Summary

Nachweis der CD40-Protein-Umbelliferon-Wechselwirkung mittels dynamischer Differenzialfluoreszenz

Published: March 01, 2024
doi:

Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine einzigartige Methode zum Nachweis der Bindung zwischen Verbindungen und Proteinmolekülen, die die Vorteile eines minimalen Proteinprobenverlusts und einer hohen Datengenauigkeit bietet.

Abstract

Die Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Molekülen ist ein entscheidender Aspekt für das Verständnis der Krankheitspathogenese und das Screening auf Wirkstoffziele. Umbelliferon, ein Wirkstoff der tibetischen Medizin Vicatia thibetica, zeigt eine immunmodulatorische Wirkung mit einem unbekannten Mechanismus. Das CD40-Protein ist ein wichtiges Ziel bei der Immunantwort. Daher wird in dieser Studie das Prinzip der dynamischen Differenzialfluoreszenztechnologie verwendet, um die Wechselwirkungen zwischen dem CD40-Protein und Umbelliferon unter Verwendung von fluoreszierenden Enzymmarkern zu analysieren. Zunächst wurde die Stabilität des Proteins fluoreszierender orangefarbener Farbstoff experimentell verifiziert und das optimale Verdünnungsverhältnis von 1:500 bestimmt. In der Folge wurde beobachtet, dass der Temperaturschmelzwert (Tm) des CD40-Proteins mit zunehmender Konzentration tendenziell abnahm. Interessanterweise wurde festgestellt, dass die Wechselwirkung zwischen CD40-Protein und Umbelliferon die thermische Stabilität des CD40-Proteins verbessert. Diese Studie stellt den ersten Versuch dar, das Bindungspotenzial von niedermolekularen Verbindungen und Proteinen mit Hilfe von Fluoreszenz-Mikrotiterplatten und Fluoreszenzfarbstoffen nachzuweisen. Die Technik zeichnet sich durch eine hohe Sensitivität und Genauigkeit aus und verspricht Fortschritte in den Bereichen Proteinstabilität, Proteinstruktur und Protein-Liganden-Wechselwirkungen, wodurch weitere Forschungen und Explorationen erleichtert werden.

Introduction

Vicatia thibetica H. Boissieu, eine Pflanze aus der Familie der Doldenblütler, wird häufig in der tibetischen Medizin verwendet und stellt einen der wesentlichen Bestandteile der fünf Grundbestandteile dar (Polygonatum sibiricum Delar. ex Redoute, Asparagus cochinchinensis (Lour.) Merr, Vicatia thibetica H. Boissieu, Oxybaphus himalaicus Edgew., und Gymnadenia conopsea (L.) R. Br.) 1. Hauptsächlich im Südwesten Chinas, wie im Nordwesten von Yunnan, im Westen von Sichuan, in Tibet und anderen Gebieten verbreitet, dient seine getrocknete Wurzel als lokaler Ersatz für Angelica1. Die Wurzel, die für ihren Duft bekannt ist, wird oft als Eintopfgewürz verwendet, und die Blätter, die als tibetischer Sellerie bezeichnet werden, tragen zu köstlichen Gerichten bei. So hat Vicatia thibetica nicht nur als einzigartige Heilpflanze, sondern auch als Nahrungsquelle in Tibet eine Bedeutung.

Sowohl nationale als auch internationale Forschungen zeigen, dass Vicatia thibetica blutauffüllende und qi (Kraft oder Energie)-belebende Eigenschaften besitzt, die für die Regulierung der Menstruation von Vorteil sind. Es wird eingesetzt, um Symptome von unregelmäßiger menstrueller Dysmenorrhoe zu behandeln, die durch Herzklopfen und Blutmangel verursacht werden, und zeigt pharmakologische Wirkungen wie die antioxidative Regulierung der Immunität des Körpers2. Der Alkoholextrakt von Vicatia thibetica hat die Fähigkeit gezeigt, die Körpermasse und den Organindex bei immungeschwächten Mäusen, die durch Cyclophosphamid induziert wurden, wiederherzustellen. Darüber hinaus erhöht es die Aktivität der Superoxiddismutase im Serum und reduziert den Gehalt an Malondialdehyd, was auf eine Verbesserung der antioxidativen Kapazität und eine ausgleichende Wirkung auf die Lipidperoxidation hindeutet 2,3. Gleichzeitig erhöht es die Anzahl der Blutzellen und des Hämoglobins, was nicht nur objektiv die blutbildende Funktion des Körpers widerspiegelt, sondern auch eine entscheidende Rolle für das Immunsystem spielt 2,3.

Doldenblütleron, das sich durch nadelförmige Kristalle und einen bitteren Geschmack auszeichnet, besitzt ein geringes Molekulargewicht, ist flüchtig und kann mit Wasserdampf destilliert werden. Es sublimiert leicht, hat eine geringe Löslichkeit in Wasser und eine hohe Löslichkeit in organischem Material. Als einer der Hauptbestandteile von Vicatia thibetica zeigt Umbelliferon immunmodulatorische Wirkungen auf die zelluläre Immunität, die humorale Immunität und die unspezifische Immunität in Hydrocortison-induzierten Immunsuppressions-Mausmodellen 4,5.

Das Zelloberflächenmolekül CD40, ein Mitglied der Tumornekrosefaktor-Rezeptor-Superfamilie, wird in Immunzellen weit verbreitetexprimiert 6. Sein homologer Ligand CD154, auch bekannt als CD40L, ist ein Typ-II-Transmembranprotein, das von aktivierten T-Lymphozyten exprimiert wird. Die CD40-Aktivierung hat die Fähigkeit, die Expression von co-stimulatorischen Molekülen auf der Oberfläche von dendritischen Zellen (DC) und Monozyten hochzuregulieren. Dieser Prozess fördert die Antigenpräsentationsfunktion von Molekülen des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) und aktiviert CD8+ T-Zellen weiter7.

Makrophagen spielen eine entscheidende Rolle bei der Bildung und Regulation der Tumormikroumgebung, und die CD40-Aktivierung kann den Umbau der Tumormikroumgebung durch Makrophagen fördern8. Die Aktivierung des CD40-Signals beeinflusst maßgeblich die Proliferation und Aktivierung von B-Zellen. B-Zellen können, wenn sie durch CD40 aktiviert werden, als wirksame Antigen-präsentierende Zellen fungieren. Sie präsentieren Antigene, erzeugen die Aktivität von Effektor-T-Zellen und tragen dadurch zur Anti-Tumor-Wirkung bei9. Darüber hinaus kann die CD40-Aktivierung in Tumorzellen die Apoptose induzieren und das Tumorwachstum hemmen10. CD40 transduziert in erster Linie Signale, indem es die Aktivität von Nicht-Rezeptor-Tyrosinproteinkinasen kontrolliert, darunter Lyn, Fyn, Syk und andere. Darüber hinaus hat es die Fähigkeit, die Proteine Bcl-xL, Cdk4 und Cdk6 zu stimulieren, Rel/NF-kB-Transkriptionsfaktoren zu aktivieren und CG-2 und PI3K10 zu phosphorylieren.

Die Methode der dynamischen Differenzialfluoreszenz (DSF) wird häufig eingesetzt, um den Einfluss verschiedener Umgebungsbedingungen, wie z. B. Pufferzusammensetzung, Temperatur und niedermolekulare Liganden, auf die thermische Stabilität von Proteinstrukturen zu bewerten. Der häufig verwendete Farbstoff für DSF ist ein orangefarbener, umweltsensibler, hydrophober Farbstoff. Unter normalen Bedingungen ist die Proteinstruktur gefaltet und verbirgt ihr hydrophobes Segment im Inneren. Mit steigender Temperatur wird der hydrophobe Bereich des Proteins stärker exponiert, was zu einem allmählichen Abbau der natürlichen Proteinstruktur führt. Der Farbstoff bindet selektiv an diesen exponierten Proteinteil und verstärkt dessen Fluoreszenz. Tm-Werte werden dann berechnet, indem Änderungen in der Fluoreszenzsignaldetektion11 überwacht werden. Bis zu einem gewissen Grad können Schwankungen der Tm-Werte Verschiebungen in der Proteinstabilität aufgrund von Mutationen, Änderungen der Puffer oder der Ligandenbindung messen. Darüber hinaus kann es auf strukturelle Veränderungen während des Proteinfaltungsprozesses hinweisen12. Dieser Ansatz bietet präzise Daten, einen breiten Temperaturbereich, eine hohe Sensitivität und minimalen Proteinverlust13.

In dieser Studie wurde die Fluoreszenzbestimmung mit einem fluoreszierenden Mikroplatten-Reader anstelle eines Fluoreszenz-PCR-Geräts (Quantitative Polymerase-Kettenreaktion) durchgeführt. Diese Modifikation ermöglicht den DSF-Nachweis in Laboren, in denen kein fluoreszierendes quantitatives PCR-Instrument vorhanden ist, wodurch die Methode weniger komplex wird und die erforderlichen Schritte für die Einrichtung des Instruments reduziert werden, wodurch der experimentelle Prozess vereinfacht wird. Dieser Ansatz hat jedoch gewisse Nachteile. Während die Komplexität reduziert wird, wird das Verfahren umständlicher. Eine manuelle Fluoreszenzdetektion bei unterschiedlichen Temperaturen ist erforderlich, und eine automatische und kontinuierliche Erfassung der Fluoreszenz aus dem System kann nicht erreicht werden. Daher wurde in dieser Studie die DSF-Technik verwendet, um die Interaktion zwischen CD40-Protein und Umbelliferon zu untersuchen und neue Einblicke in die molekularen Mechanismen der tibetischen Medizin zu liefern.

Protocol

Die Verbindungslösung, die Proteinlösung und der Farbstoff wurden in eine PBS-Lösung eingeführt. Anschließend wurden die Proben mit einem digitalen Heiz-Schüttel-Trockenbad allmählich erhitzt, und die thermische Stabilität der Proteine wurde durch Messung der Änderung der Fluoreszenzintensität innerhalb des komplexen Systems bewertet. Die detaillierten Schritte sind im Folgenden beschrieben, und Abbildung 1 veranschaulicht einen Überblick über das Protokoll. <p class="jove_ti…

Representative Results

Der orangefarbene Farbstoff zeigte sowohl bei Raumtemperatur als auch bei erhöhten Temperaturen eine stabile Fluoreszenzanregung bei Ex = 470 nm und Em = 570 nm. Es wurde ein optimales Verdünnungsverhältnis von 1:500 ermittelt (Abbildung 2A,B). Die Detektion des Tm-Wertes erwies sich als schwierig, wenn die Konzentration des CD40-Proteins unter 15 μg/ml lag (Abbildung 3A,B). Bei einer Konzentration von 15 μg/ml war jedoch …

Discussion

DSF, auch bekannt als thermischer Shift-Assay oder thermischer Fluoreszenz-Assay, ist eine Technik, die eingesetzt wird, um den Prozess der thermischen Denaturierung von Proteinen in Proben nachzuweisen, indem Änderungen des Fluoreszenzsignals der Testprobe oder des Farbstoffs während eines langsamen, programmierten Temperaturanstiegs überwacht werden. Ursprünglich von Pantoliano14 etabliert, dient DSF als Hochdurchsatzmethode. Das Hauptverfahren besteht darin, die Temperatur auf einer compute…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken herzlich für die finanzielle Unterstützung, die wir aus dem Connotation-Bauprojekt des 14. Fünfjahresplans der Universität für tibetische Medizin (2022ZYYGH12), den offenen Fächern des Schlüssellabors für tibetische Medizin und Grundbildung 2022 des Bildungsministeriums an der Universität für tibetische Medizin (ZYYJC-22-04), dem wichtigen Forschungs- und Entwicklungsprogramm von Ningxia (2023BEG02012) erhalten haben, und das Xinglin Scholar Research Promotion Project der Chengdu University of Traditional Chinese Medicine (XKTD2022013).

Materials

CD40 protein MedChemExpress HY-P75408
DMSO Boster Biological Technology Co., Ltd PYG0040
FlexStation 3 multifunctional microplate reader Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD FlexStation 3
OriginPro 8 software OriginLab Corporation v8.0724(B724)
Phosphate buffered saline (1x) Gibco 8120485
SoftMax Pro 7.1 Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD SoftMax Pro 7.1
SSYPRO orange dye Sigma S5942
Umbelliferone Shanghai Yuanye Biotechnology Co. B21854

Referenzen

  1. Cairang, N. Study on the standardization of clinical application of Tibetan medicine "five roots&#34. Guid J Trad Chin Med Pharm. 28 (11), 133136 (2022).
  2. Li, L., et al. Effects of Xigui extract on immunosuppressive mice induced by cyclophosphamide. Chin J Hosp Pharm. 37 (03), 244-247 (2017).
  3. Lu, H., et al. Effects of Vicatia thibertica de boiss on immunologic and hematopoietic function of mice. J Dali Univ. 2 (02), 6-10 (2017).
  4. Dong, S., Zhang, X., Hu, Y., Gong, X., Yang, H. Chemical constituents, quality control and pharmacology research progress of Xigui. Chin J Ethnomed Ethnopharm. 27 (13), 40-42 (2018).
  5. Lu, Z., Zhang, L. Effects of total flavone extract from Shuiqin (Oenanthe Javanica) on immune function of immunosuppression mice. Chin J Trad Med Sci Technol. 23 (04), 423-425 (2016).
  6. Vonderheide, R. H. CD40 agonist antibodies in cancer immunotherapy. Annu Rev Med. 71, 47-58 (2020).
  7. Grewal, I. S., Flavell, R. A. CD40 and CD154 in cell-mediated immunity. Annu Rev Immunol. 16, 111-135 (1998).
  8. Long, K. B., et al. IFNγ and CCL2 cooperate to redirect tumor-infiltrating monocytes to degrade fibrosis and enhance chemotherapy efficacy in pancreatic carcinoma. Cancer Discov. 6 (4), 400-413 (2016).
  9. He, Y., et al. The roles of regulatory B cells in cancer. J Immunol Res. 2014, 215471 (2014).
  10. Eliopoulos, A. G., et al. CD40 induces apoptosis in carcinoma cells through activation of cytotoxic ligands of the tumor necrosis factor superfamily. Mol Cell Biol. 20 (15), 5503-5515 (2000).
  11. Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability. Nat Protoc. 2 (9), 2212-2221 (2007).
  12. Rosa, N., et al. Meltdown: A Tool to help in the interpretation of thermal melt curves acquired by differential scanning fluorimetry. J Biomol Screen. 20 (7), 898-905 (2015).
  13. Hellman, L. M., et al. Differential scanning fluorimetry based assessments of the thermal and kinetic stability of peptide-MHC complexes. J Immunol Methods. 432, 95-101 (2016).
  14. Pantoliano, M. W., et al. High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery. J Biomol Screen. 6 (6), 429-440 (2001).
  15. Gorny, H., et al. Combining nano-differential scanning fluorimetry and microscale thermophoresis to investigate VDAC1 interaction with small molecules. J EnzymeInhib Med Chem. 38 (1), 2121821 (2023).
  16. Freire, E. Thermal denaturation methods in the study of protein folding. Methods Enzymol. 259, 144-168 (1995).
  17. Phiri, M. J., Mofokeng, J. P., Phiri, M. M., Mngomezulu, M., Tywabi-Ngeva, Z. Chemical, thermal and morphological properties of polybutylene succinate-waste pineapple leaf fibres composites. Heliyon. 9 (11), 21238 (2023).
  18. Zhou, C., Yu, M., Li, W. Comparation of three measuring methods for thermodynamic stability of protein. Anal Test Technol Instruments. 27 (04), 252-259 (2021).
  19. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2023).
  20. Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. J Ethnopharmacol. 293, 115278 (2022).
  21. Magnez, R., Bailly, C., Thuru, X. Microscale thermophoresis as a tool to study protein interactions and their implication in human diseases. Int J Mol Sci. 23 (14), 7672 (2022).
  22. Kamat, V., Rafique, A. Designing binding kinetic assay on the bio-layer interferometry (BLI) biosensor to characterize antibody-antigen interactions. Anal Biochem. 536, 16-31 (2017).
  23. Freyer, M. W., Lewis, E. A. Isothermal titration calorimetry: experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions. Methods Cell Biol. 84, 79-113 (2008).
  24. Sharma, R., et al. Atosiban and Rutin exhibit anti-mycobacterial activity – An integrated computational and biophysical insight toward drug repurposing strategy against Mycobacterium tuberculosis targeting its essential enzyme HemD. Int J Biol Macromol. 253, 127208 (2023).
  25. Grädler, U., et al. Biophysical and structural characterization of the impacts of MET phosphorylation on tepotinib binding. J Biol Chem. 299 (11), 105328 (2023).
  26. Xu, Y., et al. Differential scanning fluorimetry and its application in the study of protein. Chemistry of Life. 38 (03), 351-357 (2018).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Cairang, N., Zhang, Y., Jiang, H., Sonan, T., Wang, X. Detection of CD40 Protein-Umbelliferone Interaction via Differential Scanning Fluorescence. J. Vis. Exp. (205), e66610, doi:10.3791/66610 (2024).

View Video