בידוד גרעיני מתאי דם שמקורם בהקפאה חוץ גופית
Summary
אנו מתארים פרוטוקול לחילוץ גרעינים באיכות גבוהה מסוגי תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים בהקפאה, סטרומה/אנדותל ותאי דם שמקורם בהקפאה, לתמיכה בניתוחי ריצוף של הדור הבא של גרעין יחיד. ייצור גרעינים שלמים באיכות גבוהה הוא הכרחי לניסויים מולטיומיים, אך יכול להוות חסם כניסה לשטח עבור מעבדות מסוימות.
Abstract
מודלים מבוססי תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC) הם פלטפורמות מצוינות להבנת התפתחות הדם, ולתאי דם שמקורם ב- iPSC יש תועלת תרגומית כריאגנטים לבדיקה קלינית וטיפולי תאים הניתנים לטרנספוזציה. הופעתו והרחבתו של ניתוח מולטיומיקס, כולל, אך לא רק, ריצוף RNA של גרעין יחיד (snRNAseq) ו- Assay for Transposase-Accessible Chromatin sequencing (snATACseq), מציע את הפוטנציאל לחולל מהפכה בהבנה שלנו של התפתחות תאים. זה כולל ביולוגיה התפתחותית באמצעות מודלים hematopoietic במבחנה . עם זאת, זה יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית לבודד גרעינים שלמים מתאים בתרבית או ראשוניים. סוגי תאים שונים דורשים לעתים קרובות תכשירים גרעיניים מותאמים בהתאם לנוקשות התא ותכולתו. קשיים טכניים אלה יכולים להגביל את איכות הנתונים ולשמש מחסום לחוקרים המעוניינים להמשיך במחקרים מולטיומיים. שימור בהקפאה של דגימות נחוץ לעתים קרובות בשל מגבלות באיסוף ו / או עיבוד תאים, ודגימות קפואות יכולות להציג אתגרים טכניים נוספים לבידוד גרעיני שלם. בכתב יד זה, אנו מספקים שיטה מפורטת לבידוד גרעינים באיכות גבוהה מתאים שמקורם ב- iPSC בשלבים שונים של התפתחות המטופויטית במבחנה לשימוש בתהליכי עבודה מולטיומיים של גרעין יחיד. מיקדנו את פיתוח השיטה בבידוד גרעינים מתאי סטרומה/אנדותל דבקים שמקורם ב-iPSC ומתאי אב המטופויטיים שאינם דבקים, שכן אלה מייצגים סוגי תאים שונים מאוד מבחינת זהות מבנית ותאית. שלבי פתרון הבעיות המתוארים הגבילו גושים גרעיניים ופסולת, ואפשרו התאוששות של גרעינים בכמות ובאיכות מספיקות לניתוחים במורד הזרם. שיטות דומות עשויות להיות מותאמות לבידוד גרעינים מסוגי תאים אחרים שמורים בהקפאה.
Introduction
המטופויזיס היא מערכת התפתחותית מאופיינת היטב, אך חוסר יכולת לשחזר את היווצרות תאי הדם במבחנה מדגים הבנה חלקית של גורמים קשורים. מודלים של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC) המבוססים על המטופויזה יכולים לעזור להבהיר גורמי התפתחות מרכזיים וביולוגיה קשורה. מערכת iPSC מציעה גם מודל מצוין לחקר הפרעות דם, ותאי דם מבוססי iPSC פותחו כדי לייצר ריאגנטים רלוונטיים מבחינה תרגומית וטיפולית 1,2,3,4. מחקרים חד-תאיים שימשו באופן נרחב לחקר ביולוגיה התפתחותית מבוססת iPSC, כולל סוגי תאים המיוצרים במהלך המטופויזיס5. בהשוואה לריצוף רנ”א בתפזורת, שאינו יכול להסיק על קשרים בין תת-אוכלוסיות תאים6, מודלים חד-תאיים מאפשרים הערכה של הטרוגניות התא ויכולים להקל על זיהוי ואפיון התפתחות התא 6,7.
היווצרות תאים המטופויטיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים דורשת התמיינות רציפה באמצעות פסים פרימיטיביים, מזודרם ומצבי אנדותל ליצירת תאי אנדותל המוגניים. תאי אנדותל המוגניים הם מבשרים ישירים לתאי גזע ותאי אב המטופויטיים8. לסוגי תאים אלה יש תכונות מורפולוגיות ותאיות שונות להפליא. קיימת הבנה מוגבלת של הנוף האפיגנטי והדינמיקה ההתפתחותית של מודלים של תאים המטופויטיים שמקורם במבחנה, אם כי זהו ידע חיוני כדי לשחרר את מלוא הפוטנציאל הטיפולי של מערכת iPSC. במקרים רבים, רק שיטות אנליזה של תאים בודדים מאפשרות זיהוי אוכלוסיות תאים, פעילויות שעתוק, נופי כרומטינים ומנגנוני בקרה השולטים בהתפתחות בקרב תכשירים הטרוגניים של תאים.
שתי מתודולוגיות, ריצוף RNA חד-תאי (scRNAseq) וריצוף RNA של גרעינים בודדים (snRNAseq), יכולות לחשוף תובנות שעתוק ברמת התא הבודד9. גורם עיקרי המכתיב את תוקף הנתונים ומהימנותם הוא הצורך הבלתי מתפשר בדגימות העומדות בקריטריוני איכות מחמירים. אלה כוללים דרישות מדויקות לצפיפות התא / הגרעין, כדאיות אופטימלית ומינימום גושים. הכנת גרעינים בודדים יכולה להיות מאתגרת מבחינה טכנית. ייתכנו אתגרים נוספים הקשורים לשימוש בתאים שנשמרו בעבר בהקפאה.
אנו מציינים ארבע מגבלות פוטנציאליות חשובות לגישות scRNAseq סטנדרטיות. ראשית, פרוטוקולים סטנדרטיים ליצירת תרחיפים של תאים מתייחסים לעתים קרובות לתכשירים מתאים או רקמות טריים, ולא לאלה שנשלפו לאחר שימור בהקפאה10. זה יכול לצמצם את התועלת של משאבים בעלי ערך פוטנציאלי. שנית, יעילות הדיסוציאציה של סוגי תאים מגוונים משתנה. לדוגמה, סוגים רבים של תאי מערכת החיסון עוברים דיסוציאציה בקלות יחסית. לעומת זאת, תאי סטרומה, פיברובלסטים ותאי אנדותל, אשר בדרך כלל מוטמעים במטריצה החוץ תאית ובקרום המרתף, הם בעלי תכונות תאיות ייחודיות שיכולות לסבך בידוד גרעינים11,12. תכונות אלה יכולות לדרוש פרוטוקולי דיסוציאציה אגרסיביים, אשר עלולים לסכן את השלמות המבנית של אוכלוסיות תאים עדינות יותר. שלישית, תאים מסוימים (למשל, מגה-קריוציטים) יכולים לעבור את הקוטר של 100 מיקרומטר ולהציב קשיים עבור מספר פלטפורמות מסחריות קיימות של תא בודד13. בנוסף, טיפול לא נכון יכול להוביל לנזק תאי ולתגובות עקה במהלך השלבים הראשונים של בידוד התא, הכוללים הידרוליזה אנזימטית ודיסוציאציה מכנית, אשר יכולים להשפיע על פרופילי ביטוי גנים11,14.
מסיבות אלה ואחרות, גישת גרעין יחיד עשויה להיות חלופה עדיפה על שיטות תא בודד15. בהתחשב ביציבות העדיפה של קרום הגרעין בהשוואה לקרום התא, מעטפת הגרעין עשויה להישאר שלמה גם לאחר שימור רקמתיבהקפאה 16. זה יכול להקל על מיצוי גרעיני ולשפר את מגוון סוגי הדגימות המתאימים לשיטות ריצוף של הדור הבא. שנית, גרעינים מפגינים התנגדות מוגברת להפרעות מכניות ונוטים להפגין פחות שינויי שעתוק במהלך דיסוציאציה14. לכן, גרעינים יכולים לספק יציבות RNA גדולה יותר ופרופילי שעתוק הניתנים לשכפול רבים יותר. יתרון בולט שלישי של שיטות גרעינים בודדים הוא היעדר אילוצים של גודל התא ויישום עבור תאים גדולים יותר, כמו קרדיומיוציטים או מגה-קריוציטים12. רביעית, גרעינים משמשים כמצע מתאים לאנליזות מולטיומיקס, המציעות תובנות מורחבות מניתוח משולב של ביטוי גנים, אזורי כרומטין נגישים ופרמטרים אחרים17, המאפשרים הבנה עמוקה יותר של הטרוגניות התא, התפתחותה ומצבים תפקודיים18.
על ידי אפיון iPSCs במהלך התפתחות hematopoietic, גישות multiomics יכול לעזור להגדיר תהליכים התפתחותיים במודלים נורמליים או פתולוגיים של מחלות. השוואות של תאים שמקורם ב-iPSC לתאים ראשוניים או רקמות יכולות גם לספק הערכה של נאמנות מודל iPSC לביולוגיה in vivo , להקל על שיפור מודל iPSC וגילוי אוכלוסיות תאים חדשות וגורמים המניעים את היווצרות הדם.
למרות שקבוצות רבות ניווטו בהצלחה את הבידוד הגרעיני ואת ניתוח ריצוף הדור הבא, בידוד גרעינים באיכות גבוהה נותר מחסום בפני מעבדות מסוימות המעוניינות לבצע ניתוחים מבוססי גרעין יחיד. כתב יד זה מפרט פרוטוקול לבידוד גרעינים איכותיים מתאים שבעבר נשמרו בהקפאה iPSC. התמקדנו בתאי סטרומה/אנדותל דבקים ובתאי אב המטופויטיים שאינם דבקים, מכיוון שאלה מייצגים סוגי תאים שונים מאוד מבחינת מבנה ותוכן הדורשים שינויים מותאמים אישית ופתרון בעיות כדי להגביר את ההתאוששות של גרעינים באיכות גבוהה הניתנים לריצוף הדור הבא או לניסויים אחרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
שלבים קריטיים בתוך הפרוטוקול
בידוד גרעינים באיכות גבוהה חיוני ליישום מוצלח של שיטות ריצוף הדור הבא המבוססות על גרעין יחיד, המתפתחות במהירות. מתוך הכרה בחסמים הקיימים עבור מעבדות המעוניינות בגישות אלה, במיוחד עבור דגימות שמורות בהקפאה, כוונתנו הייתה לעצב טכניקת בידוד גרעיני המ…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לג’ייסון הטקיאמה (10x Genomics) ודיאנה סלייטר (בית החולים לילדים במרכז פילדלפיה לגנומיקה יישומית) על ההדרכה וההצעות. מחקר זה נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (HL156052 ל- CST).
Materials
| Cell Culture Reagents | |||
| Dimethyl sulfoxide solution (DMSO) | Sigma | 673439 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Corning | 21031CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GeminiBio | 100106 | |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875093 | |
| Cells | |||
| Induced pluripotent stem cells | N/A | N/A | The iPSCs used in this study were obtained through the CHOP Human Pluripotent Stem Cell Core Facility |
| Cell Staining Reagents | |||
| Trypan Blue Solution | Corning | 25900CI | |
| Dead Cell Removal Reagents | |||
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C4901 | |
| EasySep Dead Cell Removal (Annexin V) Kit | StemCell Technologies | 17899 | This kit is designed for the depletion of unwanted cell types labeled with biotin. The kit includes Dead Cell Removal (Annexin V) Cocktail, Biotin Selection Cocktail, and Dextran beads. This kit targets phosphatidylserine on the outer leaflet of the cell membrane of apoptotic cells using Annexin V. Unwanted cells are labeled with Annexin V, Biotinylated antibodies, and magnetic particles, and separated without columns using an EasySep magnet. Desired cells are simply poured off into a new tube. |
| Materials | |||
| 10 µl Micropipette | Wards science | 470231606 | |
| 100 µl Micropipette | Wards science | 470231598 | |
| 1000 µl Extended Universal Tip | Oxford Lab Products | OAR-1000XL-SLF | |
| 1000 µl Micropipette | Wards science | 470231602 | |
| 2.0 ml Cryogenic vials | Corning | 431386 | |
| 20 µl Micropipette | Wards science | 470231608 | |
| 200 µl Micropipette | Wards science | 470231600 | |
| 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube | Falcon | 352063 | |
| Corning DeckWork 0.1-10 µl Pipet Tip Station | Corning | 4143 | |
| Corning DeckWork 1-200 µl Pipet Tip Station | Corning | 4144 | |
| Counting chamber | CytoSMART | 699910591 | |
| Flowmi Cell Strainer, 40 µm | Bel-Art | H136800040 | |
| Magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| NALGENE Cryo 1°C Freezing Container | Nalgene | 51000001 | |
| Nuclei Isolation Reagents | Nuclei isolation reagents include Lysis Buffer, Wash buffer, and Diluted Nuclei Buffer,and Lysis Dilution Buffer. The constitution of these buffers are in the Table 1, 2, and 3. Our nuclei isolation method improved isolation from the standard kit protocols (e.g., 10x Genomics Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide [CG000338]). This protocol can be used with several commercial kits, including the Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 16 rxns (PN-1000283). | ||
| Dead Cell Removal kit | STEMCELL | 17899 | |
| Digitonin | Thermo Fisher Scientific | BN2006 | |
| DL-Dithiothreitol solution (DTT) | Sigma | 646563 | |
| Flowmi Cell Strainer, 40 µm | Bel-Art | H136800040 | |
| MACS bovine serum albumin (BSA) stock Solution | Miltenyi Biotec | 130091376 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | 7786303 | |
| Magnesium Chloride Solution, 1 M | Sigma | M1028 | |
| Nonidet P40 Substitute | Sigma | 74385 | |
| Nuclease-Free Water | Thermo Fisher Scientific | AM9937 | |
| Nuclei Buffer (20X) | 10X Genomics | 2000153 | |
| Protector RNase inhibitor | Sigma | 3335399001 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653-250G | |
| Sodium Chloride Solution, 5 M | Sigma | 59222C | |
| Trizma Hydrochloride Soultion, pH 7.4 | Sigma | T2194 | |
| Trizma hydrochloride (Tris-HCl) (pH7.4) | Sigma | T3252-500G | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
| Other equipment | |||
| Automated cell counter | CytoSMART | 699910591 | |
| Microscope | Zeiss | Primostar 3 |
Referenzen
- Ito, Y., et al. Turbulence activates platelet biogenesis to enable clinical scale ex vivo production. Cell. 174 (3), 636-648 (2018).
- An, H. H., et al. The use of pluripotent stem cells to generate diagnostic tools for transfusion medicine. Blood. 140 (15), 1723-1734 (2022).
- Zeng, J., Tang, S. Y., Toh, L. L., Wang, S. Generation of "Off-the-Shelf" Natural Killer Cells from Peripheral Blood Cell-Derived Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Rep. 9 (6), 1796-1812 (2017).
- Pavani, G., et al. Modeling primitive and definitive erythropoiesis with induced pluripotent stem cells. Blood Adv. , (2024).
- Chen, X., et al. Integrative epigenomic and transcriptomic analysis reveals the requirement of JUNB for hematopoietic fate induction. Nat Comm. 13 (1), 3131 (2022).
- Yu, X., Abbas-Aghababazadeh, F., Chen, Y. A., Fridley, B. L. Statistical and bioinformatics analysis of data from bulk and single-cell RNA sequencing experiments. Methods Mol Biol. 2194, 143-175 (2021).
- Jovic, D., et al. Single-cell RNA sequencing technologies and applications: A brief overview. Clin Transl Med. 12 (3), e694 (2022).
- Choi, K. D., et al. Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2 (3), 553-567 (2012).
- Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).
- Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nat med. 26 (5), 792-802 (2020).
- Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: Rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis. J Am Soc Nephrol. 30 (1), 23-32 (2019).
- Nadelmann, E. R., et al. Isolation of nuclei from mammalian cells and tissues for single-nucleus molecular profiling. Curr Protoc. 1 (5), e132 (2021).
- Del-Aguila, J. L., et al. A single-nuclei RNA sequencing study of Mendelian and sporadic AD in the human brain. Alzheimer’s Res Ther. 11 (1), 71 (2019).
- Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PloS one. 13 (12), e0209648 (2018).
- Kim, N., Kang, H., Jo, A., Yoo, S. A., Lee, H. O. Perspectives on single-nucleus RNA sequencing in different cell types and tissues. J Pathol Transl Med. 57 (1), 52-59 (2023).
- Maciejowski, J., Hatch, E. M. Nuclear membrane rupture and its consequences. Ann Rev Cell Dev Biol. 36, 85-114 (2020).
- Fang, R., et al. Comprehensive analysis of single cell ATAC-seq data with SnapATAC. Nat Comm. 12 (1), 1337 (2021).
- Baysoy, A., Bai, Z., Satija, R., Fan, R. The technological landscape and applications of single-cell multi-omics. Nat Rev. Mol Cell Biol. 24 (10), 695-713 (2023).
