투과 전자 현미경을 위한 망막 오가노이드 시료 준비
Summary
이 프로토콜은 투과 전자 현미경을 위한 망막 오가노이드 샘플에 대한 최적화되고 정교한 준비 절차를 제공합니다. 성숙한 망막 오가노이드의 시냅스 분석과 관련된 응용 분야에 적합합니다.
Abstract
망막 오가노이드(RO)는 특정 조건에서 유도만능줄기세포(iPSC)와 구별된 인간의 망막 특징을 모방한 3차원 배양 시스템입니다. RO에서의 시냅스 발달 및 성숙은 면역세포화학적, 기능적으로 연구되어 왔습니다. 그러나 시냅스 접촉 초세구조의 직접적인 증거는 제한적이며, 특수 리본 시냅스와 기존의 화학적 시냅스를 모두 포함합니다. 투과 전자 현미경(TEM)은 고해상도와 인간과 다양한 종의 망막 발달 및 시냅스 성숙을 설명하는 존경할 만한 역사가 특징입니다. RO의 시냅스 구조를 탐구하는 강력한 도구이며 RO의 연구 분야에서 널리 사용됩니다. 따라서 나노 스케일에서 RO 시냅스 접촉의 구조를 더 잘 탐구하고 고품질의 현미경 증거를 얻기 위해 간단하고 반복 가능한 RO TEM 샘플 준비 방법을 개발했습니다. 이 백서에서는 프로토콜, 사용된 시약, RO 고정 준비, 사후 고정, 임베딩 및 시각화를 포함한 자세한 단계를 설명합니다.
Introduction
인간과 포유류의 중요한 시각 감각 기관인 망막은 뉴런 소마를 수용하는 3개의 핵층과 기존 시냅스와 특수 리본 시냅스 2,3을 포함한 시냅스 연결1에 의해 형성된 2개의 망상층을 특징으로 하는 뚜렷한 적층 구조를 나타냅니다. 리본 시냅스는 단계적 방식으로 소포 자극을 전달하는 데 중요한 역할을 합니다 2,3. 시각 과정은 뉴런과 시냅스의 다양한 수준을 가로지르는 전기 광학 신호 전달을 포함하며, 궁극적으로 시각 피질 4,5에 도달합니다.
망막 오가노이드(RO)는 유도만능줄기세포(iPSC)에서 유래한 3차원(3D) 배양 시스템을 나타내며, in vitro 1,6,7 망막 조직의 생리학적 상태를 모방합니다. 이 접근법은 망막 질환8, 약물 스크리닝9을 연구하고, 색소성 망막염(retinitis pigmentosa)10 및 녹내장(glaucoma)11과 같은 비가역적 망막 퇴행성 질환에 대한 잠재적 치료법으로 사용될 수 있는 가능성을 제시한다. 강력한 체외 광학 전도 시스템인 RO 내의 시냅스는 효과적인 신호 변환 및 전달을 촉진하는 중요한 구조입니다5.
RO 발달은 형태학적 특성과 분자 발현 프로파일에 따라 크게 3단계로 나눌 수 있습니다 6,12. 1기(D21-D60 경)의 RO는 망막의 신경 전구 세포, 많은 망막 신경절 세포(RGC) 및 인간 태아 발달의 첫 번째 시기에 해당하는 몇 개의 별폭발 무축삭 세포(SAC)로 구성됩니다. 2단계(약 D50-D150)에서 RO는 일부 광수용체 전구체, 인터뉴런 및 시냅토 형성 관련 유전자를 발현하며, 이는 전이 단계를 나타냅니다. 광수용체는 인간 태아 발달의 세 번째 단계에 해당하는 3단계 RO(D100-D150 이후)에서 성숙을 이룬다(D100-D150 이후) 6,12,13. 주목할 만한 점은, 1기 및 2기의 RO와 비교했을 때, 3기의 RO는 리본 시냅스(ribbon synapses)14의 존재를 포함하여 시냅스(synapses)가 12개 성숙한 뚜렷한 라멜라 구조를 가지고 있다. 더욱이, 최근의 한 연구는 성숙한 시냅스가 빛 신호의 전달에 존재한다는 것을 확인했으며, 이는 시냅스가 기능적임을 나타낸다13. 따라서 3단계의 RO는 종종 시냅스 구조를 조사하기 위해 선택됩니다.
면역조직화학은 다양한 분자 단백질의 발현 연구에 널리 적용됩니다. 그러나 광학 현미경의 한계는 한 번에 제한된 수의 특정 세포와 분자만 관찰할 수 있기 때문에 세포와 주변 환경 간의 관계에 대한 포괄적인 분석이 부족하다는 것입니다. 투과 전자 현미경(TEM)은 0.1-0.2nm의 제한된 해상도로 고해상도가 특징이며 광학 현미경을 ~10-20배15배 능가합니다. 그것은 광학 현미경의 결함을 보완하고 인간16,17 및 다양한 종 18,19,20,21에서 망막 발달 및 시냅스 성숙을 설명하는 데 사용됩니다. TEM은 시냅스전(presynaptic) 및 시냅스후(postsynaptic) 구성 요소(18,20)를 직접 구별할 수 있으며, 리본(ribbons) 2,3, 소포(vesicles)22 및 미토콘드리아(mitochondria)(23)와 같은 세포 내 구조를 포괄적으로 관찰할 수 있습니다. 따라서 TEM은 시냅스 유형을 식별하고 나노 스케일에서 RO의 시냅스 접촉의 미세 구조를 탐구하는 데 필수적인 도구입니다.
샘플 준비는 고품질 전자 현미경 사진을 획득하는 데 매우 중요하다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 일부 연구에서 RO 12,13,24에 대해 EM을 수행했지만 자세한 절차는 불분명합니다. 전자 현미경 이미지의 품질은 RO 고정 및 시약 투과의 효과에 크게 좌우되기 때문에 준비 중에 여러 가지 중요한 요소를 고려해야 합니다. 결과적으로, RO의 시냅스 접촉을 더 잘 조사하기 위해 RO 고정, 임베딩 및 관찰 부위 식별의 작동 지점을 보여주는 재현성이 우수한 방법을 제시합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 기사에서는 TEM에 의한 RO의 기존 및 리본 시냅스 초미구조를 관찰하기 위한 자세한 프로토콜을 제시했습니다. 이 프로토콜은 이전에 설명한 망막 준비 방법에 기초하며, 약간의 변형이 가미되어있다(20). 샘플 처리의 성공률과 TEM 현미경 사진의 품질을 개선하려면 다음 핵심 사항을 고려하십시오. 첫째, RO가 iPSC에서 발생하여 혈관 구조</s…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국 국가핵심연구개발프로그램(National Key Research and Development Program of China, 2022YFA1105503), 국가핵심신경과학연구소(State Key Laboratory of Neuroscience, SKLN-202103), 중국 저장자연과학재단(Zhejiang Natural Science Foundation of China, Y21H120019), 중국자연과학재단(Natural Science Foundation of China, 82070981)의 보조금으로 일부 지원되었습니다.
Materials
| 100 mm Petri dish | Corning | 430167 | |
| Acetone | Electron Microscopy Science | 10000 | |
| B27 supplement | Gibco | A3582801 | |
| Cell lifter | Santa Cruz | sc-395251 | |
| Copper grids | Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd. | AZH400HH | |
| DigitalMicrograph Software | Gatan, Inc. | Software | |
| Dispase | StemCell Technologies | #07913 | Bacterial protease |
| DMEM/F12 medium | Gibco | #11320033 | |
| Embedding mold | Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd. | GZ10592 | |
| Epon-812 resin | Electron Microscopy Science | #14900 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biological Industries | #04-0021A | |
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Science | 16020 | |
| hiPSC | Shownin Biotechnology Co. Ltd. | RC01001-A | |
| Lead citrate | Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd. | GZ02618 | |
| L-GlutaMax | Life Technologies | #35050061 | L-glutamine substitute |
| Matrigel | Corning | 356234 | |
| Microscope slide | CITOTEST | 80312-3161 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| Na2HPO4· 12H2O | Sigma | 71650 | A component of PB/PBS |
| NaH2PO4· H2O | Sigma | 71507 | A component of PB/PBS |
| Non-essential amino acids | Sigma | #M7145 | |
| Optical microscope | Lab Binocular Biological Microscope | Xsz-107bnii | |
| OsO4 | TED PELLA | 4008-160501 | |
| Oven | Bluepard | BPG9040A | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 157-8 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | #15140-122 | |
| Semi/ultrathin microtome | Reichert-Jung | 396649 | |
| Taurine | Sigma | #T0625 | |
| Toluidine blue | Sangon Biotech | E670105-0100 | |
| Transmission Electron Microscopes | HITACHI | H-7500 | |
| Uranyl acetate | TED PELLA | CA96049 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | 444203 |
Referenzen
- Andreazzoli, M., Barravecchia, I., De Cesari, C., Angeloni, D., Demontis, G. C. Inducible pluripotent stem cells to model and treat inherited degenerative diseases of the outer retina: 3d-organoids limitations and bioengineering solutions. Cells. 10 (9), 2489 (2021).
- Moser, T., Grabner, C. P., Schmitz, F. Sensory processing at ribbon synapses in the retina and the cochlea. Physiol Rev. 100 (1), 103-144 (2020).
- Tom Dieck, S., Brandstätter, J. H. Ribbon synapses of the retina. Cell Tissue Res. 326 (2), 339-346 (2006).
- Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. . Webvision: The organization of the retina and visual. , (1995).
- Soto, F., Zhao, L., Kerschensteiner, D. Synapse maintenance and restoration in the retina by ngl2. Elife. 7, e30388 (2018).
- Kruczek, K., Swaroop, A. Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies. Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).
- O’Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: A window into human retinal development. Development. 147 (24), (2020).
- Norrie, J. L., et al. Retinoblastoma from human stem cell-derived retinal organoids. Nat Commun. 12 (1), 4535 (2021).
- Luni, C., Serena, E., Elvassore, N. Human-on-chip for therapy development and fundamental science. Curr Opin Biotechnol. 25, 45-50 (2014).
- Chahine Karam, F., et al. Human ipsc-derived retinal organoids and retinal pigment epithelium for novel intronic rpgr variant assessment for therapy suitability. J Pers Med. 12 (3), 502 (2022).
- Lo, J., et al. Therapeutic strategies for glaucoma and optic neuropathies. Mol Aspects Med. 94, 101219 (2023).
- Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3d human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), 171686 (2019).
- Cowan, C. S., et al. Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).
- Cora, V., et al. A cleared view on retinal organoids. Cells. 8 (5), 391 (2019).
- Żak, A. M. Light-induced in situ transmission electron microscopy─development, challenges, and perspectives. Nano Lett. 22 (23), 9219-9226 (2022).
- Tschulakow, A. V., Oltrup, T., Bende, T., Schmelzle, S., Schraermeyer, U. The anatomy of the foveola reinvestigated. PeerJ. 6, e4482 (2018).
- Syrbe, S., et al. Müller glial cells of the primate foveola: An electron microscopical study. Exp Eye Res. 167, 110-117 (2018).
- Xiao, J., et al. Rod bipolar cells receive cone photoreceptor inputs through both invaginating synapses and flat contacts in the mouse and guinea pig retinas. J Comp Neurol. 531 (11), 1184-1197 (2023).
- Liu, X., et al. Retinal degeneration in rpgra mutant zebrafish. Front Cell Dev Biol. 11, 1169941 (2023).
- Yang, Q., et al. Expression of α-synuclein in the mouse retina is confined to inhibitory presynaptic elements. J Comp Neurol. 531 (10), 1057-1079 (2023).
- Zhang, J., et al. Early degeneration of photoreceptor synapse in ccl2/cx3cr1-deficient mice on crb1(rd8) background. Synapse. 67 (8), 515-531 (2013).
- De Robertis, E., Franchi, C. M. Electron microscope observations on synaptic vesicles in synapses of the retinal rods and cones. J Biophys Biochem Cytol. 2 (3), 307-318 (1956).
- Frey, T. G., Mannella, C. A. The internal structure of mitochondria. Trends Biochem Sci. 25 (7), 319-324 (2000).
- Gonzalez-Cordero, A., et al. Recapitulation of human retinal development from human pluripotent stem cells generates transplantable populations of cone photoreceptors. Stem Cell Reports. 9 (3), 820-837 (2017).
- Gao, M. L., et al. Patient-specific retinal organoids recapitulate disease features of late-onset retinitis pigmentosa. Front Cell Dev Biol. 8, 128 (2020).
- Afanasyeva, T. a. V., et al. A look into retinal organoids: Methods, analytical techniques, and applications. Cell Mol Life Sci. 78 (19-20), 6505-6532 (2021).
