Dieses Protokoll beschreibt eine robuste Methode zur Entwicklung eines Pellikel-Biofilms. Die Methode ist auf verschiedene Kulturvolumina skalierbar und ermöglicht eine einfache Anwendung für verschiedene experimentelle Ziele. Das Methodendesign ermöglicht eine qualitative oder quantitative Bewertung des biofilmbildenden Potenzials mehrerer Mykobakterienarten.
Viele Bakterien gedeihen in komplizierten natürlichen Gemeinschaften und weisen Schlüsselattribute der Vielzelligkeit wie Kommunikation, Kooperation und Wettbewerb auf. Die häufigste Manifestation des bakteriellen mehrzelligen Verhaltens ist die Bildung von Biofilmen, die oft mit Pathogenität verbunden sind. Biofilme bieten einen Zufluchtsort gegen antimikrobielle Wirkstoffe und begünstigen die Entstehung von Antibiotikaresistenzen. Die konventionelle Praxis der Kultivierung von Bakterien in Schüttelkolben-Flüssigkulturen repräsentiert nicht ihr richtiges physiologisches Wachstum in der Natur, was unser Verständnis ihrer komplizierten Dynamik einschränkt. Bemerkenswert ist, dass die metabolischen und transkriptionellen Profile von Bakterien, die sich in Biofilmen befinden, denen natürlich wachsender Zellen sehr ähnlich sind. Diese Parallelität unterstreicht die Bedeutung von Biofilmen als ideales Modell für die Grundlagen- und translationale Forschung. Dieser Artikel konzentriert sich auf die Verwendung von Mycobacterium smegmatis als Modellorganismus, um eine Technik zur Kultivierung von Pellikel-Biofilmen zu veranschaulichen. Der Ansatz ist an verschiedene Kulturvolumina anpassbar, was seine Implementierung für verschiedene experimentelle Ziele, wie z. B. antimikrobielle Studien, erleichtert. Darüber hinaus ermöglicht das Methodendesign die qualitative oder quantitative Bewertung der Biofilmbildungsfähigkeiten verschiedener Mykobakterienarten mit geringfügigen Anpassungen.
Bakterien sind in der Lage, als einzellige Einheiten zu überleben; Unter den meisten physiologisch relevanten Bedingungen organisieren sie sich jedoch in Gemeinschaftsmimetika. Biofilm ist eine weithin anerkannte Gemeinschaftsorganisation von Bakterien, die aus aggregierten Zellen bestehen, die in einer selbst produzierten Matrix eingeschlossen sind1. Eine solche Assemblierung besitzt Signaturen einer frühen Vielzelligkeit und bietet eine höhere Stressresistenz für bakterielle Systeme. Biofilme sind oft tolerant gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen und sind schätzungsweise für fast 80 % der mikrobiellen Infektionen verantwortlich 2,3.
Schüttelkolben und plattenbasierte Kulturen sind traditionell die üblichen Praktiken für die Bakterienkultivierung. Ihre enorme Akzeptanz und ihr Erfolg sind auf ihre einfache Handhabung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit zurückzuführen. Das Fehlen eines physiologischen Kontexts schränkt jedoch das translationale Potenzial des mit solchen Systemen generierten Wissens ein4. Daher werden Biofilme zu einem attraktiven Modellsystem für die Erforschung der bakteriellen Pathophysiologie. Biofilme stellen ein dynamisches Modellsystem dar, das die natürlichen Bedingungen genau widerspiegelt und es den Forschern ermöglicht, physiologische Aspekte wie Nährstoffgradienten und räumliche Heterogenität zu replizieren 5,6.
Der Biofilm-Lebensstil ist in mykobakteriellen Studien besonders relevant, da Mykobakterien, einschließlich des berüchtigten Mycobacterium tuberculosis, geschickte Biofilmbildner sind7. Ihre Fähigkeit, in Biofilmen zu gedeihen, trägt dazu bei, dass sie während einer Infektion im Wirtsgewebe bestehen bleiben. Angesichts der inhärenten Antibiotikaresistenz, die mit dem Lebensstil von Biofilmen verbunden ist, stellt es eine große Herausforderung bei der Behandlung von mykobakteriellen Erkrankungendar 8. Biofilme stellen auch ein ideales Modellsystem für die Untersuchung des mykobakteriellen Stoffwechsels dar, da sie die Untersuchung der einzigartigen metabolischen Anpassungen und Nährstoffverwertungsstrategien ermöglichen, die von Mykobakterien in komplexen mikrobiellen Gemeinschaften eingesetzt werden9.
Während Biofilm zunehmend als besseres Modellsystem für mykobakterielle Studien akzeptiert wird10, besteht ein Bedarf an konsistenten und reproduzierbaren Standardarbeitsanweisungen, insbesondere um Parallelen zwischen Studien zu ziehen, die in verschiedenen Laboratorien durchgeführt wurden. Die hier beschriebene Methode beschreibt die Verfahren zur Biofilmbildung für eine Mykobakterienart, M. smegmatis. M. smegmatis ist ein leichter zugängliches Modell für die Untersuchung mykobakterieller Biofilme, da es nicht pathogen ist und die Kinetik der Biofilmbildung schneller ist. Die Methode kann modifiziert werden, um Anwendungen wie Antimykobakterien-Screening, Metabolitenextraktion und Omics-Studien zu ermöglichen.
Die mehrzellige Lebensweise von Mikroben wurde vor fast einem Jahrhundert beschrieben; Klinische Studien sind jedoch nach wie vor spärlich, was vor allem auf den Mangel an robusten Methodenzurückzuführen ist 14. Methoden, die in Arbeiten zur Biofilmbiologie beschrieben werden, sind oft schwer zu adaptieren. Hier wird erwartet, dass die detaillierte Methodik, unterstützt durch die Demonstration kritischer Schritte, die Reproduzierbarkeit der Protokolle verbesse…
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde durch das DBT-Ramalingaswami Fellowship unterstützt, das an Amitesh Anand vergeben wurde.
0.2 µM PVDF syringe filter | Axiva | SFNY04 R | |
1 mL tips | Genetix | GXM-611000 C | |
10 µL tips | Genetix | GXM-6110 C | |
200 µL tips | Genetix | GXM-61200C | |
6-well polypropylene plates | Tarsons | 980010 | |
Amber tubes | Tarsons | 546051 | |
Autoclave | Hospharma | ||
Biosafety Cabinet A II | MSET | ||
Blotting paper | Any suitable vendor | ||
Centrifuge | Eppendorf | ||
Citric acid | Sigma | 251275 | |
Cuvettes | Bio-Rad | 2239955 | |
Ferric ammonium citrate | Sigma | F5879 | |
Gel documentation system | Bio-Rad | ||
Glass Beads | Sigma | G8772 | |
Glucose | Sigma | 49139 | |
Glycerol | Sigma | G5516 | |
Inoculation loops | Genaxy | HS81121C | |
L-Aspargine | Sigma | A0884 | |
LB-agar | Himedia | M1151 | |
LB-media | Himedia | M575 | |
M. smegmatis mc2155 cryo-stock | ATCC | 700084 | |
Magnesium sulfate | Sigma | M2643 | |
Micropipettes | Gilson | ||
Parafilm | Tarsons | ||
Petri Dish | Tarsons | 460020 | |
pH meter | Labman Scientific Instruments | ||
Plate Reader | Tecan | ||
Polypropylene test tubes | Genaxy | GEN-14100-PS | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5379 | |
Rifampicin | MedchemExpress | HY-B0272 | |
Serological pipette | SPL Life Sciences | 95210 | |
Shaker Incubator | Eppendorf | ||
Spatula | |||
Spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
Static Incubator | CARON | ||
Sterile 10 mL syringe | Becton Dickinson | 309642 | |
Sterile 50 mL syringe | Becton Dickinson | 309653 | |
Tween-80 | Sigma | P1754 | |
Weighing balance | Sartorius | ||
Zinc sulfate | Sigma | Z0251 |