Bauchspeicheldrüsenkrebs ist nach wie vor eine der am schwierigsten zu behandelnden Krebsarten. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, dass präklinische Modelle zur Bewertung der Wirksamkeit der Behandlung reproduzierbar und klinisch relevant sind. Dieses Protokoll beschreibt ein einfaches Co-Kulturverfahren zur Erzeugung reproduzierbarer, klinisch relevanter desmoplastischer Sphäroide.
Das duktale Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse (PDAC) ist mit einer 5-Jahres-Überlebensrate von <12 % eine der tödlichsten Krebsarten. Das größte Hindernis für die Therapie ist die dichte desmoplastische extrazelluläre Matrix (EZM), die den Tumor umgibt und die Vaskularisation reduziert, die allgemein als Desmoplasie bezeichnet wird. Eine Vielzahl von Medikamentenkombinationen und -formulierungen wurde getestet, um den Krebs zu behandeln, und obwohl viele von ihnen präklinisch Erfolg zeigen, versagen sie klinisch. Daher ist es wichtig, ein klinisch relevantes Modell zur Verfügung zu haben, das das Ansprechen des Tumors auf die Therapie vorhersagen kann. Dieses Modell wurde bereits gegen resezierte klinische Tumoren validiert. Hier wird ein einfaches Protokoll zur Züchtung von desmoplastischen dreidimensionalen (3D)-Cokultur-Sphäroiden beschrieben, die auf natürliche Weise eine robuste EZM erzeugen können und keine externen Matrixquellen oder Gerüste benötigen, um ihr Wachstum zu unterstützen.
Kurz gesagt werden humane Pankreas-Sternzellen (HPaSteC) und PANC-1-Zellen verwendet, um eine Suspension herzustellen, die die Zellen im Verhältnis 1:2 enthält. Die Zellen sind mit einer poly-HEMA-beschichteten, 96-Well-U-Well-Platte mit geringer Bindung beschichtet. Die Platte wird zentrifugiert, damit die Zellen ein erstes Pellet bilden können. Die Platte wird im Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO2 gelagert und das Medium wird alle 3 Tage gewechselt. Die Platten können in bestimmten Intervallen abgebildet werden, um das Sphäroidvolumen zu messen. Nach 14-tägiger Kultivierung werden reife desmoplastische Sphäroide gebildet (d.h. ein durchschnittliches Volumen von 0,048 + 0,012mm3 (451 μm x 462,84 μm)) und können für die experimentelle Therapiebewertung verwendet werden. Zu den ausgereiften EZM-Komponenten gehören Kollagen-I, Hyaluronsäure, Fibronektin und Laminin.
Die schlechte Prognose von Bauchspeicheldrüsenkrebs ist mit einer Vielzahl von Gründen verbunden, darunter der Mangel an leicht nachweisbaren Biomarkern, die zu einer späten Erkennung führen. Ein weiterer Hauptgrund ist das dicke Stroma, das das Gewebe umgibt und zu einer verminderten Blutversorgung führt. Die Ablagerung großer Mengen an extrazellulärer Matrix (EZM), Zell-Zell-Interaktion, Endothelzellen, verschiedenen Immunzellen, Perizyten, proliferierenden Myofibroblasten und Fibroblastenpopulationen sowie das Vorhandensein nicht-neoplastischer Zellen (die zusammen die desmoplastische Reaktion bilden)1 bilden das dicke Stroma, das für die Chemo- und Strahlenresistenz von PDAC verantwortlich ist2. Krebs- und Stromazellen haben eine komplexe, dynamische und bidirektionale Wechselwirkung. Obwohl einige Elemente das Fortschreiten der Krankheit entweder abschwächen oder beschleunigen, sind die meisten Prozesse während der Entwicklung des Tumors adaptiv1. Dies bietet eine Umgebung, die reich an Wachstumsfaktoren, proangiogenen Faktoren, Proteasen und Adhäsionsmolekülen ist. Diese Faktoren fördern die Angiogenese, die Zellproliferation, die Metastasierung und die Invasion 3,4. Zusammen sind sie ein immun- und medikamentenprivilegierter Zufluchtsort für den Tumor, was zu einer Arzneimittelresistenz führt.
Die Desmoplasie ist ein komplexes Gemisch, das aus verschiedenen EZM-Proteinen, Immunzellen und Pankreas-Sternzellen (PSC) besteht. Zusammen bilden diese in der Regel ein Gerüst, auf dem die Zellen wachsen können. PSCs sind eine der größten Komponenten des Stromakompartiments5. Ihre Fähigkeit, Enzyme wie Matrix-Metalloproteasen (MMP), Gewebeinhibitoren von Matrix-Metalloproteasen (TIMP) und krebsassoziierte Fibroblasten (CAF)6 zu produzieren, deutet darauf hin, dass sie wahrscheinlich eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung der desmoplastischen Reaktion spielen werden. Die EZM, die krebsassoziierten Fibroblasten (CAF) und das Gefäßsystem sind die zentralen Aspekte der PDAC. Bei den CAFs wird spekuliert, dass Myofibroblasten und inflammatorische CAFs an einer aktiven Wechselwirkung beteiligt sind, die für die pro-tumoralen Eigenschaften verantwortlich ist7. Je ausgedehnter die fibroblastischen Formationen am Tumor sind, desto schlechter ist die Prognose 8,9,10.
Die Monolayer-Zellkultur durch etablierte Zelllinien ist nach wie vor ein nützliches Werkzeug für die Analyse der Toxizität von Arzneimitteln und ein guter Ausgangspunkt für Proof-of-Concept- und Discovery-Studien. Etablierten Zellkulturlinien fehlt es jedoch an Keimbahn-DNA und klinischer Zuordenbarkeit11. Da sie auf ebenen Flächen gezüchtet werden, durchlaufen sie in vitro andere Selektionskriterien als wenn sie Teil des Tumors sind, teilen sich abnormal und verlieren ihren differenzierten Phänotyp12. Insgesamt begrenzen Einzelzellkulturen die Heterogenität des Tumors und verlieren daher an klinischer Relevanz. Sie sind nicht in der Lage, die Komplexität der Mikroumgebung des Tumors (z.B. der EZM) genau darzustellen. Die 3D-Kultur kann die komplexe Mikroumgebung des Tumors besser nachbilden.
Die 3D-Kultur wurde in den 1970er Jahren für gesunde Zellen und ihre neoplastischen Gegenstücke eingeführt13. Verschiedene Techniken wurden verwendet, um die Morphologie und Architektur von malignen Geweben durch Sphäroidezu untersuchen 14. Co-Kulturen mit Stromazellen können TME-Signale modellieren. Eine Hochregulation der EMT-Marker wurde beobachtet, wenn Zellen mit Sternzellen co-kultiviert wurden15. PDAC-Sphäroide und ihre Wechselwirkung mit dem Stroma können durch Co-Kultivierung mit ECM-Komponenten modelliert werden. Es wurde berichtet, dass die Co-Kultivierung speziell mit PSCs klinisch relevante Daten zur Zytotoxizität von Arzneimitteln liefert 16,17,18. PSCs unterstützen auch die Arzneimittelresistenz, indem sie die Apoptose umgehen und die Proliferation von Krebszellen durch verschiedene parakrine Faktorenstimulieren 19 und indem sie den EMT-Übergang induzieren. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, die PSCs von Anfang an in die Kriterien einzubeziehen, die zur Bewertung des Erfolgs eines Arzneimittels oder eines Arzneimittelverabreichungssystems herangezogen werden. Die Fähigkeit des PSC, die Proliferation zu verstärken und ein schnelleres Wachstum in Kombination zu unterstützen, im Vergleich zu Bauchspeicheldrüsenkrebszellen allein, wurde auch in vivo beobachtet, als subkutane Flankeninjektionen der beiden Zelllinien bei immungeschwächten Mäusen untersucht wurden20.
Die Fähigkeit eines Zelltyps, mit EZM-Komponenten zu interagieren, ist auch bei der Züchtung von co-kultivierten Sphäroiden von entscheidender Bedeutung. Es wurde berichtet, dass BxPC-3 und PANC-1 gleiche Affinitäten bei der Bindung an Kollagen aufweisen. Die beiden Zelllinien binden auch äquivalent an Laminin, obwohl es Berichte gibt, dass BxPC-3 besserbindet 21,22,23,24,25. In Bezug auf die Migration zeigten Stahle et al.26 eine 5x schnellere Motilität für PANC-1-Zellen im Vergleich zu BxPC-3. Es wurde auch berichtet, dass PANC-1-Zellen hauptsächlich als Einzelzellen migrieren, während BxPC-3-Zellen als dicht gepackte Folie migrieren. Die Wahl der Zellen wirkt sich auch auf die Größe des Tumorsaus 25. Es zeigte sich, dass BxPC-3-Tumoren größer waren27,28 als solche, die mit PANC-1 gewonnen wurden, während eine Studie den gegenteiligen Fall zeigte29. Trotz ihrer Unterschiede in Größe und Beweglichkeit wurde berichtet, dass beide Zellen lange Latenzzeiten benötigen, um bei Mäusen Tumore zu bilden. Diese Dauer kann bei BxPC-3 besonders lang sein und reicht von 4 Wochen bis 4 Monaten25. Es gibt jedoch auch Literatur, in der BxPC-328 oder BxPC-3 Krebsstammzellen30 schneller sichtbare Tumore gebildet haben, was darauf hindeutet, dass es zu Schwankungen in der Tumorwachstumsdauer kommen könnte. Die hier angegebenen Dauern sollten daher nur als erster Richtwert für die Tumorwachstumsraten dienen.
BxPC-3-Zellen bilden Sphäroide mit losen Zellen auf der Oberfläche und dichten Kernen, während PANC-1-Zellen sowohl poröse, aber robuste Sphäroide31 als auch kompakte Sphäroide bilden. Es wurde auch berichtet, dass PANC-1-Zellen weniger differenziert und aggressiver sind32. Unter Beibehaltung der aggressiven Natur32 im Vordergrund, kombiniert mit der höheren Motilität der PANC-1-Zellen, der Fähigkeit, kompakte Sphäroide zu bilden, und der Fähigkeit, mit EZM-Komponenten zu interagieren, wurden PANC-1-Zellen für Sphäroidstudien ausgewählt.
In den letzten Jahren hat die Sphäroidkultur große Erfolge erzielt, indem sie einen Vorteil in ihrer klinischen Relevanz im Vergleich zu zweidimensionalen (2D) Kulturen demonstriert hat. Ihre Relevanz wurde genutzt, um diese Technik als Ersatz für Tierversuche und zum besseren Verständnis der Biologie der Tumore einzusetzen. Die klinische Relevanz von Sphäroiden, insbesondere wenn sie mit PSCs co-kultiviert werden, hat ihre Verwendung zur Untersuchung verschiedener Funktionen des Sphäroids ermöglicht, wie z. B. Steifigkeit33, Expression von TGF-β34,35,36,37,38, E-Cadherin, F-Aktin 18,34,36,37, α-SMA 34,35,37,38, Laktatdehydrogenase (LDHA)32, HIF-1α35,39, Arzneimittelresistenz 16,37,40, Zellmigration41, Zellinvasion37, Fibrose35, Strahlenresistenz42, phänotypische Veränderungen18, Heterogenität36, zelluläre Interaktionsniveaus39 und Nachweis von EZM-Komponenten 37,38,39. Viele der Protokolle, die zur Gewinnung der beschriebenen Daten verwendet wurden, basieren auf Matrigel, der Hanging Drop-Methode, gedruckten Formen oder anderen Gerüsten, um das Wachstum von Sphäroiden und ECM zu unterstützen. Die Studien beinhalten in der Regel auch die Verwendung von nicht-menschlichen fibroblastischen Zellen oder frisch isolierten Sternzellen von Patienten. Während die Verwendung von Sternzellen entscheidend ist, damit die Tumoren In-vivo-Bedingungen ähneln, erschwert die Variabilität zwischen den Patienten, die mit frischen Extraktionen verbunden ist, die Replikation dieser Studien.
Dieses Protokoll zielt darauf ab, ein Modell zu demonstrieren, das einfach zu entwickeln, reproduzierbar, klinisch relevant und frei von Gerüsten ist und sich dabei ausschließlich auf die Fähigkeiten der Kokulturen stützt, die EZM auf natürliche Weise zu erzeugen. Zu diesem Zweck wurde eine einfache Co-Kulturmethode gewählt, bei der eine Mischung aus PANC-1-Zellen (aufgrund ihrer natürlichen Tendenz, als Einzelzellen zu wandern) und humanen Pankreas-Sternzellen (HPaSteC) verwendet wird, da sie sich wie Stammzellen verhalten und hochgradig resistent sind. Unter Verwendung der Studien von Durymanov et al.38als Grundlage wurde das unten beschriebene Protokoll erstellt, nachdem Parameter wie Zellverhältnisse und die Dauer zwischen den Medienwechseln weiter optimiert wurden. Die aus diesem Protokoll resultierenden Sphäroide können als Modellsystem für die Evaluierung neuer Wirkstoffkandidaten verwendet werden40.
Darüber hinaus kann für Benutzer, die mit der Sphäroidkultur nicht vertraut sind, die Arbeit von Peirsman et al.43hilfreich sein, in der die Entwicklung der MISpheroID-Wissensdatenbank diskutiert wird. Es legt einige Mindestinformationsrichtlinien fest, die helfen könnten, mit der Heterogenität zwischen Laborprotokollen umzugehen. Wenn auch mit einigen Einschränkungen, zeigte die Arbeit, dass die Wahl des Kulturmediums, der Zelllinien, der Methode zur Sphäroidbildung und der endgültigen Sphäroidgröße entscheidend für die Bestimmung der phänotypischen Eigenschaften von Sphäroiden ist.
Die Dauer und die Zellverhältnisse, die für das Wachstum der Sphäroide gewählt wurden, basierten auf Studien, wie zuvor berichtet38. Bei dem Versuch, diese Studien durch Substitution von HPaSteC-Zellen durch NIH3T3-Zellen zu optimieren, wurde festgestellt, dass die Sphäroidvolumina und Apoptosemuster den berichteten optimierten Parametern (berichtet für PANC-1: NIH3T3:: 120:12) sehr ähnlich waren, wenn die PANC-1: HPaSteC-Verhältnisse bei 120:60 lagen. Obw…
The authors have nothing to disclose.
Die beschriebene Arbeit wurde vom South Dakota Governors’ Office of Economic Development, dem South Dakota Board of Regents Competitive Research Grant Program (SD-BOR-CRGP) und dem Department of Pharmaceutical Sciences der South Dakota State University für ihre Unterstützung unterstützt.
Axio Observer inverted microscope | Carl Zeiss | 0450-354 | |
Cellometer Auto T4 | Nexcelom Bioscience LLC | Auto-T4 | |
DMEM, powder, high glucose | Gibco | 12100046 | |
Donkey anti-sheep conjugated with Alexa Fluor 568 | Abcam | ab175712 | |
Fetal Bovine Serum | Cytiva | SH3091003HI | |
Goat antirabbit IgG labeled with Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150077 | |
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14175145 | |
Human Pancreatic Stellate Cells (HPaSteC) | ScienCell | 3830 | |
Microscope Nikon | Nikon | Eclipse Ts 100 | |
Nunc 96-Well Polystyrene Round Bottom Microwell Plates | Thermo Scientific | 12-565-331 | |
Olympus Fluoview FV1200 confocal laser | Olympus | N/A | Discontinued product |
PANC-1 | ATCC | CRL-1469 | |
Poly-HEMA | Sigma | P3932 | |
Rabbit polyclonal anti-laminin antibodies | Abcam | ab11575 | |
Rabbit polyclonal anti-type I collagen antibodies | Abcam | ab34710 | |
Sheep polyclonal anti-hyaluronic acid antibodies | Abcam | ab53842 | |
Stellate cell media complete kit | ScienCell | 5301 | |
Trypsin | MP Biomedicals, LLC | 153571 | Trypsin solution prepared according to manufacturers protocol and used at 0.25%w/v |
Trypsin Neutralization Solution (TNS) | ScienCell | 103 |