Summary

Wachsender mykobakterieller Biofilm als Modell zur Untersuchung von Antibiotikaresistenzen

Published: July 12, 2024
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Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine robuste Methode zur Entwicklung eines Pellikel-Biofilms. Die Methode ist auf verschiedene Kulturvolumina skalierbar und ermöglicht eine einfache Anwendung für verschiedene experimentelle Ziele. Das Methodendesign ermöglicht eine qualitative oder quantitative Bewertung des biofilmbildenden Potenzials mehrerer Mykobakterienarten.

Abstract

Viele Bakterien gedeihen in komplizierten natürlichen Gemeinschaften und weisen Schlüsselattribute der Vielzelligkeit wie Kommunikation, Kooperation und Wettbewerb auf. Die häufigste Manifestation des bakteriellen mehrzelligen Verhaltens ist die Bildung von Biofilmen, die oft mit Pathogenität verbunden sind. Biofilme bieten einen Zufluchtsort gegen antimikrobielle Wirkstoffe und begünstigen die Entstehung von Antibiotikaresistenzen. Die konventionelle Praxis der Kultivierung von Bakterien in Schüttelkolben-Flüssigkulturen repräsentiert nicht ihr richtiges physiologisches Wachstum in der Natur, was unser Verständnis ihrer komplizierten Dynamik einschränkt. Bemerkenswert ist, dass die metabolischen und transkriptionellen Profile von Bakterien, die sich in Biofilmen befinden, denen natürlich wachsender Zellen sehr ähnlich sind. Diese Parallelität unterstreicht die Bedeutung von Biofilmen als ideales Modell für die Grundlagen- und translationale Forschung. Dieser Artikel konzentriert sich auf die Verwendung von Mycobacterium smegmatis als Modellorganismus, um eine Technik zur Kultivierung von Pellikel-Biofilmen zu veranschaulichen. Der Ansatz ist an verschiedene Kulturvolumina anpassbar, was seine Implementierung für verschiedene experimentelle Ziele, wie z. B. antimikrobielle Studien, erleichtert. Darüber hinaus ermöglicht das Methodendesign die qualitative oder quantitative Bewertung der Biofilmbildungsfähigkeiten verschiedener Mykobakterienarten mit geringfügigen Anpassungen.

Introduction

Bakterien sind in der Lage, als einzellige Einheiten zu überleben; Unter den meisten physiologisch relevanten Bedingungen organisieren sie sich jedoch in Gemeinschaftsmimetika. Biofilm ist eine weithin anerkannte Gemeinschaftsorganisation von Bakterien, die aus aggregierten Zellen bestehen, die in einer selbst produzierten Matrix eingeschlossen sind1. Eine solche Assemblierung besitzt Signaturen einer frühen Vielzelligkeit und bietet eine höhere Stressresistenz für bakterielle Systeme. Biofilme sind oft tolerant gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen und sind schätzungsweise für fast 80 % der mikrobiellen Infektionen verantwortlich 2,3.

Schüttelkolben und plattenbasierte Kulturen sind traditionell die üblichen Praktiken für die Bakterienkultivierung. Ihre enorme Akzeptanz und ihr Erfolg sind auf ihre einfache Handhabung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit zurückzuführen. Das Fehlen eines physiologischen Kontexts schränkt jedoch das translationale Potenzial des mit solchen Systemen generierten Wissens ein4. Daher werden Biofilme zu einem attraktiven Modellsystem für die Erforschung der bakteriellen Pathophysiologie. Biofilme stellen ein dynamisches Modellsystem dar, das die natürlichen Bedingungen genau widerspiegelt und es den Forschern ermöglicht, physiologische Aspekte wie Nährstoffgradienten und räumliche Heterogenität zu replizieren 5,6.

Der Biofilm-Lebensstil ist in mykobakteriellen Studien besonders relevant, da Mykobakterien, einschließlich des berüchtigten Mycobacterium tuberculosis, geschickte Biofilmbildner sind7. Ihre Fähigkeit, in Biofilmen zu gedeihen, trägt dazu bei, dass sie während einer Infektion im Wirtsgewebe bestehen bleiben. Angesichts der inhärenten Antibiotikaresistenz, die mit dem Lebensstil von Biofilmen verbunden ist, stellt es eine große Herausforderung bei der Behandlung von mykobakteriellen Erkrankungendar 8. Biofilme stellen auch ein ideales Modellsystem für die Untersuchung des mykobakteriellen Stoffwechsels dar, da sie die Untersuchung der einzigartigen metabolischen Anpassungen und Nährstoffverwertungsstrategien ermöglichen, die von Mykobakterien in komplexen mikrobiellen Gemeinschaften eingesetzt werden9.

Während Biofilm zunehmend als besseres Modellsystem für mykobakterielle Studien akzeptiert wird10, besteht ein Bedarf an konsistenten und reproduzierbaren Standardarbeitsanweisungen, insbesondere um Parallelen zwischen Studien zu ziehen, die in verschiedenen Laboratorien durchgeführt wurden. Die hier beschriebene Methode beschreibt die Verfahren zur Biofilmbildung für eine Mykobakterienart, M. smegmatis. M. smegmatis ist ein leichter zugängliches Modell für die Untersuchung mykobakterieller Biofilme, da es nicht pathogen ist und die Kinetik der Biofilmbildung schneller ist. Die Methode kann modifiziert werden, um Anwendungen wie Antimykobakterien-Screening, Metabolitenextraktion und Omics-Studien zu ermöglichen.

Protocol

Die Einzelheiten zu allen für die Studie verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt. 1. Die Medienvorbereitung von Sauton Bereiten Sie 50 ml 2,5%ige Kaliumdihydrogenphosphatlösung vor, indem Sie 1,25 g Kaliumdihydrogenphosphat sorgfältig abwiegen und in 50 ml deionisiertem Wasser auflösen. Bereiten Sie 50 ml 2,5%ige Magnesiumsulfatlösung vor, indem Sie 2,56 g Magnesiums…

Representative Results

Ab dem dritten Tag werden Biofilm-Pellikel mit bloßem Auge sichtbar. Obwohl der Biofilm auf dem Sauton-Medium ohne 2% Glukose wächst, wurde bei der Zugabe eine Verbesserung der Retikulation beobachtet. Wir erhielten 10,48 mg ± 3,13 mg (n = 4) Biofilm-Trockengewicht aus jeder Vertiefung einer 24-Well-Platte mit 1,5 ml Sauton-Medium (ergänzt mit 2 % Glukose), das vier Tage lang gezüchtet wurde. In Abbildung 2 war die Biofilmentwicklung von Tag 3 bis Tag 6…

Discussion

Die mehrzellige Lebensweise von Mikroben wurde vor fast einem Jahrhundert beschrieben; Klinische Studien sind jedoch nach wie vor spärlich, was vor allem auf den Mangel an robusten Methodenzurückzuführen ist 14. Methoden, die in Arbeiten zur Biofilmbiologie beschrieben werden, sind oft schwer zu adaptieren. Hier wird erwartet, dass die detaillierte Methodik, unterstützt durch die Demonstration kritischer Schritte, die Reproduzierbarkeit der Protokolle verbesse…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch das DBT-Ramalingaswami Fellowship unterstützt, das an Amitesh Anand vergeben wurde.

Materials

0.2 µM PVDF syringe filter Axiva SFNY04 R
1 mL tips Genetix GXM-611000 C
10 µL tips Genetix GXM-6110 C
200 µL tips Genetix GXM-61200C
6-well polypropylene plates Tarsons 980010
Amber tubes Tarsons 546051
Autoclave Hospharma
Biosafety Cabinet A II MSET
Blotting paper Any suitable vendor
Centrifuge Eppendorf
Citric acid Sigma 251275
Cuvettes Bio-Rad 2239955
Ferric ammonium citrate Sigma F5879
Gel documentation system Bio-Rad
Glass Beads Sigma G8772
Glucose Sigma 49139
Glycerol Sigma G5516
Inoculation loops Genaxy HS81121C
L-Aspargine Sigma A0884
LB-agar Himedia M1151
LB-media Himedia M575
M. smegmatis mc2155 cryo-stock ATCC 700084
Magnesium sulfate Sigma M2643
Micropipettes Gilson
Parafilm Tarsons
Petri Dish Tarsons 460020
pH meter Labman Scientific Instruments
Plate Reader Tecan
Polypropylene test tubes Genaxy GEN-14100-PS
Potassium phosphate monobasic Sigma P5379
Rifampicin MedchemExpress HY-B0272
Serological pipette SPL Life Sciences 95210
Shaker Incubator Eppendorf
Spatula
Spectrophotometer Thermo Scientific
Static Incubator CARON
Sterile 10 mL syringe Becton Dickinson 309642
Sterile 50 mL syringe Becton Dickinson 309653
Tween-80 Sigma P1754
Weighing balance Sartorius
Zinc sulfate Sigma Z0251

Referenzen

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Diesen Artikel zitieren
Poddar, K., Anand, A. Growing Mycobacterial Biofilm as a Model to Study Antimicrobial Resistance. J. Vis. Exp. (209), e66607, doi:10.3791/66607 (2024).

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