Direkte mikrobielle Identifizierung mit einem automatisierten mikrobiellen Identifizierungssystem zur Erleichterung der EUCAST RAST-Methode ohne Massenspektrometrie

Sepsis, ein wichtiges globales Gesundheitsproblem, wird als lebensbedrohliche Organdysfunktion definiert, die auf eine fehlregulierte Wirtsreaktion auf eine Infektion zurückzuführen ist. Die Global Burden of Diseases Study schätzt, dass es im Jahr 2017 weltweit 48,9 Millionen Fälle von Sepsis und 11 Millionen sepsisbedingte Todesfälle gab, was fast 20 % aller weltweiten Todesfälle ausmachte¹. Etwa 2/^{3 der} Blutbahninfektionen (BSI), die zum Tod führen, sind auf gramnegative bakterielle Erreger zurückzuführen². Die Haupttodesursachen bei gramnegativen (GN) sind Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa und Acinetobacter baumannii, die bei 33 bakteriellen Erregern rund 40 % der Fälle ausmachen².

Blutkulturen sind nach wie vor der Goldstandard für die Diagnose von BSI, und eine schnelle mikrobielle Identifizierung zusammen mit den Ergebnissen von antimikrobiellen Empfindlichkeitstests (AST) ist der Schlüssel zum Management. Es wurde geschätzt, dass die Mortalitätswahrscheinlichkeit um 9 % steigt, wenn die Verabreichung geeigneter antimikrobieller Mittel bei Sepsis³ stündlich verzögert wird. Die Durchlaufzeit (TAT) von mikrobiologisch positiven Blutkulturberichten mit AST-Ergebnissen beträgt mit den verfügbaren mikrobiologischen Werkzeugen in ressourcenbegrenzten Umgebungen, auch mit automatisierten Systemen, etwa 48-72 Stunden. Infolge dieser unterdurchschnittlichen TAT werden antimikrobielle Breitbandmittel empirisch eingesetzt, was zu dem aufkeimenden Problem der Antibiotikaresistenz (AMR) beiträgt. In Anbetracht dieser dringenden Notwendigkeit, die TAT für mikrobiologische Kulturtechniken für Sepsis zu reduzieren, gehen EUCAST und CLSI dazu über, AST direkt aus positiv gekennzeichneten Blutkulturflaschen (+aBC)^4,5 durchzuführen.

Im Jahr 2018 führte EUCAST erstmals die Rapid-AST-Methode (RAST) zur Bestimmung der AST nach der Kirby-Bauer-Scheibendiffusionsmethode bei kurzen Inkubationszeiten ein, d. h. 4 h, 6 h und 8 h, direkt ab +aBC ^6,7. Die Methode ist derzeit für die Bestimmung der AST für +aBCs validiert, die eine der 8 häufigsten Ursachen von BSI enthalten, nämlich E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa und A. baumannii-Komplex bei gramnegativen und Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, E. faecium und Streptococcus pneumoniae bei grampositiven Werten⁸. Die Breakpoints für die AST-Bestimmung in verschiedenen Zeitintervallen werden für die oben aufgeführten mikrobiellen Spezies angegeben. Daher ist vor der kategorischen Interpretation der AST-Ergebnisse eine mikrobielle Identifizierung erforderlich. Der RAST-Standard legt jedoch nicht fest, mit welcher Methode die mikrobielle Identifizierung innerhalb dieses Zeitrahmens möglich ist.

Die Mehrzahl der Studien, in denen die EUCAST-RAST-Methode in ihrem Umfeld evaluiert wurde, haben die massenspektrometrische mikrobielle Identifizierung nach kurzer Inkubation auf plattierten Medien verwendet, um Mikroorganismen zu identifizieren ^{9,10,11,12,13,14,15,16,17}. Massenspektrometrische Instrumente sind jedoch nicht weit verbreitet, insbesondere in Ländern mit niedrigem bis mittlerem Einkommen (LMICs), was den potenziellen Nutzen dieser Methode stark einschränkt. Nur wenige Studien haben über die Implementierung dieser Methode in ihren Zentren ohne Massenspektrometrie berichtet 18,19,20. Tayşi et ^al.18 berichteten über eine breite Kategorisierung der GN unter Enterobacterales, Pseudomonas und Acinetobacter spp. basierend auf der Morphologie der Gramfärbung und dem Oxidase-Test, bevor die AST-Ergebnisse interpretiert wurden. In anderen Studien dieses Zentrums, von Gupta et ^al.19 und Siddiqui et ^al.20, wurde die mikrobielle Identifizierung auf Speziesebene durchgeführt, indem ein Bakterienpellet aus dem positiv markierten Blut-Brühe-Gemisch hergestellt und mit den herkömmlichen biochemischen Tests geimpft wurde. Während Tayşi et ^al.18 sich nicht zur Genauigkeit der mikrobiellen Identifizierung mit ihrem Ansatz äußerten, berichteten Gupta et ^al.19, dass mit ihrem Ansatz in 165/176 (94%) Fällen ein RAST-meldepflichtiger gramnegativer (RR-GN), d.h. entweder von E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa und A. baumannii Komplex. Bei letzterem Ansatz erfolgte die Ablesung der RAST-Ergebnisse jedoch retrospektiv unter Verwendung von Grenzwerten mit einem Zonendurchmesser von 8 Stunden erst nach der vollständigen Inkubation der konventionellen biochemischen Ergebnisse, d. h. 18-24 Stunden nach der Inokulation, und die durchschnittliche Zeit für die Berichterstattung betrug etwa 2 Tage.

Um die TAT klinischer Berichte weiter zu reduzieren, schlagen wir eine alternative Methodik vor, die eine frühzeitige Identifizierung von GN in +aBCs mit aMIAST ermöglicht. Vor der Einführung von massenspektrometrischen mikrobiellen Identifizierungssystemen galten diese automatisierten Identifizierungssysteme als Standard für die mikrobielle Identifizierung, bei denen die Identifizierung durch kolorimetrische und/oder fluorometrische Veränderungen ermöglicht wurde, die durch Testbakterien induziert wurden, wenn sie in miniaturisierten biochemischen Tests in einer Kassette befunden und die Ergebnisse mit ihrer Isolatdatenbank abgeglichen wurden. Die durchschnittliche Zeit bis zur Identifizierung in diesen Systemen beträgt etwa 4 bis 8 Stunden, ist jedoch durch die Tatsache begrenzt, dass die Hersteller empfehlen, Mikroben über Nacht zu vermehren, bevor ihre jeweiligen Ausweise geimpft werden können. Diese Anforderung schränkt ihren Nutzen bei der Verkürzung der Zeit bis zur Berichterstellung stark ein.

Nur wenige Studien haben Methoden zur direkten Identifizierung von Mikroben aus +aBCs unter Verwendung dieser automatisierten Systeme^evaluiert 21,22,23,24,25,26,27. Im Fall von +aBCs, die monomorphe GN enthielten, zeigte die Mehrzahl der Studien eine ausgezeichnete Übereinstimmung zwischen der direkten Inokulation mit Bakterienpellets aus positivem Blut-Brühe-Gemisch und der Standard-Kolonieinkubation. Bei den Grampositiven waren die Konkordanzraten jedoch suboptimal. Da die durchschnittliche Zeit bis zur Positivität von +aBCs zwischen 8 h und 16 h liegt und die Identifizierung von GN in einem automatisierten mikrobiellen Identifizierungssystem ~4 h bis 8 h dauert, stellen wir die Hypothese auf, dass wir durch die Verwendung des direkten Inokulationsprotokolls bei der automatisierten mikrobiellen Identifizierung die klinische Befundung von +aBCs mit GN mit einem RR-GN innerhalb von 24 Stunden nach Probeneingang abschließen können.

Schauplatz für die Studie
Die vorliegende Studie wurde von Januar bis Oktober 2023 im klinischen Bakteriologielabor eines akademischen Instituts für tertiäre Versorgung von nationaler Bedeutung (INI) mit 950 Betten in Zentralindien durchgeführt. Das Labor ist mit einem kontinuierlichen Blutkulturüberwachungssystem (CBCMS) und aMIAST ausgestattet. Das bakteriologische Labor ist rund um die Uhr in Betrieb und steht Technikern und Mikrobiologen für die Bearbeitung und Meldung von positiv gekennzeichneten Blutkulturflaschen (+aBCs) zur Verfügung.

Hier eingesetzte mikrobielle Methoden
Der Arbeitsablauf der Studie ist in Abbildung 1 dargestellt. Die +aBCs, die monomorphe GNs (+naBC) zeigten, wurden durch direkte Inokulation der entsprechenden Identifikationskarten verarbeitet, um die Identifizierung und AST unter Verwendung des EUCAST-RAST-Protokolls zu ermöglichen. Diese Ergebnisse wurden mit der Standard-of-Care (SoC)-Methode für +aBCs verglichen, d.h. der Subkultivierung auf konventionellen plattierten Medien durch Schafblut-Agar (SBA), Schokoladen-Agar (CA) und MacConkey-Agar (MA), aerobe Inkubation für 16 bis 24 Stunden, gefolgt von Identifizierungs- und AST-Karten, die von aMIAST gegeben wurden, wenn isolierte Kolonien auftreten. Blutkulturen, die grampositive Kokken, grampositive Bazillen, knospende Hefezellen und ≥2 verschiedene Mikroorganismen auf der anfänglichen Grammfärbung oder plattierten Medien zeigten, wurden von der Studie ausgeschlossen.