Eine intraperitoneale Injektionstechnik bei erwachsenen Zebrafischen, die Körperschäden und die damit verbundene Mortalität minimiert
Summary
Eine neue intraperitoneale (IP) Injektionsmethode bei adulten Zebrafischen wird beschrieben. Beim Umgang mit toxischen Verbindungen wie Doxorubicin ist dieses Verfahren wirksamer als die beiden bisher berichteten IP-Methoden. Die Technik ist so konzipiert, dass sie von Forschern mit begrenzter Erfahrung im Zebrafischmodell leicht übernommen werden kann.
Abstract
Der erwachsene Zebrafisch (Danio rerio), der genetisch zugänglich ist, wird als wertvolles Wirbeltiermodell zur Erforschung menschlicher Erkrankungen wie der Kardiomyopathie eingesetzt. Die intraperitoneale (IP) Injektion ist eine wichtige Methode, die dem Körper Verbindungen zuführt, um entweder therapeutische Wirkungen zu testen oder Krankheitsmodelle wie die Doxorubicin-induzierte Kardiomyopathie (DIC) zu erstellen. Derzeit gibt es zwei Methoden der IP-Injektion. Beide Methoden haben Grenzen beim Umgang mit toxischen Verbindungen wie Doxorubicin, die zu Nebenwirkungen führen, die sich in schweren Schäden an der Körperform und dem Tod der Fische äußern. Während diese Mängel durch eine umfangreiche Schulung der Prüfärzte überwunden werden könnten, ist eine neue IP-Injektionsmethode mit minimalen Nebenwirkungen wünschenswert. Hier wird über eine einzigartige IP-Injektionsmethode berichtet, die in der Lage ist, mit toxischen Verbindungen umzugehen. Eine dauerhaft verminderte Herzfunktion kann die Folge sein, ohne dass es zu einem nennenswerten Fischsterben kommt. Die Technik kann von Forschern, die nur wenig Erfahrung mit erwachsenen Zebrafischen haben, leicht gemeistert werden.
Introduction
Der Zebrafisch (Danio rerio) hat als experimentelles Modell für die Erforschung menschlicher Krankheiten Aufmerksamkeit erregt, da dieses Tier eine hohe Gen- und Organhomologie zum Menschen, externe Befruchtung, einfache genetische Manipulation und Körpertransparenz bis in die frühe Reife umfasst, was eine Vielzahl von bildgebenden Anwendungen ermöglicht1. Im Gegensatz zu dem einfachen Prozess, Medikamente für Zebrafischembryonen und -larven direkt ins Wasser zu bringen, stellt die Verabreichung von Medikamenten an erwachsene Zebrafische ein komplizierteres und herausfordernderes Unterfangendar 2.
Bei erwachsenen Fischen können Verbindungen durch passive Wirkstoffverabreichungstechniken wie die direkte Verabreichung ins Wasser oder durch orale Wirkstoffverabreichungsmethoden wie Gavaging2 abgegeben werden. Andere Ansätze umfassen das Beschichten von Fischfutter mit den Verbindungen und das anschließende Füttern der Fische3 und die direkte Verabreichung von wasserunlöslichen Medikamenten in einer vorgegebenen Konzentration, einschließlich retroorbitaler oder intraperitonealer Injektionen 4,5. Die intraperitoneale Verabreichung wird aufgrund ihrer ausgeprägten pharmakokinetischen Vorteile für In-vivo-Studien von Krankheitsmodellen bevorzugt6. Diese Methode bietet eine hohe Wirkstoffkonzentration und eine verlängerte Halbwertszeit in der Peritonealhöhle und bietet damit einen effektiven Weg für die Wirkstoffabgabe 7,8. Der Ansatz wird häufig in Forschungsumgebungen verwendet, um eine optimale Wirkstoffabsorption und -verteilung zu gewährleisten 9. Während sich injektionsbasierte Methoden bei der einmaligen Verabreichung als effizient erweisen, führen längere und wiederholte Injektionen häufig zu Körperschäden und chronischen Infektionen2.
Derzeit gibt es zwei Methoden der IP-Injektion bei adulten Zerbafischen 4,10. Beide Methoden haben jedoch Einschränkungen bei der Verabreichung von toxischen Verbindungen wie Doxorubicin, was zu schweren Schäden an der Körperform und zum Fischsterben führt. Die Nebenwirkungen können die Interpretation der Daten erheblich erschweren. Obwohl diese Herausforderungen mit umfangreichen Schulungen angegangen werden können10, besteht ein klarer Bedarf an einer neuen IP-Injektionsmethode, die Nebenwirkungen minimiert.
Unser Ziel ist es, eine neue Methode der IP-Injektion zu entwickeln, die für die effektive Verabreichung von Doxorubicin an erwachsene Zebrafische optimiert ist und die Generierung zuverlässiger Doxorubicin-induzierter Kardiomyopathie (DIC)-Modelle mit minimierter Körperschädigung und damit verbundener Mortalität ermöglicht.
Protocol
Representative Results
Discussion
Anders als die beiden bestehenden IP-Injektionsverfahren 4,10 zeichnet sich das neue IP-Injektionsverfahren durch folgende Besonderheiten aus. Zunächst wird ein einzigartiger Nadeleinstichwinkel verwendet (nahe Null); Zweitens dringt die Nadel über eine einzigartige Stelle, d.h. ein natürliches Loch auf der Bauchoberfläche eines Fisches, in den Fisch ein, was die Injektion erleichtern würde; Und schließlich bewegt sich die Nadel von anterior nach p…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde von den NIH (HL107304 und HL081753) und der Mayo Foundation (Center for Biomedical Discovery and Cardiovascular Research Center) bis X.X. J.L. wird von den Fundamental Research Funds for the Central Universities der Central South University, Nr. 56021702, finanziert. Besonderer Dank geht an Beninio Gore und Quentin Stevens für die Leitung der Zebrafischanlage.
Materials
| 10 μL NanoFil-syringe | World Precision Instruments, Inc | NANOFIL | injection tool |
| 34 G needle | World Precision Instruments, Inc | NI34BV-2 | injcetion tool |
| 60 mm Petri dish | fisher scientific/fisherbrand | FB0875713A | placing the sponge |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ800 | Injceting the Dox |
| Doxorubicin hydrochloride | Sigma | D1515-10MG | drug for creating DIC model |
| Echocardiography | VISUAL SONICS | Vevo 3100 | measuring cardiac function |
| Foam Sponge | Jaece Industries | L800-D | placing the fish |
| Hank's balanced salt solution (HBBS) | Thermo Fisher | 14025076 | Vehicle for Dox |
| Microcentrifuge | southernlabware | MyFuge/C1012 | collect the Dox solution |
| Precision Balance Scale | Torbal | AD60 | Digital scales |
| Tricaine | Argent | MS-222 | Anesthetizing fish |
| Tube | Eppendorf | 1.5 mL | storage |
| vevo LAB software | FUJIFILM VISUAL SONICS | 5.6.0 | quantification of the heart |
Referenzen
- Tavares, B., Lopes, S. S. The importance of Zebrafish in biomedical research. Acta Medica Portuguesa. 26 (5), 583-592 (2013).
- Dang, M., Henderson, R. E., Garraway, L. A., Zon, L. I. Long-term drug administration in the adult zebrafish using oral gavage for cancer preclinical studies. Disease Model Mech. 9 (7), 811-820 (2016).
- Sciarra, J. B., Tyler, A., Kolb, A. A gelatin-based diet for oral dosing juvenile to adult zebrafish (Danio rerio). Lab Animal Sci Prof. , 32-35 (2014).
- Kinkel, M. D., Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E. Intraperitoneal injection into adult zebrafish. J Vis Exp. (42), e2126 (2010).
- Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. Retro-orbital injection in adult zebrafish. J Vis Exp. (34), e1645 (2009).
- Liu, J., et al. Intraperitoneally delivered mesenchymal stem cells alleviate experimental colitis through THBS1-mediated induction of IL-10-competent regulatory B cells. Front Immunol. 13, 853894 (2022).
- De Smet, L., Ceelen, W., Remon, J. P., Vervaet, C. Optimization of drug delivery systems for intraperitoneal therapy to extend the residence time of the chemotherapeutic agent. The Scientific World Journal. 2013, 720858 (2013).
- Dakwar, G. R., et al. Nanomedicine-based intraperitoneal therapy for the treatment of peritoneal carcinomatosis-Mission possible. Adv Drug Deliv Rev. 108, 13-24 (2017).
- Al Shoyaib, A., Archie, S. R., Karamyan, V. T. Intraperitoneal route of drug administration: should it be used in experimental animal studies. Pharmaceutical Res. 37, 1-17 (2020).
- Ma, X., Ding, Y., Wang, Y., Xu, X. A doxorubicin-induced cardiomyopathy model in adult zebrafish. J Vis Exp. (136), e57567 (2018).
- Wang, L. W., et al. Standardized echocardiographic assessment of cardiac function in normal adult zebrafish and heart disease models. Disease Model Mech. 10 (1), 63-76 (2017).
- Christidi, E., Brunham, L. R. Regulated cell death pathways in doxorubicin-induced cardiotoxicity. Cell Death Dis. 12 (4), 339 (2021).
- Zhu, W., Shou, W., Payne, R. M., Caldwell, R., Field, L. J. A mouse model for juvenile doxorubicin-induced cardiac dysfunction. Pediatric Res. 64 (5), 488-494 (2008).
- Podyacheva, E. Y., Kushnareva, E. A., Karpov, A. A., Toropova, Y. G. Analysis of models of doxorubicin-induced cardiomyopathy in rats and mice. A modern view from the perspective of the pathophysiologist and the clinician. Frontiers Pharmacol. 12, 670479 (2021).
- Chaoul, V., et al. Assessing drug administration techniques in zebrafish models of neurological disease. Int J Mol Sci. 24 (19), 14898 (2023).
- Lu, X., Lu, L., Gao, L., Wang, Y., Wang, W. Calycosin attenuates doxorubicin-induced cardiotoxicity via autophagy regulation in zebrafish models. Biomed Pharmacother. 137, 111375 (2021).
