Isolement nucléaire à partir de cellules sanguines dérivées in vitro cryoconservées

L’hématopoïèse est un système de développement relativement bien caractérisé, mais une incapacité à récapituler la formation des cellules sanguines in vitro démontre une compréhension incomplète des facteurs connexes. Les modèles d’hématopoïèse basés sur des cellules souches pluripotentes induites (iPSC) peuvent aider à élucider les principaux facteurs de développement et la biologie associée. Le système iPSC offre également un excellent modèle pour étudier les troubles sanguins, et des cellules sanguines basées sur les iPSC ont été développées pour produire des réactifs pertinents sur le plan translationnel et thérapeutique 1,2,3,4. Les études sur cellules uniques ont été largement utilisées pour étudier la biologie du développement basée sur les iPSC, y compris les types de cellules produites pendant l’hématopoïèse⁵. Par rapport au séquençage de l’ARN en vrac, qui ne peut pas déduire les relations entre les sous-populations cellulaires⁶, les modalités unicellulaires permettent d’évaluer l’hétérogénéité cellulaire et peuvent faciliter l’identification et la caractérisation du développement cellulaire ^6,7.

La formation de cellules hématopoïétiques à partir d’iPSC nécessite une différenciation séquentielle par des états primitifs de strie, de mésoderme et d’endothélium pour former des cellules endothéliales hémogènes. Les cellules endothéliales hémogéniques sont des précurseurs directs des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques⁸. Ces types de cellules ont des propriétés morphologiques et cellulaires remarquablement différentes. Il existe une compréhension limitée du paysage épigénétique et de la dynamique du développement des modèles de cellules hématopoïétiques dérivées in vitro, bien qu’il s’agisse d’une connaissance essentielle pour libérer le plein potentiel thérapeutique du système iPSC. Dans de nombreux cas, seules les modalités d’analyse de cellules uniques permettent d’identifier les populations cellulaires, les activités transcriptionnelles, les paysages chromatiniens et les mécanismes de régulation qui régissent le développement parmi les préparations cellulaires hétérogènes.

Deux méthodologies, le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNAseq) et le séquençage de l’ARN à noyau unique (snRNAseq), peuvent révéler des informations transcriptionnelles au niveau de la cellule individuelle⁹. L’un des principaux facteurs qui dictent la validité et la fiabilité des données est le besoin intransigeant d’échantillons répondant à des critères de qualité stricts. Il s’agit notamment d’exigences précises en matière de densité cellulaire/nucléaire, de viabilité optimale et d’agglutination minimale. La préparation de noyaux uniques peut être techniquement difficile. L’utilisation de cellules préalablement cryoconservées peut présenter des défis supplémentaires.

Nous notons quatre limites potentielles importantes aux approches standard de scRNAseq. Tout d’abord, les protocoles standard de génération de suspensions cellulaires font souvent référence à des préparations à partir de cellules ou de tissus frais, plutôt qu’à ceux récupérés après la cryoconservation¹⁰. Cela peut réduire l’utilité de ressources potentiellement précieuses. Deuxièmement, l’efficacité de dissociation de divers types de cellules est variable. Par exemple, de nombreux types de cellules immunitaires subissent une dissociation avec une relative facilité. En revanche, les cellules stromales, les fibroblastes et les cellules endothéliales, qui sont normalement intégrés dans la matrice extracellulaire et la membrane basale, ont des propriétés cellulaires uniques qui peuvent compliquer l’isolement des noyaux^11,12. Ces propriétés peuvent nécessiter des protocoles de dissociation agressifs, ce qui peut compromettre l’intégrité structurelle de populations cellulaires plus délicates. Troisièmement, certaines cellules (p. ex. les mégacaryocytes) peuvent dépasser 100 m de diamètre et poser des difficultés à plusieurs plateformes commerciales existantes de cellules uniques¹³. De plus, une mauvaise manipulation peut entraîner des dommages cellulaires et des réponses de stress au cours des premières étapes de l’isolement cellulaire, impliquant l’hydrolyse enzymatique et la dissociation mécanique, ce qui peut avoir un impact sur les profils d’expression génique^11,14.

Pour ces raisons et d’autres, l’approche à noyau unique peut être une solution de rechange préférable aux méthodes à cellule unique¹⁵. Étant donné la stabilité supérieure de la membrane nucléaire par rapport à la membrane cellulaire, l’enveloppe nucléaire peut rester intacte même après la cryoconservation des tissus¹⁶. Cela peut faciliter l’extraction nucléaire et améliorer la diversité des types d’échantillons adaptés aux modalités de séquençage de nouvelle génération. Deuxièmement, les noyaux présentent une résistance accrue aux perturbations mécaniques et ont tendance à manifester moins de changements transcriptionnels lors de la dissociation¹⁴. Par conséquent, les noyaux peuvent fournir une plus grande stabilité de l’ARN et des profils transcriptionnels plus reproductibles. Un troisième avantage notable des méthodes à noyau unique est l’absence de contraintes de taille cellulaire et l’applicabilité pour des cellules plus grandes, comme les cardiomyocytes ou les mégacaryocytes¹². Quatrièmement, les noyaux servent de substrats appropriés pour les analyses multiomiques, qui offrent des informations élargies à partir de l’analyse intégrée de l’expression des gènes, des régions de chromatine accessibles et d’autres paramètres¹⁷, permettant une compréhension plus approfondie de l’hétérogénéité, du développement et des états fonctionnels^{des cellules 18}.

En profilant les iPSC au cours du développement hématopoïétique, les approches multiomiques peuvent aider à définir les processus de développement dans des modèles de maladies normales ou pathologiques. Les comparaisons de cellules dérivées d’iPSC avec des cellules ou des tissus primaires peuvent également fournir une évaluation de la fidélité du modèle iPSC à la biologie in vivo , facilitant ainsi l’amélioration du modèle iPSC et la découverte de nouvelles populations cellulaires et de facteurs favorisant la formation du sang.

Bien que de nombreux groupes aient réussi à naviguer dans l’isolement nucléaire et l’analyse de séquençage de nouvelle génération qui en résulte, l’isolement de noyaux de haute qualité reste un obstacle pour certains laboratoires intéressés à effectuer des analyses basées sur un seul noyau. Ce manuscrit détaille un protocole permettant d’isoler des noyaux de qualité à partir de cellules dérivées d’iPSC précédemment cryoconservées. Nous nous sommes concentrés sur les cellules stromales/endothéliales adhérentes et les cellules progénitrices hématopoïétiques non adhérentes, car elles représentent des types de cellules très différents en termes de structure et de contenu qui nécessitent des modifications et un dépannage adaptés pour améliorer la récupération de noyaux de haute qualité se prêtant au séquençage de prochaine génération ou à d’autres expériences.