Summary

Strategien zur Verbesserung der Kultivierung anaerober Bakterien aus dem Magen-Darm-Trakt von Hühnern

Published: May 10, 2024
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Summary

Das Protokoll stellt zwei Methoden vor, um die Isolierung von anaeroben Darmbakterien zu verbessern. Die erste konzentriert sich auf die Isolierung einer Vielzahl von Bakterien mit unterschiedlichen Nährmedien. Die zweite konzentriert sich auf die Kultivierungsschritte einer bestimmten mikrobiellen Gruppe, die möglicherweise Myo-Inositol assimiliert, um ihre ökologische Bedeutung vollständig zu verstehen.

Abstract

Der Magen-Darm-Trakt (GIT) von Hühnern ist ein komplexes Ökosystem, das Billionen von Mikroben beherbergt, die eine entscheidende Rolle für die Physiologie des Wirts, die Verdauung, die Nährstoffaufnahme, die Reifung des Immunsystems und die Verhinderung des Eindringens von Krankheitserregern spielen. Für eine optimale Tiergesundheit und Produktivität ist es unerlässlich, diese Mikroorganismen zu charakterisieren und ihre Rolle zu verstehen. Während der GIT von Geflügel ein Reservoir an Mikroorganismen mit potenziellen probiotischen Anwendungen enthält, ist der größte Teil der Vielfalt noch unerforscht. Um unser Verständnis der unkultivierten mikrobiellen Vielfalt zu verbessern, sind konzertierte Anstrengungen erforderlich, um diese Mikroorganismen in Kultur zu bringen. Die Isolierung und Kultivierung von GIT-besiedelnden Mikroorganismen liefert reproduzierbares Material, einschließlich Zellen, DNA und Metaboliten, das neue Einblicke in Stoffwechselprozesse in der Umwelt bietet. Ohne Kultivierung bleibt die Rolle dieser Organismen in ihrer natürlichen Umgebung unklar und auf eine deskriptive Ebene beschränkt. Unser Ziel ist es, Kultivierungsstrategien zu implementieren, die darauf abzielen, die Isolierung einer Vielzahl von anaeroben Mikroben aus dem GIT des Huhns zu verbessern, indem wir multidisziplinäres Wissen aus der Tierphysiologie, Tierernährung, Metagenomik, Futtermittelbiochemie und modernen Kultivierungsstrategien nutzen. Darüber hinaus sind wir bestrebt, die Anwendung geeigneter Praktiken für die Probenahme, den Transport und die Medienvorbereitung zu implementieren, von denen bekannt ist, dass sie den Erfolg der Isolierung beeinflussen. Geeignete Methoden sollten eine gleichbleibend sauerstofffreie Umgebung, optimale atmosphärische Bedingungen, eine angemessene Inkubationstemperatur des Wirts und Vorkehrungen für spezifische Ernährungsbedürfnisse in Übereinstimmung mit ihren besonderen Bedürfnissen gewährleisten. Durch die Befolgung dieser Methoden wird die Kultivierung nicht nur reproduzierbare Ergebnisse für die Isolierung liefern, sondern auch die Isolierungsverfahren erleichtern und so ein umfassendes Verständnis des komplizierten mikrobiellen Ökosystems innerhalb des GIT des Huhns fördern.

Introduction

Das Wiederaufleben der Kultivierung bei der Untersuchung von Mikroorganismen hat Erkenntnisse aus metagenomischen Studien ergänzt, indem es Material zum Testen von metabolischen Hypothesen lieferte, die zuvor nur teilweise beschrieben und quantifiziert wurden. Die Kultivierung von Darmbakterien liefert Material, um die zukünftige Forschung zu mikrobiellen Wirt-Interaktionen zu unterstützen, gezielte Besiedlungsstudien zu erleichtern und molekulare Interaktionsstudien zu verbessern 1,2,3. Die gewonnenen Erkenntnisse über gastrointestinale Mikroorganismen haben die Ernährung und das Wohlergehen der Tiere verbessert, indem sie die Futterformulierungen beeinflusst und die Nährstoffverfügbarkeit erhöhthaben 4. Dieses Verständnis hat zu Leistungsverbesserungen bei der Nutzung präbiotischer und probiotischer Wechselwirkungen beigetragen. Es bedarf jedoch eingehender Forschung, um ein vollständiges Verständnis dafür zu erlangen, wie biochemische und physikalisch-chemische Bedingungen zusammenwirken und sich auf das mikrobielle Profil und seine Struktur auswirken. Um dieses Ziel zu erreichen, ist der Anbau nach wie vor unerlässlich und dient als entscheidendes Instrument, um die komplizierte Dynamik der mikrobiellen Gemeinschaften im Magen-Darm-Milieu zu erforschen.

Im Gegensatz zu den umfangreichen Forschungen über Mikroben, die mit dem menschlichen Darm in Verbindung gebracht werden, und klinischen Kultivierungsstudien5 wurde bei Berichten über Mikroorganismen aus Nutztieren überwiegend eine begrenzte Anzahl von Medien zur Isolierung verwendet, was die Vielfalt der Isolate möglicherweise einschränkt 2,3. Darüber hinaus wurden Verbesserungen in der Formulierung von Medien und Studien zur Wechselwirkung von Phosphat und Salzen mit Agar, wie sie von Tanaka et al. und Kawasaki et al. erläutert wurden, noch nicht für Darm-Mikrobiom-Studien implementiert 6,7,8,9.

Es wurde berichtet, dass Myo-Inositol (MI) als semi-essentielle Substanz eine zentrale Rolle bei verschiedenen metabolischen, physiologischen und regulatorischen Prozessen spielt10,11. Dazu gehören die Beteiligung an der Knochenmineralisierung, der Entwicklung der Brustmuskulatur, der zellulären Signalgebung, der Förderung des Eisprungs und der Fertilität, der Modulation der neuronalen Signalübertragung und der Rolle als Regulator der Glukosehomöostase und der Insulinregulation bei Geflügel10,11. MI spielt eine Rolle als Vorläufer durch seine Umwandlung innerhalb zentraler biochemischer Prozesse, einschließlich des Glykolyse-/Glukoneogeneseprozesses, des Zitronensäurezyklus und des Pentosephosphatwegs. Darüber hinaus dient es auch als Vorläufer von Phosphatidylinositol (PI), das weiter am Glycerophospholipidstoffwechsel beteiligt ist12. Nur wenige Untersuchungen haben berichtet, dass die Metabolisierung von MI zu Veränderungen der Knochenstabilität und der Leistung der Tiere führt. Dazu gehören Verbesserungen der Futterverwertungsrate und der Körpergewichtszunahme, was die Auswirkungen nach der Aufnahme und Verwertung im Tier zeigt13,14. Der Weg der MI-Metabolisierung und ihre Auswirkungen auf den Geflügelstoffwechsel sind jedoch nach wie vor schwer fassbar15. Darüber hinaus deuten nur wenige Studien auf eine mögliche Rolle von Bakterien bei der MI-Nutzung hin, insbesondere in Regionen mit hoher metabolischer Aktivität wie dem Ileum 16,17,18,19.

Die Bemühungen zur Kultivierung von Bakterien aus dem GIT von Tieren zielen darauf ab, genomische Datenbanken zu verbessern und die Forschung auszuweiten, genombasierte Hypothesen zu verifizieren und die ökologische Bedeutung dieser Ressourcen zu verstehen20. Das Ziel dieser Arbeit ist es, Strategien für die bakterielle Kultivierung aus dem GIT von Hühnern zu verbessern, um die Isolationsvielfalt und die gezielte Isolierung einer ökologischen Interessengruppe, die Myo-Inositol assimiliert und metabolisiert, zu verbessern.

Protocol

Das Protokoll gliedert sich in vier Teile: Probenahme, Isolierung der Bakterien, Identifizierung und Konservierung der gewonnenen Mikroorganismen. Die genehmigten Erlaubnisse für die Verwendung von Tieren wurden von der Ethikkommission des Regierungspräsidiums Tübingen mit den Zulassungsnummern HOH50/17 TE und HOH67-21TE erteilt. 1. Gewinnung von Proben für die Kultivierung von anaeroben Bakterien Haltung von TierenHaltun…

Representative Results

Überwachung der anaeroben Bedingungen während des TransportsAufgrund der Zugabe von Natriumresazurin deutet die Änderung der Farbe der Transportlösung zu rosa vor dem Transfer der Probe in das Röhrchen auf eine Störung oder ein Versagen bei der Aufrechterhaltung der anaeroben Bedingungen hin. Daher wurde auf die Verwendung der Röhre mit Farbänderung während des Transports verzichtet und es wurden nur die Röhren verwendet, die keine Farbänderung zeigten, wi…

Discussion

Der Zweck dieser Methodik besteht darin, die Kultivierung anaerober Darmbakterien zu verbessern, indem die Qualität der Probenahmebedingungen, der Probenverarbeitung sowie der Medienformulierung und -vorbereitung verbessert wird. Bei der Formulierung der Nährmedien müssen die physikalisch-chemischen Bedingungen der Proben (pH-Wert, Verfügbarkeit von Kohlenstoff, Stickstoff und Cofaktoren) berücksichtigt werden. Im Vergleich zu Bakterienkultursammlungen von Schweinen, Menschen oder M…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren würdigen das Partnerschaftsprogramm Rehovot-Hohenheim und die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SE 2059/7-2. Dieses Projekt wurde im Rahmen der Forschergruppe P-FOWL (FOR 2601) entwickelt.

Materials

Acetic acid VWR 20104.334
Agar VWR 97064-332
Ammonium chloride Carl Roth P726.1
Anaerobic station Don Whitley Scientific A35 HEPA
Butyric acid Merck 8.0045.1000
Calcium chloride dihydrate  VWR 97061-904
Centrifuge Eppendorf 5424R
Chicken lysozyme (Muramidase) VWR 1.05281.0010
Cysteine VWR 97061-204
Dextrose VWR 90000-908
Di-potassium hydrogen phosphate Carl Roth P749.1
EDTA Carl Roth 8043.2
Legehennen/ Junghennenfutter Deutsche Tiernahrung Cremer GmbH & Co. KG, Düsseldorf, Germany
MagAttract HMW DNA Kit Qiagen 67563
Magnesium chloride Carl Roth 2189.1
Mixed gas (80% N2 (quality level 5.0), 15% CO2 (quality level 3.0) and 5% H2 (quality level 5.0)) Westfalen Gase GmbH, Germany
Mutanolysin, recombinant (lyophilisate) A&A Biotechnology 1017-10L
Myo-inositol Carl Roth 4191.2
PBS 1X ChemSolute 8418.01
Potassium dihydrogen phosphate Carl Roth 3904.2
Propionic acid Carl Roth 6026.1
QuantiFluor dsDNA System Promega E2671
RNAse A  QIAGEN Ribonuclease A (RNase A)  19101
Sodium chloride VWR 27800.291
Sodium resazurin VWR 85019-296
Sodium thioglycolate Sigma-Aldrich 102933
Soy Peptone, GMO-Free, Animal-Free VWR 97064-186
Thermocycler Bio-Rad T100
Tryptone Carl Roth 8952.1
Tween80 Carl Roth 9139.2
Vitamin mix (supplement) VWR 968290NL
Vortex Star Lab 07127/92930
Yeast Extract Carl Roth 9257.05
β-D-Fructose VWR 53188-23-1

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Diesen Artikel zitieren
Naithani, H., Rios-Galicia, B., Camarinha Silva, A., Seifert, J. Strategies to Enhance Cultivation of Anaerobic Bacteria from Gastrointestinal Tract of Chicken. J. Vis. Exp. (207), e66570, doi:10.3791/66570 (2024).

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