Wir stellen eine Methode zur Replikation der Mikroumgebung des Gliomtumors an der invasiven Front vor, die den interstitiellen Flüssigkeitsfluss einbezieht. Bei diesem Modell handelt es sich um ein Hyaluronan-Kollagen-I-Hydrogel in einem Gewebekultureinsatz, auf den ein Flüssigkeitsdruckkopf aufgebracht werden kann. Die Invasion kann quantifiziert werden, und Zellen können isoliert oder lysiert werden.
Das Wiederauftreten von Glioblastomen ist ein großes Hindernis für den Behandlungserfolg und wird durch die Invasion von Gliom-Stammzellen (GSCs) in gesundes Gewebe angetrieben, das für eine chirurgische Resektion nicht zugänglich ist und gegen bestehende Chemotherapien resistent ist. Die Flüssigkeitsbewegung auf Gewebeebene oder der interstitielle Flüssigkeitsfluss (IFF) reguliert die GSC-Invasion in Abhängigkeit von der Tumormikroumgebung (TME), was den Bedarf an Modellsystemen unterstreicht, die sowohl IFF als auch TME enthalten. Wir stellen eine zugängliche Methode zur Replikation der invasiven TME beim Glioblastom vor: ein Hyaluronan-Kollagen-I-Hydrogel, das aus humanen GSCs, Astrozyten und Mikroglia besteht, die in einem Gewebekultureinsatz ausgesät werden. Erhöhte IFF kann durch Anlegen eines Flüssigkeitsdruckkopfes an das Hydrogel dargestellt werden. Darüber hinaus kann dieses Modell so abgestimmt werden, dass es Unterschiede zwischen oder innerhalb des Patienten in zellulären Verhältnissen, Flussraten oder Matrixsteifigkeiten repliziert. Die Invasion kann quantifiziert werden, während Gele für eine Vielzahl von Ergebnissen entnommen werden können, einschließlich GSC-Invasion, Durchflusszytometrie, Protein- oder RNA-Extraktion oder Bildgebung.
Das Glioblastom ist eine verheerende Erkrankung, die durch eine kurze Überlebenszeitgekennzeichnet ist 1, die durch die klinisch verfügbaren Behandlungen nur moderat verlängert wird 2,3. Dieses Hindernis für eine wirksame Therapie ist weitgehend auf die hochgradig infiltrative Natur chemoresistenter Gliom-Stammzellen (GSCs) zurückzuführen, die für die Resektion und das Aussäen rezidivierender Tumoren unzugänglich sind4. Gleichzeitig sind GSCs hochplastisch und reagieren auf verschiedene Reize in der Tumormikroumgebung (TME), um zu überleben und einzudringen 5,6. Insbesondere erzeugen der dicht besiedelte Tumor und das undichte Gefäßsystem eine steile Druckdifferenz an der Tumorgrenze, die den interstitiellen Flüssigkeitsfluss (IFF) in bestimmten Regionen erhöht, die mit der GSC-Invasion korrelieren7. Diese erhöhte IFF beeinflusst 8,9,10 und verstärkt oft die 8,9 GSC-Invasion über molekulare Signalwege, die für eine pharmakologische Hemmung zugänglich sind. Dieser Prozess wird jedoch durch den Einfluss der Gliazellen in der TME auf die Gliominvasion verfälscht; In der Tat wurde beschrieben, dass Gliazellen die Gliominvasion in zahlreichen Zusammenhängen modulieren11, und vorläufige Beweise in unserem Labor deuten auf einen ähnlichen Einfluss von Gliazellen auf die IFF-verstärkte Gliominvasionhin 12. Aus diesem Grund hat unser Labor ein abstimmbares 3D-TME-Modell entwickelt, das diese invasiven Tumorgrenzregionen repliziert, indem es sowohl IFF- als auch Glia-GSC-Wechselwirkungen einbezieht, um die GSC-Invasion und andere Ergebnisse (d. h. Oberflächen- oder intrazelluläre Proteinexpression, RNA-Expression usw.) zu quantifizieren, die von IFF, Glia- und/oder Therapeutikakandidaten beeinflusst werden12 (Abbildung 1).
Das TME-Modell ähnelt anderen Gewebekultur-Insert-basierten interstitiellen Flüssigkeitsfluss-Assays (d. h. statische/Flow-Assays), die weithin veröffentlicht wurden 8,9,10,13,14,15,16,17,18. Die Hauptunterschiede dieses Modells sind die Einbeziehung einer nicht proprietären und abstimmbaren Kollagen-Hyaluronsäure-Matrix, die Einbeziehung von Astrozyten und Mikroglia in die Matrix in Verhältnissen, die für die TMEs des Patienten repräsentativsind 12, und das System ist vollständig in einer Well-Platte eingeschlossen, ohne externe Schläuche, Reservoire oder Pumpen. Hyaluronsäure gehört zu den Hauptbestandteilen der extrazellulären Matrix des Gehirns19, reicht jedoch nicht aus, um den Flüssigkeitsfluss zu ermöglichen; somit ist Kollagen I in der Mischung enthalten. Die Vernetzung erfolgt in zwei Schritten: einer durch freie Radikale initiierten Kettenwachstumspolymerisation, bei der bei Einwirkung von ultraviolettem (UV) Licht freie Radikale aus dem Photoinitiator erzeugt werden und chemische Vernetzungen zwischen methacrylierten Hyaluronsäuremolekülenerzeugen 20, und der Neutralisierung von säurekonserviertem Kollagen und der Einwirkung von Hitze zur Bildung von Kollagenfasern 21,22,23.
Verschiedene Parameter, die für diesen Assay optimiert wurden, wurden in zuvor veröffentlichten Arbeiten in Thiol-modifizierten Hyaluronan-Kollagen-Hydrogelen beschrieben 8,12. Insbesondere sind die für diesen Assay verwendeten Zellen (primäre humane GSCs24, primäre menschliche kortikale Astrozyten und immortalisierte menschliche Mikroglia) in Gelen, die aus astrobasalen Medien bestehen, die mit GSC-Wachstumsfaktoren, 0,5 % v/v N-2 und 1 % v/v B-27 ohne Vitamin A12 angereichert sind, mindestens 60 % lebensfähig. In Fällen, in denen die Gele abgebaut werden müssen (z. B. für die Proteinextraktion oder die Durchflusszytometrie), werden Kollagenase und Dispase verwendet, um eine ausreichende Lebensfähigkeit zu erhalten (Abbildung 2).
Um die Invasion zu quantifizieren, müssen GSCs fluoreszenzmarkiert werden, bevor sie mit Gliazellen in der Matrix kombiniert werden. Dies kann durch Markierung mit Hoechst 33342 (wie unten beschrieben), Zelltracker12, genetische Modifikation oder Transduktion erreicht werden. Unabhängig davon sollte die Lebensfähigkeit von Zellen, die mit neuen Markern markiert wurden, gemessen werden, bevor sie in das TME-Modell aufgenommen werden. Wenn die Invasion nicht quantifiziert werden kann, die Gele aber für Proteinextraktionen, RNA-Extraktionen oder andere Ergebnisse geerntet werden, müssen die Zellen während des Gelherstellungsprozesses oft nicht fluoreszenzmarkiert werden. In diesem Fall können Gele entweder für die Bildgebung formalinfixiert, abgebaut und Zellen für die RNA-Extraktion lysiert oder unter Verwendung von Proteasen für die Durchflusszytometrie abgebaut und anschließend mit Proteinlysepuffern für Western Blots oder andere Proteinarbeiten lysiert werden.
Hier stellen wir ein Protokoll für die Integration von humanen Astrozyten, Mikroglia und patienteneigenen GSCs in einem patientendefinierten Verhältnis von 4:1:112 in eine 1,2 mg/ml-Kollagen-I-, 4 mg/ml-Hyaluronan-Matrix unter statischen oder fließenden Bedingungen vor. Die spezifischen Parameter, die für einen Assay verwendet werden (d. h. zelluläre Verhältnisse, Steifigkeit, Zelltypen usw.), können geändert werden, um verschiedene Kontexte darzustellen, wenn die Lebensfähigkeit angemessen ist.
Abbildung 1: Diagramm des TME-Modells, bestehend aus GSCs, Astrozyten und Mikroglia in einem Hydrogel unter einem Flüssigkeitsdruckkopf. Die Zellen werden in ein Kollagen-Hyaluronsäure-Hydrogel in einem Gewebekultureinsatz eingebettet. Die Gravitationskraft treibt die Nettoströmung nach unten an. Poren in der Membran des Gewebekultureinsatzes ermöglichen es Zellen, die nach unten eindringen, sich an der Unterseite des Gewebekultureinsatzes zu befestigen, und diese Zellen können fixiert, abgebildet und quantifiziert werden. Erstellt mit BioRender.com. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Zelluläre Lebensfähigkeit nach Hydrogelabbau. G34s (GSCs), Astrozyten und Mikroglia wurden im TME-Modell bei 4:1:1 ausgesät und 21 Stunden bei 37 °C inkubiert. Die Gele wurden mit 0,3 mg/ml Kollagenase + 0,02 mg/ml Dispase für insgesamt 30, 45 oder 60 Minuten entfernt und abgebaut, wobei alle 15 Minuten (30-Minuten-Bedingung) oder nach 30 Minuten alle 15 Minuten (45-Minuten- und 60-Minuten-Bedingungen) pipettiert wurde. Nachdem die Gele abgebaut waren, wurden die Zellen mit Acridinorange (alle Zellen) und Propidiumiodid (tote Zellen) gefärbt und mit einem automatisierten Zellzähler gezählt. Die Viabilität wird für alle Zellen innerhalb des TME-Modells berichtet. Die Zellen behielten über 30-60 Minuten eine Lebensfähigkeit von mindestens 70 % bei. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt; n = 3 biologische Replikate. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Der Aufbau des TME-Modells umfasst sechs grundlegende Schritte: 1) Passieren von Zellen und Trennen der Zellen zwischen ähnlichen Bedingungen, 2) Zusammenstellen einer konzentrierten Kollagenlösung für alle Bedingungen, 3) Kombinieren der Gelkomponenten (Zellen, Kollagen, methacrylierte Hyaluronsäure und der Photoinitiator) für jede Bedingung, 4) Plattieren von Gelen, 5) Vernetzung durch UV-Strahlung und Hitze und 6) Hinzufügen des Flüssigkeitsdruckkopfes. Nach 18 Stunden oder meh…
The authors have nothing to disclose.
Wir danken den Geldgebern für diese Arbeit: den National Institutes of Health National Cancer Institute (R37 CA222563 zu J.M.), der Coulter Foundation (J.M.) und der Virginia Tech ICTAS-CEH (J.M. & J.H.). Die in diesem Assay verwendeten GSCs wurden von Jakub Godlewski, Ph.D. (Harvard Medical School) abgeleitet.
12 Well Tissue Culture Plate, Sterile | Celltreat Scientific Products | 229112 | |
250 mL Filter System, PES Filter Material, 0.22 µm, 50 mm, Sterile | DOT Scientific | 667706 | |
385 nm, 1650 mW (Min) Mounted LED, 1700 mA | Thorlabs | M385LP1-C1 | |
75cm2 Tissue Culture Flask – Vent Cap, Sterile | Celltreat Scientific Products | 229341 | |
8.0 μm Cell Culture Plate Insert 12 mm Diameter | Millicell | PI8P01250 | |
Absolute Ethanol, 200 proof, Molecular Biology Grade | Thermo Fisher Scientific | T038181000CS | Ethanol for flow cytometry dead cell control. |
Astrocyte Medium (Astrofull) | ScienCell Research Laboratories | 1801 | Contains astrobasal, FBS, and penicillin/streptomycin. |
B-27 Supplement (50x), minus vitamin A (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
BSA (MACS) | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
CD71 antibody (eBioscience, Invitrogen) | Fisher Scientific | 25-0719-41 | |
Cell Counting Chambered Slides | Nexcelom Bioscience | CHT4-PD100-002 | |
Cell Scrapers | Biologix USA | 70-1250 | |
Cellometer K2 Fluorescent Cell Counter (Nexelcom Bioscience) | VWR | NEXCCMK2-SK150-FCS | |
Centrifuge – Low-Speed | Eppendorf | 5702 R | Centrifuge for cell culture. |
Clear Polystyrene 96-Well Microplates, Corning | Fisher Scientific | 07-200-108 | V-bottom plates for flow cytometry staining. |
CO2 Incubator, 150L, Heracell 150i (Thermo Scientific) | Thermo Fisher Scientific | 50116047 | |
Collagen I, High Concentration, Rat Tail | Corning | 354249 | |
Collagen I, Rat Tail | Corning | 354236 | "Low" concentration for coating adherent flasks. |
Collagenase (CAS# 9001-12-1) | United States Biological | C7511-30 | |
Collimation Adapter for Olympus BX & IX, AR Coating: 350 – 700 nm | Thorlabs | COP1-A | |
Cotton Swabs, Q-tips Precision Tips | Amazon | B01KCJB3R2 | |
Dispase (CAS# 9001-92-7) | United States Biological | D3760 | |
DMEM, high glucose (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | |
EVOS FL | Invitrogen | AMF4300 | |
Fetal Bovine Serum (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | For microglia culture. |
Formalin solution, neutral buffered, 10% (Sigma-Aldrich) | Millipore Sigma | HT501128 | |
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set (eBioscience, Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | 00-5523-00 | |
Glioma stem cells | n/a | n/a | Can be patient derived or commercial glioma stem cell lines. |
Guava easyCyte HT System | Millipore Sigma | 0500-4008 | Flow cytometer. |
HBSS (Sigma-Aldrich) | Millipore Sigma | H6648 | |
HEPES (1 M) (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
High-Power 1-Channel LED Driver with Pulse Modulation, 10.0 A Max, 50.0 V Max | Thorlabs | DC2200 | Interface for UV Lamp. |
Hoechst 33342 Solution (20 mM) (Thermo Scientific) | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
Human Astrocytes | ScienCell Research Laboratories | 1800 | Primary astrocytes derived from the cerebral cortex. |
Human EGF Recombinant Protein (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | PHG0311 | |
Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) (aa 10-155) Recombinant Protein (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | PHG0021 | |
Immortalized Human Microglia – hTERT | Applied Biological Materials | T0251 | |
Incu-mixer MP Heated Microplate Vortexer, 2 position | Benchmark Scientific | H6002 | |
Ki67 REAfinity, PerCP-Vio 700 antibody | Miltenyi Biotec | 130-120-420 | |
LED UV Curing Meter | Gigahertz-Optik | X1-RCH-116 | Optometer to measure UV light intensity. |
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Advanced Biomatrix | 5269-100MG | Photoinitiator. |
LIVE/DEAD Fixable Near-IR (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | L24975 | |
Methacrylated hyaluronic acid (photoHA) | Advanced Biomatrix | 5212-100MG | |
Microcentrifuge, Sorvall ST8R (Thermo Scientific) | Fisher Scientific | 75-997-203 | Centrifuge for flow cytometry staining. |
N-2 Supplement (100X) (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
Neurobasal-A Medium (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 10888022 | |
PBS (10X), pH 7.4 without Ca & Mg | Quality Biological | 119-069-101 | |
Sodium hydroxide, pellets ACS (CAS# 1310-73-2) | VWR | 97064-476 | |
Synergy Ultrapure Water Purification System (MilliporeSigma) | Fisher Scientific | SYNS0HFUS | |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
ViaStain AOPI Staining Solution | Nexcelom Bioscience | CS2-0106 |