Summary

Rekonstitution des bakteriellen Glutamatrezeptorkanals durch Verkapselung eines zellfreien Expressionssystems

Published: March 08, 2024
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Summary

Dieses Protokoll beschreibt das invertierte Emulsionsverfahren, das zur Verkapselung eines zellfreien Expressionssystems (CFE) in einem riesigen unilamellären Vesikel (GUV) zur Untersuchung der Synthese und des Einbaus eines Modellmembranproteins in die Lipiddoppelschicht verwendet wird.

Abstract

Zellfreie Expressionssysteme (CFE) sind leistungsfähige Werkzeuge in der synthetischen Biologie, die die Biomimikry zellulärer Funktionen wie Biosensorik und Energieregeneration in synthetischen Zellen ermöglichen. Die Rekonstruktion einer Vielzahl zellulärer Prozesse erfordert jedoch die erfolgreiche Rekonstitution von Membranproteinen in die Membran synthetischer Zellen. Während die Expression löslicher Proteine in gängigen CFE-Systemen in der Regel erfolgreich ist, hat sich die Rekonstitution von Membranproteinen in Lipiddoppelschichten synthetischer Zellen als schwierig erwiesen. In dieser Arbeit wird ein Verfahren zur Rekonstitution eines Modellmembranproteins, des bakteriellen Glutamatrezeptors (GluR0), in riesigen unilamellären Vesikeln (GUVs) als synthetische Modellzellen auf der Grundlage der Verkapselung und Inkubation der CFE-Reaktion in synthetischen Zellen demonstriert. Unter Verwendung dieser Plattform wird der Effekt der Substitution des N-terminalen Signalpeptids von GluR0 durch das Proteorhodopsin-Signalpeptid auf die erfolgreiche cotranslationale Translokation von GluR0 in Membranen von hybriden GUVs demonstriert. Mit dieser Methode steht ein robustes Verfahren zur Verfügung, das die zellfreie Rekonstitution verschiedener Membranproteine in synthetischen Zellen ermöglicht.

Introduction

Die synthetische Bottom-up-Biologie hat in den letzten zehn Jahren als aufstrebendes Gebiet mit zahlreichen Anwendungsmöglichkeiten in der Biotechnologie, der Wirkstoffverabreichung und der regenerativen Medizin zunehmend an Interesse gewonnen 1,2. Insbesondere die Entwicklung synthetischer Zellen als Eckpfeiler der synthetischen Bottom-up-Biologie hat aufgrund der vielversprechenden Anwendungen synthetischer Zellen sowie ihrer zellähnlichen physikalischen und biochemischen Eigenschaften, die biophysikalische In-vitro-Studien erleichtern, ein breites Spektrum an wissenschaftlichen Gemeinschaften angezogen 3,4,5,6 . Synthetische Zellen werden oft in zellgroßen riesigen unilamellären Vesikeln (GUVs) hergestellt, in denen verschiedene biologische Prozesse nachgebildet werden. Die Rekonstitution des Zellzytoskeletts 7,8, die lichtabhängige Energieregeneration9, die zelluläre Kommunikation10,11 und die Biosensorik12 sind Beispiele für Bemühungen, zellähnliche Verhaltensweisen in synthetischen Zellen zu rekonstruieren.

Während einige zelluläre Prozesse auf löslichen Proteinen beruhen, verwenden viele Eigenschaften natürlicher Zellen, wie z. B. Sensorik und Kommunikation, häufig Membranproteine, einschließlich Ionenkanäle, Rezeptoren und Transporter. Eine große Herausforderung in der synthetischen Zellentwicklung ist die Rekonstitution von Membranproteinen. Obwohl traditionelle Methoden der Membranproteinrekonstitution in Lipiddoppelschichten auf einer Detergenz-vermittelten Reinigung beruhen, sind solche Methoden mühsam, unwirksam für Proteine, die für den Expressionswirt toxisch sind, oder oft nicht für die Membranproteinrekonstitution in GUVsgeeignet 13.

Eine alternative Methode zur Proteinexpression sind zellfreie Expressionssysteme (CFE). CFE-Systeme sind ein leistungsfähiges Werkzeug in der synthetischen Biologie, das die In-vitro-Expression verschiedener Proteine entweder mit Zelllysat oder gereinigter Transkriptions-Translations-Maschinerie ermöglicht14. CFE-Systeme können auch in GUVs verkapselt werden, was kompartimentierte Proteinsynthesereaktionen ermöglicht, die für verschiedene Anwendungen programmiert werden können, wie z. B. die Erzeugung von lichtsammelnden synthetischen Zellen9 oder mechanosensitiven Biosensoren15,16. Analog zu rekombinanten Proteinexpressionsmethoden stellt die Expression von Membranproteinen in CFE-Systemen eine Herausforderungdar 17. Aggregation, Fehlfaltung und fehlende posttranslationale Modifikation in CFE-Systemen sind große Engpässe, die eine erfolgreiche Membranproteinsynthese mit CFE-Systemen behindern. Die Schwierigkeit der Rekonstitution von Bottom-up-Membranproteinen mit Hilfe von CFE-Systemen ist zum Teil auf das Fehlen eines komplexen Biogenesewegs für Membranproteine zurückzuführen, der auf Signalpeptiden, Signalerkennungspartikeln, Translokons und Chaperoning-Molekülen beruht. In jüngster Zeit haben jedoch mehrere Studien darauf hingewiesen, dass das Vorhandensein von membranösen Strukturen wie Mikrosomen oder Liposomen während der Translation eine erfolgreiche Expression von Membranproteinen fördert 18,19,20,21. Darüber hinaus haben Eaglesfield et al. und Steinküher et al. herausgefunden, dass der Einschluss spezifischer hydrophober Domänen, die als Signalpeptide bekannt sind, in den N-Terminus des Membranproteins dessen Expression signifikant verbessern kann 22,23. Insgesamt deuten diese Studien darauf hin, dass die Herausforderung der Rekonstitution von Membranproteinen in synthetischen Zellen überwunden werden kann, wenn die Proteintranslation in Gegenwart der GUV-Membran erfolgt und wenn das richtige N-terminale Signalpeptid verwendet wird.

In dieser Arbeit wird ein Protokoll zur Verkapselung der Proteinsynthese unter Verwendung von rekombinanten Elementen (PURE) CFE-Reaktionen zur Rekonstitution von Membranproteinen in GUVs vorgestellt. Der bakterielle Glutamatrezeptor24 (GluR0) wird als Modellmembranprotein ausgewählt und die Wirkung seines N-terminalen Signalpeptids auf seine Membranrekonstitution untersucht. Die Wirkung des Proteorhodopsin-Signalpeptids, das von Eaglesfield et al.22 gezeigt wurde, dass es die Rekonstitutionseffizienz von Membranproteinen verbessert, wird untersucht, indem eine mutierte Variante von GluR0 mit der Bezeichnung PRSP-GluR0 konstruiert und seine Expression und Membranlokalisation mit Wildtyp-GluR0 (im Folgenden als WT-GluR0 bezeichnet), das sein natives Signalpeptid beherbergt, verglichen wird. Dieses Protokoll basiert auf dem invertierten Emulsionsverfahren25 mit Modifikationen, die es für die CFE-Verkapselung robust machen. Bei der vorgestellten Methode werden die CFE-Reaktionen zunächst mit einer Lipid-in-Öl-Lösung emulgiert, die mikrometergroße Tröpfchen erzeugt, die das CFE-System enthalten und durch die Lipidmonoschicht stabilisiert werden. Die Emulsionströpfchen werden dann auf eine Öl-Wasser-Grenzfläche geschichtet, die mit einer weiteren Lipid-Monoschicht gesättigt ist. Die Emulsionströpfchen werden dann durch die Zentrifugalkraft gezwungen, über die Öl-Wasser-Grenzfläche zu wandern. Durch diesen Prozess erhalten die Tröpfchen eine weitere Monoschicht, wodurch ein zweischichtiges Lipidvesikel entsteht. Die GUVs, die die CFE-Reaktion enthalten, werden dann inkubiert, wobei das Membranprotein exprimiert und in die GUV-Membran eingebaut wird. Obwohl dieses Protokoll für die zellfreie Expression von GluR0 spezifiziert ist, kann es für die zellfreie Synthese anderer Membranproteine oder verschiedene synthetische Zellanwendungen wie die Rekonstitution des Zytoskeletts oder Membranfusionsstudien verwendet werden26.

Protocol

Die für diese Studie verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt. 1. Bulk-CFE-Reaktionen in Gegenwart von kleinen unilamellären Vesikeln (SUVs) SUV-VorbereitungHINWEIS: Dieser Schritt muss in einem Abzug gemäß den Sicherheitshinweisen für die Arbeit mit Chloroform durchgeführt werden.Bereiten Sie 5 mM 1-Palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholin (POPC) SUVs in einem Glasfläschchen vor, indem Sie 76 μ…

Representative Results

Vor der Verkapselung der CFE-Reaktionen wurden zwei Varianten von GluR0-sfGFP, die native und Proteorhodopsin-Signalpeptide beherbergen (die Signalpeptidsequenzen sind in der ergänzenden Tabelle 1 dargestellt), und das lösliche sfGFP einzeln in Massenreaktionen exprimiert, und ihre Expression wurde durch Detektion des sfGFP-Signals mit einem Plattenlesegerät überwacht (Abbildung 2A). Membranproteine wurden in Abwesenheit oder Anwesenheit von 100 nm SUVs …

Discussion

Praktisch jeder zelluläre Prozess, der von der Übertragung von Molekülen oder Informationen über die Zellmembran abhängt, wie z. B. die Zellsignalisierung oder die Zellanregung, erfordert Membranproteine. Daher ist die Rekonstitution von Membranproteinen zum Hauptengpass bei der Realisierung verschiedener synthetischer Zelldesigns für unterschiedliche Anwendungen geworden. Die traditionelle Detergenzien-vermittelte Rekonstitution von Membranproteinen in biologischen Membranen erfordert GUV-Erzeugungsmethoden wie sa…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

APL bedankt sich für die Unterstützung durch die National Science Foundation (EF1935265), die National Institutes of Health (R01-EB030031 und R21-AR080363) und das Army Research Office (80523-BB)

Materials

100 nm polycarbonate filter STERLITECH 1270193
96 Well Clear Bottom Plate ThermoFisher Scientific 165305
BioTek Synergy H1M Hybrid Multi-Mode Reader Agilent 11-120-533
Creatine phosphate Millipore Sigma 10621714001
CSU-X1 Confocal Scanner Unit Yokogawa CSU-X1 
Density gradient medium (Optiprep) Millipore Sigma D1556 Optional to switch with sucrose in inner solution
Filter supports Avanti 610014
Fisherbrand microtubes (1.5 mL) Fisher Scientific 05-408-129 
Folinic acid calcium salt hydrate Millipore Sigma F7878
Glucose Millipore Sigma 158968
HEPES Millipore Sigma H3375
iXon X3 camera  Andor DU-897E-CS0 
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate Millipore Sigma G1501
Light mineral oil Millipore Sigma M5904
Magnesium acetate tetrahydrate  Millipore Sigma M5661
Mini-extruder kit (including syringe holder and extruder stand) Avanti 610020
Olympus IX81 Inverted Microscope  Olympus IX21
Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective  Olympus 1-U2B933 
PEO-b-PBD Polymer Source P41745-BdEO
pET28b-PRSP-GluR0-sfGFP plasmid DNA Homemade N/A
pET28b-sfGFP-sfCherry(1-10) plasmid DNA Homemade N/A
pET28b-WT-GluR0-sfGFP plasmid DNA Homemade N/A
POPC lipid in chloroform  Avanti 850457C
Potassium chloride Millipore Sigma P9541
PUREfrex 2.0 Cosmo Bio USA GFK-PF201
Ribonucleotide Solution Set New England BioLabs N0450
RNase Inhibitor, Murine New England BioLabs M0314S
RTS Amino Acid Sampler Biotechrabbit BR1401801
Sodium chloride Millipore Sigma S9888
Spermidine Millipore Sigma S2626
Sucrose Millipore Sigma S0389
VAPRO Vapor Pressure Osmometer Model 5600 ELITechGroup VAPRO 5600

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Loi, K. J., Moghimianavval, H., Liu, A. P. Reconstitution of the Bacterial Glutamate Receptor Channel by Encapsulation of a Cell-Free Expression System. J. Vis. Exp. (205), e66595, doi:10.3791/66595 (2024).

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