Die dezellularisierte Milzmatrix (DSM) bietet vielversprechende Anwendungen im Bereich des Tissue Engineering in der Leber. Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Vorbereitung des DSM von Ratten, das die Entnahme von Rattenmilz, ihre Dezellularisierung durch Perfusion und die Bewertung des resultierenden DSM zur Bestätigung seiner Eigenschaften umfasst.
Die Lebertransplantation ist die primäre Behandlung von Lebererkrankungen im Endstadium. Der Mangel und die unzureichende Qualität der Spenderorgane machen jedoch die Entwicklung alternativer Therapien erforderlich. Biokünstliche Lebern (BALs), die eine dezellularisierte Lebermatrix (DLM) verwenden, haben sich als vielversprechende Lösungen herausgestellt. Die Beschaffung geeigneter DLMs bleibt jedoch eine Herausforderung. Die Verwendung einer dezellularisierten Milzmatrix (DSM) wurde als Grundlage für BALs erforscht und bietet eine leicht verfügbare Alternative. In dieser Studie wurde die Milz von Ratten unter Verwendung einer Kombination aus Gefrier-Auftau-Zyklen und Perfusion mit Dezellularisierungsreagenzien entnommen und dezellularisiert. Das Protokoll bewahrte die Mikrostrukturen und Komponenten der extrazellulären Matrix (ECM) innerhalb des DSM. Der vollständige Dezellularisierungsprozess dauerte ca. 11 h, was zu einer intakten EZM innerhalb des DSM führte. Die histologische Analyse bestätigte die Entfernung zellulärer Komponenten unter Beibehaltung der Struktur und Zusammensetzung der EZM. Das vorgestellte Protokoll bietet eine umfassende Methode zur Gewinnung von DSM und bietet potenzielle Anwendungen im Bereich des Lebergewebe-Engineerings und der Zelltherapie. Diese Erkenntnisse tragen zur Entwicklung alternativer Ansätze für die Behandlung von Lebererkrankungen im Endstadium bei.
Die Lebertransplantation ist nach wie vor die einzige definitive Behandlung für Lebererkrankungen im Endstadium 1,2,3. Der kritische Mangel und die abnehmende Qualität von Spenderorganen haben jedoch den Bedarf an alternativen Behandlungen erhöht4. Im Bereich der regenerativen Medizin haben sich biokünstliche Lebern (BALs), die eine dezellularisierte Lebermatrix (DLM) verwenden, als vielversprechende Lösungen erwiesen 5,6,7. Die DLM bewahrt die ursprüngliche Leberstruktur, einschließlich ihres komplizierten mikrovaskulären Netzwerks und der Komponenten der EZM, und bietet ein Gerüst für die Erstellung transplantierbarer BALs, die möglicherweise Lebererkrankungen lindern könnten.
Trotz des Versprechens steht die Einführung dieser Technologie vor Herausforderungen, insbesondere bei der Beschaffung geeigneter DLMs. Vom Menschen stammende DLMs sind knapp, während solche aus tierischen Quellen das Risiko der Übertragung von Krankheiten und der Immunabstoßung bergen. In einem innovativen Ansatz haben wir in unserer Forschung die Verwendung einer dezellularisierten Milzmatrix (DSM) als Grundlage für die BALs 8,9,10,11 untersucht. Milz ist in verschiedenen medizinischen Situationen leichter verfügbar, z. B. bei portaler Hypertonie, traumatischer Ruptur, idiopathischer thrombozytopenischer Purpura und Spende nach dem Herztod. Daher ist Milz für Forschungszwecke weiter verbreitet als Leber. Patienten, die sich einer Splenektomie unterzogen haben, leiden nicht an schweren Erkrankungen, was die Entbehrlichkeit der Milz weiter bestätigt. Die Mikroumgebung der Milz, insbesondere der extrazellulären Matrix und der Sinusoide, ähnelt der der Leber. Damit ist die Milz ein geeignetes Organ für die Zelladhäsion und -proliferation in der Hepatozytentransplantationsforschung. Basierend auf diesen Erkenntnissen haben unsere bisherigen Untersuchungen gezeigt, dass DSMs vergleichbare Mikrostrukturen und Komponenten mit DLMs aufweisen und das Überleben und die Funktion von Hepatozyten, einschließlich der Albumin- und Harnstoffproduktion, unterstützen können. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass DSMs die hepatische Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen des Knochenmarks verbessern, was zu einer verbesserten und konsistenten Funktionalität führt.
Durch den Einsatz von DSMs, die mit Heparin behandelt wurden, haben wir funktionelle BALs entwickelt, die in der Lage sind, eine wirksame kurzfristige Antikoagulation und eine partielle Leberfunktionskompensation zu demonstrieren11. Folglich ist dieses dreidimensionale DSM vielversprechend für die Weiterentwicklung des Lebergewebe-Engineerings und der Zelltherapie. In dieser Arbeit stellen wir die detaillierten Methoden zur Entnahme von Rattenmilz und zur Herstellung von DSM vor, die die Mikrostrukturen und Komponenten der EZM erhalten.
Die BALs stellen einen wirksamen Ansatz für die Behandlung von Lebererkrankungen im Endstadium dar, insbesondere in Fällen, in denen eine Lebertransplantation durch den derzeitigen Mangel an Spenderorganen behindertwird 6. Eine vielversprechende Option zur Erstellung von BALs ist die Verwendung von DLM, bei der die natürliche EZM und die Gefäßstruktur der nativen Leber erhalten bleiben. Die Knappheit von DLM beim Menschen und die potenziellen Infektions- und Immunogenitätsrisiken, die mit ti…
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde unterstützt von der National Natural Science Foundation of China (82000624), dem Natural Science Basic Research Program von Shaanxi (2022JQ-899 & 2021JM-268), dem Shaanxi Province Innovation Capability Support Program (2023KJXX-030), dem Shaanxi Province Key R&D Plan University Joint Project-Key Project (2021GXLH-Z-047), der Institutional Foundation of The First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University (2021HL-42 & 2021HL-21).
Anesthesia Machine | Harvard Apparatus | tabletop | animal anesthesia |
bubble trap | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd. | pore diameter: 5 μm | prevent air bubbles |
Buprenorphine | TIPR Pharmaceutical Responsible Co.,Ltd | an analgesic | |
Hemostatic Forceps | Shanghai Medical Instruments Co., Ltd | J31020 | surgical tool |
Heparinized Saline | SPH No.1 Biochemical & Pharmaceutical Co., LTD | prevent the formation of thrombosis | |
Isoflurane | RWD life Science Co. | anesthetic:for the induction and maintenanceof anesthesia | |
Penicillin-Streptomycin | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | C0222 | antibiotics in vitro to prevent microbial contamination |
Peristaltic Pump | Baoding Longer Precision Pump Co., Ltd. | BT100-1L | |
Phosphate-Buffered Saline | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 4481228 | phosphoric acid buffer salt solution |
Silicone Tube | Baoding Longer Precision Pump Co., Ltd. | 2.4×0.8mm | |
Silk Suture | Yangzhou Jinhuan Medical Instrument Factory | 6-0 and 3-0 | ligate blood vessels |
Sodium Dodecyl Sulfate | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 151-21-3 | ionic detergent, dissolves both cell and nuclear membranes |
Syringe Pump | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd | BeneFusion SP5 | intravenous infusion |
Triton X-100 | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 9002-93-1 | non-ionic detergent, disrupts lipid-lipid, lipid-protein, and DNA-protein interactions |
Venous Catheter | B. Braun Company | 24G | inserting the spleen artery |