Nucleaire isolatie van gecryopreserveerde in vitro afgeleide bloedcellen

Hematopoëse is een relatief goed gekarakteriseerd ontwikkelingssysteem, maar een onvermogen om de vorming van bloedcellen in vitro te recapituleren, toont een onvolledig begrip van gerelateerde factoren. Op geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) gebaseerde hematopoësemodellen kunnen helpen bij het ophelderen van belangrijke ontwikkelingsfactoren en gerelateerde biologie. Het iPSC-systeem biedt ook een uitstekend model om bloedaandoeningen te bestuderen, en op iPSC gebaseerde bloedcellen zijn ontwikkeld om translationeel en therapeutisch relevante reagentia te produceren 1,2,3,4. Eencellige studies zijn uitgebreid gebruikt om op iPSC gebaseerde ontwikkelingsbiologie te onderzoeken, inclusief celtypen die worden geproduceerd tijdens hematopoëse⁵. Vergeleken met bulk-RNA-sequencing, die geen verbanden tussen celsubpopulaties kan afleiden⁶, maken single-cell-modaliteiten beoordelingen van celheterogeniteit mogelijk en kunnen ze de identificatie en karakterisering van celontwikkeling vergemakkelijken ^6,7.

De vorming van hematopoëtische cellen uit iPSC’s vereist sequentiële differentiatie door primitieve streep-, mesoderm- en endotheeltoestanden om hemogene endotheelcellen te vormen. Hemogene endotheelcellen zijn directe voorlopers van hematopoëtische^{stam- en} voorlopercellen. Deze celtypen hebben opmerkelijk verschillende morfologische en cellulaire eigenschappen. Er is een beperkt begrip van het epigenetische landschap en de ontwikkelingsdynamiek van in vitro afgeleide hematopoëtische celmodellen, hoewel dit essentiële kennis is om het volledige therapeutische potentieel van het iPSC-systeem te ontsluiten. In veel gevallen maken alleen enkelvoudige celanalysemodaliteiten de identificatie mogelijk van celpopulaties, transcriptionele activiteiten, chromatinelandschappen en regulerende mechanismen die de ontwikkeling van heterogene celpreparaten regelen.

Twee methodologieën, single-cell RNA sequencing (scRNAseq) en single nuclei RNA sequencing (snRNAseq), kunnen transcriptionele inzichten onthullen op individueel celniveau⁹. Een belangrijke factor die de validiteit en betrouwbaarheid van gegevens bepaalt, is de compromisloze behoefte aan monsters die aan strenge kwaliteitscriteria voldoen. Deze omvatten nauwkeurige vereisten voor cel-/kerndichtheid, optimale levensvatbaarheid en minimale klontering. De bereiding van enkelvoudige kernen kan technisch uitdagend zijn. Er kunnen extra uitdagingen zijn verbonden aan het gebruik van eerder gecryopreserveerde cellen.

We merken vier belangrijke potentiële beperkingen op van standaard scRNAseq-benaderingen. Ten eerste verwijzen standaardprotocollen voor het genereren van celsuspensies vaak naar preparaten van verse cellen of weefsels, in plaats van die welke na cryopreservatie worden opgehaald10. Dit kan het nut van potentieel waardevolle hulpbronnen inperken. Ten tweede is de dissociatie-efficiëntie van verschillende celtypen variabel. Veel typen immuuncellen ondergaan bijvoorbeeld relatief gemakkelijk dissociatie. Daarentegen hebben stromale cellen, fibroblasten en endotheelcellen, die normaal gesproken zijn ingebed in de extracellulaire matrix en het basale membraan, unieke celeigenschappen die de isolatie van kernen kunnen bemoeilijken^11,12. Deze eigenschappen kunnen agressieve dissociatieprotocollen vereisen, die de structurele integriteit van meer delicate celpopulaties in gevaar kunnen brengen. Ten derde kunnen sommige cellen (bijv. megakaryocyten) een diameter van meer dan 100 μm hebben en problemen opleveren voor verschillende bestaande commerciële eencellige platforms¹³. Bovendien kan onjuist gebruik leiden tot cellulaire schade en stressreacties tijdens de eerste stappen van celisolatie, waarbij enzymatische hydrolyse en mechanische dissociatie betrokken zijn, wat van invloed kan zijn op genexpressieprofielen^11,14.

Om deze en andere redenen kan een benadering met één kern een beter alternatief zijn voor methoden met één cel¹⁵. Gezien de superieure stabiliteit van het kernmembraan in vergelijking met het celmembraan, kan de nucleaire envelop intact blijven, zelfs na cryopreservatie van^weefsel16. Dit kan nucleaire extractie vergemakkelijken en de diversiteit aan monstertypes vergroten die geschikt zijn voor sequencingmodaliteiten van de volgende generatie. Ten tweede vertonen kernen een verhoogde weerstand tegen mechanische verstoringen en hebben ze de neiging om minder transcriptieverschuivingen te vertonen tijdens dissociatie¹⁴. Daarom kunnen kernen zorgen voor een grotere RNA-stabiliteit en beter reproduceerbare transcriptieprofielen. Een derde opmerkelijk voordeel van methoden met één kern is het ontbreken van beperkingen op de celgrootte en de toepasbaarheid voor grotere cellen, zoals cardiomyocyten of megakaryocyten¹². Ten vierde dienen kernen als geschikte substraten voor multiomics-analyses, die uitgebreide inzichten bieden uit geïntegreerde analyse van genexpressie, toegankelijke chromatineregio’s en andere parameters¹⁷, waardoor een beter begrip van celheterogeniteit, ontwikkeling en functionele toestanden mogelijk wordt¹⁸.

Door iPSC’s tijdens de hematopoëtische ontwikkeling te profileren, kunnen multiomics-benaderingen helpen bij het definiëren van ontwikkelingsprocessen in normale of pathologische ziektemodellen. Vergelijkingen van iPSC-afgeleide cellen met primaire cellen of weefsels kunnen ook een beoordeling opleveren van de trouw van het iPSC-model aan de in vivo biologie, waardoor iPSC-modelverbetering en de ontdekking van nieuwe celpopulaties en factoren die de bloedvorming stimuleren, worden vergemakkelijkt.

Hoewel veel groepen met succes nucleaire isolatie en de daaruit voortvloeiende sequencing-analyse van de volgende generatie hebben doorstaan, blijft het isoleren van kernen van hoge kwaliteit een barrière voor sommige laboratoria die geïnteresseerd zijn in het uitvoeren van analyses op basis van één kern. Dit manuscript beschrijft een protocol voor het isoleren van kwaliteitskernen uit eerder gecryopreserveerde iPSC-afgeleide cellen. We hebben ons gericht op adherente stromale/endotheelcellen en niet-advente hematopoëtische voorlopercellen, omdat deze zeer verschillende celtypen vertegenwoordigen met betrekking tot structuur en inhoud die op maat gemaakte aanpassingen en probleemoplossing vereisen om het herstel van hoogwaardige kernen te verhogen die geschikt zijn voor sequencing van de volgende generatie of andere experimenten.