Dieses Protokoll beschreibt das invertierte Emulsionsverfahren, das zur Verkapselung eines zellfreien Expressionssystems (CFE) in einem riesigen unilamellären Vesikel (GUV) zur Untersuchung der Synthese und des Einbaus eines Modellmembranproteins in die Lipiddoppelschicht verwendet wird.
Zellfreie Expressionssysteme (CFE) sind leistungsfähige Werkzeuge in der synthetischen Biologie, die die Biomimikry zellulärer Funktionen wie Biosensorik und Energieregeneration in synthetischen Zellen ermöglichen. Die Rekonstruktion einer Vielzahl zellulärer Prozesse erfordert jedoch die erfolgreiche Rekonstitution von Membranproteinen in die Membran synthetischer Zellen. Während die Expression löslicher Proteine in gängigen CFE-Systemen in der Regel erfolgreich ist, hat sich die Rekonstitution von Membranproteinen in Lipiddoppelschichten synthetischer Zellen als schwierig erwiesen. In dieser Arbeit wird ein Verfahren zur Rekonstitution eines Modellmembranproteins, des bakteriellen Glutamatrezeptors (GluR0), in riesigen unilamellären Vesikeln (GUVs) als synthetische Modellzellen auf der Grundlage der Verkapselung und Inkubation der CFE-Reaktion in synthetischen Zellen demonstriert. Unter Verwendung dieser Plattform wird der Effekt der Substitution des N-terminalen Signalpeptids von GluR0 durch das Proteorhodopsin-Signalpeptid auf die erfolgreiche cotranslationale Translokation von GluR0 in Membranen von hybriden GUVs demonstriert. Mit dieser Methode steht ein robustes Verfahren zur Verfügung, das die zellfreie Rekonstitution verschiedener Membranproteine in synthetischen Zellen ermöglicht.
Die synthetische Bottom-up-Biologie hat in den letzten zehn Jahren als aufstrebendes Gebiet mit zahlreichen Anwendungsmöglichkeiten in der Biotechnologie, der Wirkstoffverabreichung und der regenerativen Medizin zunehmend an Interesse gewonnen 1,2. Insbesondere die Entwicklung synthetischer Zellen als Eckpfeiler der synthetischen Bottom-up-Biologie hat aufgrund der vielversprechenden Anwendungen synthetischer Zellen sowie ihrer zellähnlichen physikalischen und biochemischen Eigenschaften, die biophysikalische In-vitro-Studien erleichtern, ein breites Spektrum an wissenschaftlichen Gemeinschaften angezogen 3,4,5,6 . Synthetische Zellen werden oft in zellgroßen riesigen unilamellären Vesikeln (GUVs) hergestellt, in denen verschiedene biologische Prozesse nachgebildet werden. Die Rekonstitution des Zellzytoskeletts 7,8, die lichtabhängige Energieregeneration9, die zelluläre Kommunikation10,11 und die Biosensorik12 sind Beispiele für Bemühungen, zellähnliche Verhaltensweisen in synthetischen Zellen zu rekonstruieren.
Während einige zelluläre Prozesse auf löslichen Proteinen beruhen, verwenden viele Eigenschaften natürlicher Zellen, wie z. B. Sensorik und Kommunikation, häufig Membranproteine, einschließlich Ionenkanäle, Rezeptoren und Transporter. Eine große Herausforderung in der synthetischen Zellentwicklung ist die Rekonstitution von Membranproteinen. Obwohl traditionelle Methoden der Membranproteinrekonstitution in Lipiddoppelschichten auf einer Detergenz-vermittelten Reinigung beruhen, sind solche Methoden mühsam, unwirksam für Proteine, die für den Expressionswirt toxisch sind, oder oft nicht für die Membranproteinrekonstitution in GUVsgeeignet 13.
Eine alternative Methode zur Proteinexpression sind zellfreie Expressionssysteme (CFE). CFE-Systeme sind ein leistungsfähiges Werkzeug in der synthetischen Biologie, das die In-vitro-Expression verschiedener Proteine entweder mit Zelllysat oder gereinigter Transkriptions-Translations-Maschinerie ermöglicht14. CFE-Systeme können auch in GUVs verkapselt werden, was kompartimentierte Proteinsynthesereaktionen ermöglicht, die für verschiedene Anwendungen programmiert werden können, wie z. B. die Erzeugung von lichtsammelnden synthetischen Zellen9 oder mechanosensitiven Biosensoren15,16. Analog zu rekombinanten Proteinexpressionsmethoden stellt die Expression von Membranproteinen in CFE-Systemen eine Herausforderungdar 17. Aggregation, Fehlfaltung und fehlende posttranslationale Modifikation in CFE-Systemen sind große Engpässe, die eine erfolgreiche Membranproteinsynthese mit CFE-Systemen behindern. Die Schwierigkeit der Rekonstitution von Bottom-up-Membranproteinen mit Hilfe von CFE-Systemen ist zum Teil auf das Fehlen eines komplexen Biogenesewegs für Membranproteine zurückzuführen, der auf Signalpeptiden, Signalerkennungspartikeln, Translokons und Chaperoning-Molekülen beruht. In jüngster Zeit haben jedoch mehrere Studien darauf hingewiesen, dass das Vorhandensein von membranösen Strukturen wie Mikrosomen oder Liposomen während der Translation eine erfolgreiche Expression von Membranproteinen fördert 18,19,20,21. Darüber hinaus haben Eaglesfield et al. und Steinküher et al. herausgefunden, dass der Einschluss spezifischer hydrophober Domänen, die als Signalpeptide bekannt sind, in den N-Terminus des Membranproteins dessen Expression signifikant verbessern kann 22,23. Insgesamt deuten diese Studien darauf hin, dass die Herausforderung der Rekonstitution von Membranproteinen in synthetischen Zellen überwunden werden kann, wenn die Proteintranslation in Gegenwart der GUV-Membran erfolgt und wenn das richtige N-terminale Signalpeptid verwendet wird.
In dieser Arbeit wird ein Protokoll zur Verkapselung der Proteinsynthese unter Verwendung von rekombinanten Elementen (PURE) CFE-Reaktionen zur Rekonstitution von Membranproteinen in GUVs vorgestellt. Der bakterielle Glutamatrezeptor24 (GluR0) wird als Modellmembranprotein ausgewählt und die Wirkung seines N-terminalen Signalpeptids auf seine Membranrekonstitution untersucht. Die Wirkung des Proteorhodopsin-Signalpeptids, das von Eaglesfield et al.22 gezeigt wurde, dass es die Rekonstitutionseffizienz von Membranproteinen verbessert, wird untersucht, indem eine mutierte Variante von GluR0 mit der Bezeichnung PRSP-GluR0 konstruiert und seine Expression und Membranlokalisation mit Wildtyp-GluR0 (im Folgenden als WT-GluR0 bezeichnet), das sein natives Signalpeptid beherbergt, verglichen wird. Dieses Protokoll basiert auf dem invertierten Emulsionsverfahren25 mit Modifikationen, die es für die CFE-Verkapselung robust machen. Bei der vorgestellten Methode werden die CFE-Reaktionen zunächst mit einer Lipid-in-Öl-Lösung emulgiert, die mikrometergroße Tröpfchen erzeugt, die das CFE-System enthalten und durch die Lipidmonoschicht stabilisiert werden. Die Emulsionströpfchen werden dann auf eine Öl-Wasser-Grenzfläche geschichtet, die mit einer weiteren Lipid-Monoschicht gesättigt ist. Die Emulsionströpfchen werden dann durch die Zentrifugalkraft gezwungen, über die Öl-Wasser-Grenzfläche zu wandern. Durch diesen Prozess erhalten die Tröpfchen eine weitere Monoschicht, wodurch ein zweischichtiges Lipidvesikel entsteht. Die GUVs, die die CFE-Reaktion enthalten, werden dann inkubiert, wobei das Membranprotein exprimiert und in die GUV-Membran eingebaut wird. Obwohl dieses Protokoll für die zellfreie Expression von GluR0 spezifiziert ist, kann es für die zellfreie Synthese anderer Membranproteine oder verschiedene synthetische Zellanwendungen wie die Rekonstitution des Zytoskeletts oder Membranfusionsstudien verwendet werden26.
Praktisch jeder zelluläre Prozess, der von der Übertragung von Molekülen oder Informationen über die Zellmembran abhängt, wie z. B. die Zellsignalisierung oder die Zellanregung, erfordert Membranproteine. Daher ist die Rekonstitution von Membranproteinen zum Hauptengpass bei der Realisierung verschiedener synthetischer Zelldesigns für unterschiedliche Anwendungen geworden. Die traditionelle Detergenzien-vermittelte Rekonstitution von Membranproteinen in biologischen Membranen erfordert GUV-Erzeugungsmethoden wie sa…
The authors have nothing to disclose.
APL bedankt sich für die Unterstützung durch die National Science Foundation (EF1935265), die National Institutes of Health (R01-EB030031 und R21-AR080363) und das Army Research Office (80523-BB)
100 nm polycarbonate filter | STERLITECH | 1270193 | |
96 Well Clear Bottom Plate | ThermoFisher Scientific | 165305 | |
BioTek Synergy H1M Hybrid Multi-Mode Reader | Agilent | 11-120-533 | |
Creatine phosphate | Millipore Sigma | 10621714001 | |
CSU-X1 Confocal Scanner Unit | Yokogawa | CSU-X1 | |
Density gradient medium (Optiprep) | Millipore Sigma | D1556 | Optional to switch with sucrose in inner solution |
Filter supports | Avanti | 610014 | |
Fisherbrand microtubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
Folinic acid calcium salt hydrate | Millipore Sigma | F7878 | |
Glucose | Millipore Sigma | 158968 | |
HEPES | Millipore Sigma | H3375 | |
iXon X3 camera | Andor | DU-897E-CS0 | |
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | Millipore Sigma | G1501 | |
Light mineral oil | Millipore Sigma | M5904 | |
Magnesium acetate tetrahydrate | Millipore Sigma | M5661 | |
Mini-extruder kit (including syringe holder and extruder stand) | Avanti | 610020 | |
Olympus IX81 Inverted Microscope | Olympus | IX21 | |
Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective | Olympus | 1-U2B933 | |
PEO-b-PBD | Polymer Source | P41745-BdEO | |
pET28b-PRSP-GluR0-sfGFP plasmid DNA | Homemade | N/A | |
pET28b-sfGFP-sfCherry(1-10) plasmid DNA | Homemade | N/A | |
pET28b-WT-GluR0-sfGFP plasmid DNA | Homemade | N/A | |
POPC lipid in chloroform | Avanti | 850457C | |
Potassium chloride | Millipore Sigma | P9541 | |
PUREfrex 2.0 | Cosmo Bio USA | GFK-PF201 | |
Ribonucleotide Solution Set | New England BioLabs | N0450 | |
RNase Inhibitor, Murine | New England BioLabs | M0314S | |
RTS Amino Acid Sampler | Biotechrabbit | BR1401801 | |
Sodium chloride | Millipore Sigma | S9888 | |
Spermidine | Millipore Sigma | S2626 | |
Sucrose | Millipore Sigma | S0389 | |
VAPRO Vapor Pressure Osmometer Model 5600 | ELITechGroup | VAPRO 5600 |