Op CRISPR gebaseerde modulaire assemblage voor high-throughput constructie van een UAS-cDNA/ORF-plasmidebibliotheek
Summary
We presenteren een protocol voor CRISPR-gebaseerde modulaire assemblage (CRISPRmass), een methode voor high-throughput constructie van UAS-cDNA/ORF-plasmidebibliotheek in Drosophila met behulp van openbaar beschikbare cDNA/ORF-bronnen. CRISPRmass kan worden toegepast op het bewerken van verschillende plasmidebibliotheken.
Abstract
Functionele genomics-screening biedt een krachtige benadering van de functie van sonde-gen en is gebaseerd op de constructie van genoombrede plasmidebibliotheken. Conventionele benaderingen voor de bouw van plasmidebibliotheken zijn tijdrovend en arbeidsintensief. Daarom hebben we onlangs een eenvoudige en efficiënte methode ontwikkeld, CRISPR-gebaseerde modulaire assemblage (CRISPRmass), voor high-throughput constructie van een genoombrede stroomopwaartse activerende sequentie-complementaire DNA/open leesframe (UAS-cDNA/ORF) plasmidebibliotheek. Hier presenteren we een protocol voor CRISPRmass, met als voorbeeld de constructie van een op GAL4/UAS gebaseerde UAS-cDNA/ORF-plasmidebibliotheek. Het protocol omvat massaal parallelle reageerbuisreacties in twee stappen, gevolgd door bacteriële transformatie. De eerste stap is het lineariseren van de bestaande complementaire DNA (cDNA) of open leesframe (ORF) cDNA- of ORF-bibliotheekplasmiden door de gedeelde stroomopwaartse vectorsequenties naast het 5′-uiteinde van cDNA’s of ORF’s te knippen met behulp van CRISPR/Cas9 samen met single guide RNA (sgRNA), en de tweede stap is om een UAS-module in de gelineariseerde cDNA- of ORF-plasmiden in te voegen met behulp van een eenstapsreactie. CRISPRmass maakt de eenvoudige, snelle, efficiënte en kosteneffectieve constructie van verschillende plasmidebibliotheken mogelijk. De UAS-cDNA/ORF-plasmidebibliotheek kan worden gebruikt voor gain-of-function-screening in gekweekte cellen en voor het construeren van een genoombrede transgene UAS-cDNA/ORF-bibliotheek in Drosophila.
Introduction
Onbevooroordeelde genetische screening van het hele genoom is een krachtige benadering voor het identificeren van genen die betrokken zijn bij een bepaald biologisch proces en het ophelderen van het mechanisme ervan. Daarom wordt het veel gebruikt op verschillende gebieden van biologisch onderzoek. Ongeveer 60% van de Drosophila-genen is geconserveerd bij mensen 1,2, en ~75% van de menselijke ziektegenen heeft homologen in Drosophila3. Genetische screening is voornamelijk onderverdeeld in twee soorten: functieverlies (LOF) en functiewinst (GOF). LOF genetische screenings in Drosophila hebben een cruciale rol gespeeld bij het ophelderen van mechanismen die bijna elk aspect van de biologie beheersen. De meerderheid van de Drosophila-genen heeft echter geen duidelijke LOF-fenotypes4, en daarom is GOF-screening een belangrijke methode om de functie van die genen te bestuderen 4,5.
Het binaire GAL4/UAS-systeem wordt vaak gebruikt voor weefselspecifieke genexpressie in Drosophila6. In dit systeem brengt het weefsel specifiek gisttranscriptieactivator GAL4 tot expressie die bindt aan het GAL4-responsieve element (UAS) en daardoor de transcriptie van de stroomafwaartse genetische componenten (bijv. cDNA en ORF) activeert6. Om genoombrede GOF-screenings in Drosophila uit te voeren, moeten we een genoombrede UAS-cDNA/ORF-plasmidebibliotheek construeren en vervolgens een transgene UAS-cDNA/ORF-bibliotheek in Drosophila.
Het opbouwen van een genoombrede UAS-cDNA/ORF-plasmidebibliotheek met conventionele methoden uit openbaar beschikbare cDNA/ORF-klonen is tijdrovend en arbeidsintensief, aangezien elk gen geïndividualiseerde ontwerpen vereist, waaronder primerontwerp en -synthese, polymerasekettingreactie (PCR) en gelzuivering, sequencing, restrictievergisting, enzovoort 7,8. Daarom is de constructie van zo’n plasmidebibliotheek een snelheidsbeperkende stap in het creëren van een genoombrede transgene UAS-cDNA/ORF-bibliotheek in Drosophila. Onlangs hebben we dit probleem met succes opgelost door een nieuwe methode te ontwikkelen, CRISPR-gebaseerde modulaire assemblage (CRISPRmass)9. De kern van CRISPRmass is het manipuleren van de gedeelde vectorsequenties van een plasmidebibliotheek door een combinatie van genbewerkingstechnologie en naadloze kloontechnologie.
Hier presenteren we een protocol voor CRISPRmass, dat massaal parallelle tweestaps reageerbuisreacties omvat, gevolgd door bacteriële transformatie. CRISPRmass is een eenvoudige, snelle, efficiënte en kosteneffectieve methode die in principe kan worden gebruikt voor high-throughput constructie van verschillende plasmidebibliotheken.
CRISPRmass-strategie
De procedure van CRISPRmass begint met parallelle reageerbuisreacties in twee stappen voorafgaand aan de transformatie van Escherichia coli (E. coli) (Figuur 1). Stap 1 is de splitsing van de identieke vectorruggengraat van de cDNA/ORF-plasmiden door Cas9/sgRNA. Een ideale splijtingsplaats grenst aan het 5′ uiteinde van cDNA/ORF. De decolletéproducten hoeven niet gezuiverd te worden. Stap 2 is het invoegen van een vectorspecifieke UAS-module in de Cas9/sgRNA gelineariseerde cDNA/ORF-plasmiden door Gibson-assemblage (hierna eenstapsreactie genoemd), wat resulteert in UAS-cDNA/ORF-plasmiden. De 5′ en 3′ terminale sequenties van een UAS-module overlappen met die van de gelineariseerde cDNA/ORF-plasmiden, waardoor de eenstapsreactie mogelijk is.
De eenstapsreactieproducten worden direct onderworpen aan E. coli-transformatie . Theoretisch kunnen alleen de gewenste UAS-cDNA/ORF-kolonies groeien op Luria-Bertani (LB)-platen die selectieantibiotica bevatten die overeenkomen met het antibioticaresistentiegen van de UAS-module. De UAS-module bestaat uit een UAS-kernmodule, een antibioticaresistentiegen dat verschilt van dat van cDNA- of ORF-plasmiden, en de 5′ en 3′ terminale sequenties. Een kern-UAS-module bestaat uit 10 kopieën van UAS, een Hsp70 minimale promotor, een attB-sequentie voor phiC31-gemedieerde genomische integratie en een mini-witte transformatiemarker voor Drosophila7.
Protocol
Representative Results
Discussion
De meest kritische stappen van CRISPRmass zijn het ontwerp van sgRNA’s en de evaluatie van sgRNA’s. Selectie van zeer efficiënte sgRNA’s voor Cas9 is de sleutel tot het succes van CRISPRmass. Als er zeer weinig of geen kolonies worden waargenomen op de meeste antibioticabevattende LB-platen na de transformatie van E. coli met assemblageproducten met een eenstapsreactie, controleer dan de plasmidevertering door middel van agarosegelelektroforese. Als plasmiden niet goed worden verteerd, controleer dan de Cas9-activiteit,…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesponsord door de National Natural Science Foundation of China (32071135 en 31471010), het Shanghai Pujiang-programma (14PJ1405900) en de Natural Science Foundation of Shanghai (19ZR1446400).
Materials
| Aluminum Cooling Block | Aikbbio | ADMK-0296 | To perform bacterial transformation |
| DEPC-Treated Water | Invitrogen | AM9906 | |
| Gel Extraction Kit | Omega | D2500 | To purify DNA from agarose gel |
| Gel Imaging System | Tanon | 2500B | |
| HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit | NEB | E2050 | |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | NEB | E2621 | |
| Plasmid Mini Kit | Omega | D6943 | To isolate plasmid DNA from bacterial cells |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix | NEB | M0494 | |
| S. pyogenes Cas9 | GenScript | Z03386 | |
| Shaking Incubator | Shanghai Zhichu | ZQLY-180V | |
| T series Multi-Block Thermal Cycler | LongGene | T20 | To perform PCR |
| Trans10 Chemically Competent Cell | TranGen BioTech | CD101 | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Shimadzu | BioSpec-nano | To measure concentration of DNA or RNA |
Referenzen
- Adams, M. D., et al. The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science. 287 (5461), 2185-2195 (2000).
- Rubin, G. M., et al. Comparative genomics of the eukaryotes. Science. 287 (5461), 2204-2215 (2000).
- Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Res. 11 (6), 1114-1125 (2001).
- Miklos, G. L., Rubin, G. M. The role of the genome project in determining gene function: insights from model organisms. Cell. 86 (4), 521-529 (1996).
- St Johnston, D. The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster. Nat Rev Genet. 3 (3), 176-188 (2002).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Bischof, J., et al. A versatile platform for creating a comprehensive UAS-ORFeome library in Drosophila. Development. 140 (11), 2434-2442 (2013).
- Xu, R., et al. A large-scale functional approach to uncover human genes and pathways in Drosophila. Cell Res. 18 (11), 1114-1127 (2008).
- Wei, P., Xue, W., Zhao, Y., Ning, G., Wang, J. CRISPR-based modular assembly of a UAS-cDNA/ORF plasmid library for more than 5500 Drosophila genes conserved in humans. Genome Res. 30 (1), 95-106 (2020).
- Rubin, G. M., et al. A Drosophila complementary DNA resource. Science. 287 (5461), 2222-2224 (2000).
- Stapleton, M., et al. The Drosophila gene collection: identification of putative full-length cDNAs for 70% of D. melanogaster genes. Genome Res. 12 (8), 1294-1300 (2002).
- Yang, X., et al. A public genome-scale lentiviral expression library of human ORFs. Nat Meth. 8 (8), 659-661 (2011).
