Summary

Synthese und Assay von Vibrio Quorum Sensing Inhibitoren

Published: May 31, 2024
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Summary

Thiophenesulfonamidverbindungen sind potente und spezifische Inhibitoren der Vibrio quorum sensing Regulatoren LuxR/HapR, die deren Aktivität in vivo blockieren und so die Transkription von Genen für Virulenz, Motilität und Biofilme verhindern. Dieses Protokoll beschreibt, wie diese Verbindungen synthetisiert, in silico modelliert und in vivo auf ihre Aktivität gegen LuxR/HapR getestet werden.

Abstract

Bakterien ermitteln die Anzahl der lokalen Populationen mithilfe von Quorum Sensing, einer Methode der Zell-Zell-Kommunikation, die häufig zur Kontrolle des Verhaltens von Bakterien eingesetzt wird. Bei Vibrio-Spezies kontrollieren die Master-Quorum-Sensing-Regulatoren LuxR/HapR Hunderte von Quorum-Sensing-Genen, von denen viele Virulenz, Stoffwechsel, Motilität und mehr beeinflussen. Thiophenesulfonamide sind potente Inhibitoren von LuxR/HapR, die die Ligandentasche in diesen Transkriptionsfaktoren binden und die nachgeschaltete Genexpression des Quorum Sensing blockieren. Diese Klasse von Verbindungen diente als Grundlage für die Entwicklung einer Reihe einfacher, robuster und lehrreicher Verfahren für College-Studenten, um ihre chemischen und biologischen Fähigkeiten mithilfe eines CURE-Modells zu assimilieren: kursbasierte Forschungserfahrung im Grundstudium. Es werden optimierte Protokolle beschrieben, die drei Lernphasen in einer iterativen und multidisziplinären Plattform umfassen, um die Studierenden in ein einjähriges CURE einzubeziehen: (1) Entwicklung und Synthese neuer niedermolekularer Inhibitoren auf Basis des Thiophensulfonamid-Kerns, (2) Verwendung von Strukturmodellierung zur Vorhersage der Bindungsaffinität zum Ziel und (3) Assay der Verbindungen auf Wirksamkeit in mikrobiologischen Assays gegen spezifische Vibrio LuxR/HapR-Proteine. Der beschriebene Reporter-Assay, der in E. coli durchgeführt wurde, sagt erfolgreich die Wirksamkeit der Verbindungen gegen Zielproteine in der nativen Vibrio-Spezies voraus.

Introduction

Bakterien erfassen die Populationsdichte und die Art der Zellen in der Nähe mithilfe eines Zell-Zell-Kommunikationsprozesses, der als Quorum Sensing (QS)1 bezeichnet wird. Verschiedene Bakteriengruppen nutzen QS, um verschiedene Verhaltensweisen zu steuern, wie z. B. Motilität, Biofilmbildung, Virulenzfaktorsekretion und mehr. Die Proteine und Signale, die an QS beteiligt sind, unterscheiden sich stark zwischen Bakterien. Bei Vibrio-Spezies verwendet das QS-Signalsystem überwiegend membrangebundene hybride Histidin-Kinase-Rezeptoren, die spezifische verwandte Signale kleiner Moleküle erkennen, die als Autoinduktorenbezeichnet werden 2 (Abbildung 1). Diese Rezeptoren steuern den Fluss von Phosphat durch das System zu einem Reaktionsregulator, der kleine RNAs transkribiert. Die Produktion von sRNAs verändert die Produktion des Master-Quorum-Sensing-Regulators, der als eine konservierte Gruppe von Proteinen definiert ist, die zusammen als LuxR/HapR3 bezeichnet wird. So wird bei niedrigen Zelldichten die mRNA, die für LuxR/HapR kodiert, durch sRNA-Targeting abgebaut, und bei hoher Zelldichte wird das LuxR/HapR-Protein in maximalen Konzentrationen produziert (überprüft in Ball et al.3).

Die LuxR/HapR-Gruppe von Proteinen gehört zur großen Gruppe der TetR-Proteine, die durch das Vorhandensein einer Helix-Turn-Helix in der DNA-Bindungsdomäne, die Bildung eines funktionellen Homodimers und typischerweise den Einschluss einer Ligandenbindungsdomänedefiniert ist 4. Die Vibrio LuxR/HapR-Proteine erfüllen alle diese Kriterien, obwohl noch kein Ligand identifiziert wurde. Das LuxR/HapR-Protein in allen untersuchten Vibrio-Spezies steuert zahlreiche nachgeschaltete Verhaltensweisen, von denen viele als wichtig für die Pathogenese bekannt sind: Produktion von Biofilmen, Proteasen, Zelltoxinen, Hämolysinen, Typ-III-Sekretion und Typ-VI-Sekretionskomplexenund mehr 3. Die Deletion des LuxR/HapR-Proteins führt zu einer Abnahme oder einem Verlust der Virulenz in den Wirtssystemen 5,6,7, was zu der Hypothese führt, dass die Hemmung dieser Proteine eine praktikable Strategie ist, um dem Fortschreiten der Krankheit entgegenzuwirken. Vibrio-Arten verursachen die Vibriose-Krankheit bei Meeresorganismen, einschließlich Fischen, Schalentieren und Korallen, sowie bei Menschen, die mit bestimmten Arten in Kontakt kommen oder diese aufnehmen.

Frühere Forschungen haben eine Reihe von Thiophenesulfonamidverbindungen identifiziert, die spezifisch an die Ligandenbindungsdomäne von LuxR/HapR-Proteinen in mehreren Vibrio-Spezies binden, um deren Funktion zu blockieren 5,8,9 (Abbildung 1). Mit Hilfe eines Reporterscreenings in E. coli wurden die Verbindungen identifiziert und anschließend im nativen Vibrio getestet, was eine hohe Korrelation zwischen der Wirkung in den heterologen E. coli und der Wirksamkeit in der Vibrio9 zeigte. Diese Verbindungen sind einfach in einem einzigen Schritt zu synthetisieren und eignen sich daher ideal für die Synthese kleiner Bibliotheken im Rahmen eines Labors in chemischer Biologie. Über eine dreiwöchige, kursbasierte Undergraduate Research Experience (CURE), die auf diesem molekularen Gerüst basierte, wurde bereits berichtet8. Dieses dreiwöchige Modul wurde in diesem einjährigen CURE weiter optimiert, gestrafft und erweitert, das auf die Hemmung von LuxR/HapR-Proteinen in verschiedenen Vibrio-Spezies abzielt.

Protocol

Die Einzelheiten zu den Reagenzien und den für die Studie verwendeten Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt. 1. Design und Synthese von Thiophenesulfonamid-Bibliotheken HINWEIS: Thiophenesulfonamid-Inhibitoren wie 3-Phenyl-1-(Thiophen-2-ylsulfonyl)-1-H-pyrazol (PTSP) werden über die einstufige basengeförderte Kondensation 8,9 synthetis…

Representative Results

Als repräsentative Ergebnisse sind Daten von drei Thiophenesulfonamid-Verbindungen enthalten, die von Studenten für die Verbindungen 1A, 2B und 3B synthetisiert wurden (Abbildung 5A-C; ausführlich beschrieben in Newman et al.9). Jede Verbindung wurde im E. coli-Stamm getestet, der V. campbellii LuxR exprimierte, und unter Verwendung des Reporterplasmids pJV064. Die normie…

Discussion

Dieses CURE wurde ursprünglich als verkürztes zweistufiges, dreiwöchiges Protokoll (Design/Synthese und Assay) entwickelt und in fünf Semestern im Rahmen eines organischen Praktikums der Oberstufeimplementiert 8. Seit dem ursprünglichen Bericht wurde das Computermodellierungsmodul hinzugefügt und der E. coli-Assay für unerfahrene Forscher optimiert. Das daraus resultierende dreistufige, zweisemestrige Protokoll wurde dreimal im Rahmen des Arts and …

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die in dieser Veröffentlichung berichtete Forschung wurde vom National Institute of General Medical Sciences der National Institutes of Health unter der Fördernummer R35GM124698 an JVK unterstützt. Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und gibt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health wieder.

Materials

2-thiophensulfonyl chloride Ambeed A258464
3-Phenyl-1H-pyrazole Ambeed A104401 98%
96-well clear bottom black plates USA Scientific 5665-5090Q 96-well polystyrene uClear black TC plate with lid, clear flat bottom, sterile, 8/sleeve, 32/case 
Autodock Tools http://mgltools.scripps.edu/downloads
Autodock Vina https://vina.scripps.edu 
Chloramphenicol
DMSO
ethyl acetate Fisher Scientific AA31344M4 Reagent grade
hexanes Fisher Scientific H291
Kanamycin
magnesium sulfate Fisher Scientific M65-500 Anhydrous
Microporous Film USA Scientific 2920-1010 Microporous Film, -20degC to +80degC, 50/box, Sterilized
molview molview.org
NaCl
Protein Databank https://www.rcsb.org/
Pymol https://pymol.org/2/
Qualitative filter paper Fisher Scientific 09-805-342 Cytiva Whatman™ Qualitative Filter Paper: Grade 1 Circles, 47 mm
Silica gel Sorbtech 30930M-25 Silica Gel, Standard Grade, 60A, 40-63um (230 x 400 mesh)
Sodium hydride Millipore Sigma 452912 60 % dispersion in mineral oil
Tetrahydrofuran Fisher Scientific MTX02847 Tetrahydrofuran, anhydrous, 99.9%, ACS Grade, DriSolv
TLC Plates Sorbtech 1634067 Silica gel TLC plates, aluminum backed
Tryptone
webina https://durrantlab.pitt.edu/webina/
Yeast Extract

Referenzen

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Diesen Artikel zitieren
Brown, L. C., Chopra, J., Horness, R. E., van Kessel, J. C. Synthesis and Assay of Vibrio Quorum Sensing Inhibitors. J. Vis. Exp. (207), e66582, doi:10.3791/66582 (2024).

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