellen Sie sicher, dass die Platte mit dem Knochen ausgerichtet ist. Brechen Sie die Griffe der Schrauben ab. Legen Sie ein Stück Kunststofffolie (6-7 mm x 4-5 cm), das durch Abwischen mit 70 % Ethanol sterilisiert und dann autoklaviert oder hitzesterilisiert (140 °C für 4 Stunden) unter den Oberschenkelknochen, um Schäden am Weichgewebe während des Osteotomieprozesses zu vermeiden.HINWEIS: Zu diesem Zweck kann ein Stück Plastikfolie, abgeschnitten ein Beutel für die Wärmesterilisation verwendet werden. Gigly Drahtsäge zwischen Knochen und Schutzfolie platzieren. Schneiden Sie den Knochen mit der 0,66 mm Gigly-Drahtsäge und erzeugen Sie einen einzigen Schnitt von 0,7 mm im Oberschenkelknochen. Verwenden Sie während des Sägens eine konstante Spülung mit 0,7x PBS + 1% Stift/Streptokokken, um Gewebeschäden und Reibung zu minimieren. Entfernen Sie die Säge, die Sägeführung und brechen Sie mit einem Schraubendreher die Schraubengriffe von den Schrauben ab. Entfernen Sie die Schutzfolie und spülen Sie die Operationsstelle mit 0,7x PBS + 1% Pen/Streptokokken. Bedecken Sie die Oberseite der Platte und der Schrauben mit sterilem Knochenbienenwachs, um Haut und Muskeln vor Reizungen durch die Ränder der Schrauben zu schützen. Lege Muskeln und Haut auf das Knochenbienenwachs. Verschließen Sie die Schnittstelle mit einer synthetischen Naht 7.0 (Polypropylen/Polyethylen) mit einfachen unterbrochenen Nähten. Synthetisches Nahtmaterial wird verwendet, um die Kontamination mit wassergetragenen Bakterien und Pilzen zu minimieren. 3. Postoperatives Management Um das Tier wieder zu wecken, setzen Sie es in ein Becken mit frischem künstlichem Teichwasser, ergänzt mit 50 U/ml Penicillin, 20 μg/ml Streptomycin und analgetischem Butorphanol (0,5 mg/l Wasser). Beobachten Sie, wie das Tier beginnt, Kiemen zu bewegen, Schritte zu machen und zu schwimmen – normalerweise innerhalb von 1 Stunde nach der Operation. Halten Sie das Tier 3 Tage lang in künstlichem Teichwasser mit 50 U/ml Penicillin und 20 μg/ml Streptomycin, bevor Sie es in den Fäkalientank zurückbringen. Um eine Analgesie zu gewährleisten, fügen Sie Butorphanol (0,5 mg/L Wasser) hinzu. Stellen Sie sicher, dass die Nähte an Ort und Stelle bleiben und eine ordnungsgemäße Wundheilung erfolgt.

Representative Results

Der hier beschriebene chirurgische Eingriff (Abbildung 1) dauert zwischen 20 min und 30 min und erfordert einen Chirurgen und eine Assistentin. Optional können Sie ein binokulares Dissektionsmikroskop oder ein Lupensystem verwenden. Abbildung 1: Schematische Darstell…

Discussion

Die derzeit beschriebene Methode der Femurplattenfixation und Osteotomie ermöglicht die Anwendung bei Wassertieren, wie z.B. Ambystoma mexicanum (Axolotl). Diese chirurgische Methode wurde kürzlich verwendet, um die Frakturheilung und Regeneration der Gliedmaßen bei Axolotln mit der Frakturheilung bei Mäusenzu vergleichen 9. Wie bei Mäusen kann eine 4-Loch-Fixatorplatte mit selbstbrechenden Schrauben am Knochen befestigt werden, und mit einer Gigly-S…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken Sabine Stumpp für die hervorragende technische Unterstützung und Lidia Grösser für die Unterstützung bei den Operationen. Diese Forschung wurde gefördert durch den österreichischen Wissenschaftsfonds [Hertha Firnberg Fellowship Nummer T-1219], ERC [Advanced Grant, 742046 RegGeneMems], DFG [SFB 1444].

Materials

0.66 mm Gigly wire saw  RISystem RIS.590.120
7.0 Optilene suture  Braun C3090538
Benzocaine  Sigma-Aldrich E1501 dilute to 0.03%  prior to using
Butorphanol (Butomidor 10 mg/mL) Richter Pharma AG dilute to 0.5 mg/L  prior to using
Drill bit 0.30 mm RISystem RIS.590.200
Dumont #5 Forceps – Standard/Inox Fine Science Tools 11251-20
Hand drill RISystem RIS.390.130 better to have at least 3 pieces
Micro CT data analyzer Bruker, Billerica, MA, USA SkyScan NRecon software
Micro CT specimen scanner Bruker, Billerica, MA, USA SkyScan 1172 
Moria MC31b Iris forceps – smooth, curved, 10 cm Fine Science Tools 11373-12FST 2 pieces
MouseFix Drill-&Saw guide 1.75 mm, rigid RISystem RIS.301.102
MouseFix plate 4 hole, rigid RISystem RIS.401.110
MouseFix screw, L =2.00 mm RISystem RIS.401.100 need 4 per bone
Narrow Pattern Forceps VWR FSCI11002-12
penicillin/streptomycin Gibco 15140-122
Ring forceps Fine Science Tools 11103-09
scalpel #15 B Braun, Thermo Fischer Scientific 5518032
Square box wrench 0.50 mm RISystem RIS.590.111
Sterile bone wax, 2.5 g Ethicon, Johnson & Johnson W810
Student Fine Scissors – Straight/11.5cm Fine Science Tools 91460-11

Referenzen

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Polikarpova, A., Bucher, C., Ellinghaus, A., Okulski, H., Duda, G., Schmidt-Bleek, K., Tanaka, E. M. Stabilizing a Femur Osteotomy with a Plate Fixation in Ambystoma mexicanum. J. Vis. Exp. (206), e66648, doi:10.3791/66648 (2024).

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