Hier stellen wir ein Protokoll zur Erzeugung von Organoiden von Melanompatienten vor, indem disassoziierte Zellsuspensionen aus frischem Melanomgewebe kultiviert werden. Diese Organoide rekapitulieren patientenspezifische Tumore in vitro originalgetreu und bieten einen innovativen Ansatz zur Erforschung immunsuppressiver Mechanismen von Tumoren, des Wirkstoffscreenings, der Arzneimittelresistenzmechanismen und der Krebsüberwachungsansätze.
Mit der Entwicklung der Immuntherapie besteht ein anhaltender Bedarf, Modelle zu entwickeln, die die Tumormikroumgebung von nativen Tumoren rekapitulieren können. Traditionelle zwei- und dreidimensionale Modelle können zwar Einblicke in die Entstehung und den Verlauf von Krebs bieten, aber es fehlen entscheidende Aspekte, die eine originalgetreue Nachahmung nativer Tumoren behindern. Ein alternatives Modell, das viel Aufmerksamkeit erregt hat, ist das von Patienten abgeleitete Organoid. Die Entwicklung dieser Organoide rekapituliert die komplexe interzelluläre Kommunikation, die Tumormikroumgebung und die Histoarchitektur von Tumoren. In diesem Artikel wird das Protokoll für die Etablierung von Melanom-Patienten-abgeleiteten Organoid-Modellen (MPDO) beschrieben. Um diese Modelle zu validieren, untersuchten wir die Zusammensetzung der Immunzellen, einschließlich der Expressionsniveaus von T-Zell-Aktivierungsmarkern, um die zelluläre Heterogenität der Organoide zu bestätigen. Um den potenziellen Nutzen von MPDOs in zellulären Therapien zu beschreiben, untersuchten wir außerdem die zytotoxischen Fähigkeiten der Behandlung der Organoide mit γδ T-Zellen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die MPDO-Modelle vielversprechende Wege bieten, um die Komplexität von Tumoren zu verstehen, therapeutische Strategien zu validieren und möglicherweise die personalisierte Behandlung voranzutreiben.
Konventionelle 2-D-Zellkulturmodelle sind in der Krebsforschung ein wesentliches Werkzeug zur Untersuchung des Krebsverlaufs und der Krebstherapie1. Diese Modelle ermöglichen nicht nur kontrollierte experimentelle Bedingungen, um die molekularen und zellulären Mechanismen zu untersuchen, die der Krebsentstehung und -progression zugrunde liegen, sondern liefern auch kostengünstige und relativ schnelle experimentelle Ergebnisse. Ihre Verwendung ist jedoch aufgrund der begrenzten zellulären Diversität in der Tumormikroumgebung (TME) eingeschränkt, die in einer koplanaren Natur von Monokulturmodellen nicht rekapituliert werden kann2. Darüber hinaus bieten Zellkulturmodelle im Vergleich zum menschlichen Körper eine stark vereinfachte Umgebung3. Um das Fortschreiten der Krebserkrankung besser zu verstehen und wirksame Behandlungen zu entwickeln, haben sich die Forscher daher innovativen Modellen zugewandt, die darauf abzielen, die TME in der Natur genau zu rekapitulieren. Folglich ist die Aufrechterhaltung der Treue zu nativen Tumoren in diesen Modellen von größter Bedeutung. Angesichts der komplizierten Natur von Krebs könnte jede signifikante Abweichung vom ursprünglichen Tumor unvorhergesehene Variablen einführen, die aussagekräftige Schlussfolgerungen über das Tumorverhalten verwirren könnten.
Während sich patienteneigene Xenotransplantate (PDX) als Modellsystem herausgestellt haben, das die Überwachung der Tumorprogression in vivo ermöglicht, stellen einige Einschränkungen in Frage, wie gut der entwickelte Tumor die menschliche Krebsbiologie rekapituliert4. Zum Beispiel enthält Melanom TME tumorinfiltrierende Immunzellen und Stromazellen. Bei der Passage als Xenotransplantat gehen die Nicht-Krebszellen des Patienten allmählich verloren, wodurch Anpassungen vorgenommen werden können, die sich von denen in Patiententumoren unterscheiden. Während diese Einschränkungen durch begrenzte Passagen des PDX in vivo gemildert werden können, können die Unterschiede zwischen den Spezies immer noch ein Risiko für genetische Veränderungen des PDX darstellen, die von denen des nativen Tumors abweichen5. Darüber hinaus werden PDX-Modelle in der Regel in immungeschwächten Mäusen etabliert, um die Abstoßung von menschlichem Gewebe zu verhindern. Dies schränkt die Möglichkeiten ein, die Rolle des Immunsystems des Wirts bei Krebs zu untersuchen, insbesondere in immuntherapeutischen Studien6. Wir und andere haben PDXs in “humanisierte” Mäuse transplantiert 7,8. Die Etablierung von PDX-Modellen in humanisierten Mäusen ist jedoch zeitaufwändig und teuer. Es kann mehrere Monate bis Jahre dauern, ein einzelnes PDX-Modell aus der Tumorprobe eines Patienten zu entwickeln, was die Geschwindigkeit und den Umfang der Forschung einschränkt. Trotz dieser Einschränkungen hat sich gezeigt, dass PDX-Modelle die Biologie der TME genau repräsentieren und daher unter anderem für die Entwicklung von Krebstherapeutika, personalisierter Medizin und Immuntherapie ausgiebig eingesetzt wurden9.
Eine alternative 3D-Kulturtechnik, die sich entwickelt hat, ist das patientenabgeleitete Organoid (PDO), bei dem ein frisch resezierter Patiententumor kultiviert wird, um Modelle zu erstellen, die die phänotypische Heterogenität, Histoarchitektur und interzelluläre Kommunikation beibehalten10. Seine Fähigkeit, nativen Tumoren sehr ähnlich zu sein, wurde bereits gezeigt, indem kultivierte Organoide aus nicht-muskelinvasivem (NMIBC) und muskelinvasivem Blasenkrebs (MIBC) erfolgreich Schlüsselaspekte der elterlichen Tumoren rekapitulierten11. Aufgrund ihres Potenzials und ihrer Vorteile gegenüber anderen Modellen bieten PDOs eine Vielzahl von maßgeschneiderten Anwendungen, die anderen Modellen fehlen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Erforschung und Entwicklung von Immun-Checkpoint-Inhibitoren sowie zellulären und zielgerichteten Therapien. Zum Beispiel haben wir zuvor Melanom-Patienten-abgeleitete Organoide (MPDOs) verwendet, um die Fähigkeit von tumorinfiltrierenden Lymphozyten (TILs) zu untersuchen, durch IL-2 und Anti-PD1-Antikörper (αPD-1) erweitert zu werden. Die Ergebnisse zeigten, dass die durch IL-2 und αPD-1 verstärkten TILs nicht nur eine höhere Anzahl aufwiesen, sondern auch MPDOs erfolgreich infiltrieren und Melanomzellen mit höherer Effizienz abtöten konnten als TILs, die mit anderen Methoden expandiert wurden12. Andere Gruppen haben ähnliche Ergebnisse gezeigt, bei denen die Verwendung von Anti-PD-1 und/oder Anti-PD-L1 dazu führt, dass TILs in PDOs funktionsfähig bleiben, was in der Folge zur Tumorabtötung führt13. Darüber hinaus hat unsere Gruppe MPDOs auch verwendet, um die Infiltration und Abtötungsfähigkeit von γδ-T-Zellen zu beurteilen14. Die Anwendbarkeit von PDOs erstreckt sich über ein breites Spektrum von Bereichen, darunter TIL-Expansion, Zytotoxizitätsstudien und das Screening kleiner Moleküle. All diese Anwendungen unterstreichen das Potenzial und die Benutzerfreundlichkeit, die dieses Modell mit sich bringt. Daher beschreiben wir das detaillierte Protokoll für die Kultur von MPDOs.
Das Aufkommen von PDOs hat mehrere Einschränkungen behoben, die durch andere zuvor etablierte Krebsforschungsmethoden aufgeworfen wurden, und gleichzeitig transformative potenzielle Anwendungen in diesem Bereich eingeführt. Diese Organoid-Technologie wurde ursprünglich im Jahr 2009 von Hans Clevers und Kollegen vorgeschlagen, die erfolgreich ein Darm-Organoid-Kultursystem etablieren konnten, indem sie Lgr5+ -Stammzellen aus dem Darm von Mäusen in einem 3D-Matrixgel kultivi…
The authors have nothing to disclose.
Diese Studie wurde teilweise durch Zuschüsse aus dem R01(CA258113), SPORE (CA261608) und P01 (CA114046) finanziert. Abbildung 1 wurde im BioRender.com erstellt.
2 mL Red Cap Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial | Corning | 431420 | |
50 mL Polypropylene Conical Tube | Corning | 352070 | |
100 mm TC-treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
105 mm Polystyrene Forceps Sterile | Caplugs Evergreen | 222-1121-B1I | |
150 cm2 Cell Culture Flask | Corning | CLS430825 | |
A83-01 | Tocris | 2939 | |
Advanced DMEM/F12 (1x) Reduced Serum Medium (1:1) | Gibco | 12634-010 | |
B-27 Supplement (50x) | Gibco | 17504-044 | |
Brilliant Violet 510 anti-human Perforin Antibody | BioLegend | 308120 | |
Brilliant Violet 605 anti-human Ki-67 Antibody | BioLegend | 350522 | |
Brilliant Violet 650 anti-human CD366 (Tim-3) Antibody | BioLegend | 345028 | |
Brilliant Violet 711 anti-human CD45 Antibody | BioLegend | 304050 | |
Cell Culture Inserts 0.4 µm, 30 mm Diameter | Millipore Sigma | PIHP03050 | |
Cell Staining Buffer | BioLegend | 420201 | |
Cell Strainer 40 µm Nylon | Corning | 352340 | |
Cell Strainer 70 µm Nylon | Corning | 352350 | |
Collagenase, Type IV, powder | Gibco | 17104019 | |
Cultrex Rat Collagen I | Trevigen | 3440-100-01 | |
Culture Plate, PS, 48 wells, TC treated with lid, sterile | Max Scientific | 07-6048 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max | Sigma-Aldrich | D2650 | |
DMEM – high glucose 4.5 mg/mL | Corning | MT10-0130CV | |
Dnase I – Grade II | Millipore Sigma | 10104159001 | |
DPBS, 1% | Corning | 21-031-CV | |
Fetal Bovine Serum, FBS | Corning | MT35-010-CV | |
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD Biosciences | 556547 | |
Forskolin | Tocris | 1099 | |
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL) | ThermoFisher | 10131035 | |
GlutaMAX Supplement | ThermoFisher | 35050061 | |
Ham's F12 Nutrient Mix | ThermoFisher | 11765054 | |
HEPES (1 M) | Gibco | 15630-080 | |
Hygromycin B (50 mg/mL) | ThermoFisher | 10687010 | |
L-Glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
L-WRN cell | ATCC | CRL-3276 | |
Matrigel Phenol Free & Growth Fact. Reduced | Corning | 356231 | |
Millex PVDF syringe filter, 0.22 μM | Millipore Sigma | SLGVR33RB | |
N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-100G | |
Nunc TripleFlask Treated Cell Culture Flask | ThermoFisher | 132867 | |
PE/Cyanine5 anti-human CD8a Antibody | BioLegend | 301010 | |
PE-Cy 7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1) | BD Biosciences | 561272 | |
Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15-1MG | |
Recombinant Human FGF-acidic | Peprotech | 100-17A | |
Sodium Bicarbonate Solution (NaHCO3) (7.5%) | Quality Biological | 118-085-721 | |
Stainless Steel Surgical Blades no. 22 | Integra | 4-322 | |
TrypLE Express | Gibco | 12604-021 |