Blutstillung von Punktionswunden und Vorbereitung von Proben für die Montage der großflächigen elektronenmikroskopischen Analyse

Die Versuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der University of Arkansas for Medical Sciences geprüft und genehmigt. Hier wurden 8 – 12 Wochen alte, männliche und weibliche C57BL/6-Mäuse vom Wildtyp verwendet. Diese Mäuse sind junge Erwachsene mit geringer Fettansammlung. Die gleichen Verfahren gelten für Mausmutanten für verschiedene Proteine, die für die Blutstillung wichtig sind, wie z. B. den von-Willebrand-Faktor oder das Thrombozytenglykoprotein VI (GPVI)5,6. Alle verwendeten Geräte, chirurgischen Instrumente, Reagenzien und anderen verwendeten Materialien sind in Abbildung 1 dargestellt und in der Materialtabelle aufgeführt. 1. Punktionswunde der Vena jugularis/Arteria femoralis 1,7 Betäubung der MausSetzen Sie die Maus in die Induktionskammer und drehen Sie den Isofluran-Verdampfer auf eine hohe Durchflussrate (500 mL/min, 3% Isofluran). Isofluran wird gewählt, weil es nur einen geringen Einfluss auf den Durchmesser der Blutgefäße hat.VORSICHT: Eine langfristige Exposition gegenüber Isofluran kann gesundheitsschädliche Auswirkungen haben. Die Verwendung eines Verdampfers mit geringem Durchfluss, Anästhesiegasabscheidungskanistern und einer guten Raumbelüftung kann die Exposition erheblich reduzieren. Wenn die Maus zu schlafen scheint, kneifen Sie einen der Zehen der Maus zusammen, um zu sehen, ob die Maus reagiert. Wenn ja, stellen Sie die Maus für einige Minuten wieder in die Induktionskammer und versuchen Sie dann den Einklemmtest erneut. Wenn die Maus nicht reagiert, legen Sie sie in Rückenlage auf die Heizplatte (zuvor mit Alufolie abgedeckt). Drehen Sie den Vaporizer auf eine niedrige Durchflussrate (100 mL/min, 1,75% Isofluran) herunter. Setzen Sie die Nase der Maus in den Nasenkegel ein. Verlängern Sie jedes Glied und kleben Sie es mit kleinen Stücken Klebeband fest. Setzen Sie den rektalen Temperaturfühler ein und stellen Sie die Temperatur am Temperaturregler auf 37 °C ein. Kleben Sie das Kabel des Temperaturfühlers fest, um zu verhindern, dass der Fühler versehentlich herausgezogen wird. Schnitt bei der MausRasieren Sie mit der Haarschneidemaschine den Hals und die Brust der Maus (für die Halsvene) oder das innere rechte Bein (für die Oberschenkelarterie). Wischen Sie den Fellabsatz mit einem Alkoholpad ab. Gehen Sie bei Bedarf erneut mit der Schermaschine über die Stelle, um das restliche Fell zu entfernen. Wischen Sie den Bereich erneut mit einem frischen Alkoholtupfer ab, um alle Schnittreste zu entfernen. Es ist sehr wichtig, dass der Bereich so sauber wie möglich ist. Bestätigen Sie die chirurgische Ebene der Anästhesie durch ein Zehenkneifen. Heben Sie mit einer Schere und einer stumpfen Pinzette die Haut über der rechten Halsvene an und schneiden Sie sie. Schneide ein rundes Fenster in die Haut, das groß genug ist, um die Halsvene und einen Teil des umgebenden Gewebes freizulegen. Reinigung der Vena jugularis (die gleichen Prinzipien gelten für die Oberschenkelarterie)Mit der stumpfen Dissektionstechnik werden Fett- und Lymphknoten sowie das Bindegewebe sanft beiseite geschoben.HINWEIS: In diesem Schritt findet eine allgemeine Reinigung rund um das Schiff statt. Eine sorgfältige, gründliche Reinigung findet jedoch unter dem Mikroskop statt, nachdem die Halsvene 24 Stunden lang in Paraformaldehyd fixiert wurde. Füllen Sie eine 20-ml-Spritze mit normaler Kochsalzlösung, die auf 37 °C erwärmt wurde. Laden Sie die Spritze in die Spritzeninfusionspumpe. Befestigen Sie die 27G-Butterfly-Nadel und den zugehörigen Schlauch an der Spritze. Stellen Sie die Spritzenpumpe auf eine Durchflussrate von 0,5 mL/min ein. Der sanfte Strahl der Kochsalzlösung wäscht das Blut aus der punktierten Vene/Arterie. Positionieren Sie den Kochsalzstrahl einige mm seitlich der Einstichstelle, nicht direkt darüber. Punktion der Vena jugularis/Arteria femoralisStarten Sie den Timer. Besorgen Sie sich eine 30G-Injektionsnadel (nominal 300 μm Durchmesser) für die Halsvene und eine 33G-Injektionsnadel (200 μm Durchmesser) für die Oberschenkelarterie. Die Verwendung einer kleineren Nadel ergibt nur eine geringfügig längere Blutungszeit für die arterielle Situation mit höherem Druck. Drehen Sie die Fase nach oben. Positionieren Sie die Nadel in einem Winkel von 25° über der Halsvene/Oberschenkelarterie. Notieren Sie sich die Uhrzeit. Durchstechen Sie das Gefäß schnell und achten Sie darauf, dass Sie nur die Oberseite des Gefäßes durchstechen. Achten Sie darauf, dass Sie nicht auch den Boden des Gefäßes durchstechen. Achte auf den Zeitpunkt, an dem die Blutung vollständig aufhört. Warten Sie auf die entsprechende Zeitspanne, um eine Thrombusbildung zu erhalten (Abbildung 2A), bevor Sie mit der Perfusionsfixation beginnen (d. h. entweder 1, 5, 10 oder 20 Minuten, um verschiedene Stadien der Thrombusentwicklung zu erhalten). Euthanasieren Sie das Tier durch Ausblutung oder befolgen Sie die örtlichen institutionellen Richtlinien für die Euthanasie. Durchführung einer transkardialen PerfusionsfixationRichten Sie die Peristaltikpumpe ein, bevor die Operation beginnt. Legen Sie zwei konische 50-ml-Röhrchen in ein Reagenzglasgestell. Füllen Sie ein Röhrchen mit 4%iger Paraformaldehyd-Fixierlösung, die in Natriumcacodylat-Pufferlösung (0,2 M Natriumcacodylat, 0,15 M Natriumchlorid bei pH 7,4) für Jugularpunktionsuntersuchungen hergestellt wurde, und füllen Sie das andere Röhrchen mit Natriumcacodylat-Pufferlösung.HINWEIS: Die hier beschriebenen Bedingungen sind für den Niederdruckfall der Halsschlagader ausreichend und werden dann für den Hochdruckfall einer Arterie modifiziert. Für die Untersuchungen des Systems mit höherem Druck an Arterien, d. h. der Oberschenkelarterie, wird das Paraformaldehyd-Fixiermittel mit 0,1 % Glutaraldehyd ergänzt, und die externe Tropffixierung wird mit der Perfusionsfixierung kombiniert. Führen Sie das Aufnahmeende des Pumpenschlauchs in den Schlauch mit der Pufferlösung ein. Befestigen Sie eine 27G-Butterfly-Nadel mit zugehörigem Schlauch an der Ausgangsseite des Pumpenschlauchs und legen Sie die Nadel in ein sauberes Becherglas. Stellen Sie die Schlauchpumpe auf eine Durchflussrate von 10 mL/min ein. Schalten Sie die Perfusionspumpe ein. Wenn die Pufferlösung von der Nadel in das Becherglas zu fließen beginnt, schalten Sie die Pumpe aus. Der Schlauch und die Nadel sind nun für die transkardiale Perfusion vorbereitet. Legen Sie die Brusthöhle frei, indem Sie mit einer Präparierschere und einer stumpfen Pinzette einen Mittellinienschnitt in die Haut von der Oberseite des Brustbeins bis einige Millimeter über die Unterseite des Brustbeins hinaus machen. Machen Sie Querschnitte entlang der Basis des Brustkorbs, beginnend an der Mittellinie und von medial nach lateral auf jeder Seite. Unmittelbar vor Beginn der transkardialen Perfusion schneiden Sie den Brustkorb schnell auf und reflektieren Sie jede Seite, um das Herz freizulegen. Schalten Sie die Schlauchpumpe ein. Platzieren Sie die Spitze der 27G-Butterfly-Nadel in der Basis des linken Ventrikels. Während Sie die Nadel fest in der linken Herzkammer halten, schneiden Sie mit einer scharfen Präparierschere einen Schlitz in die rechte Ohrmuschel, damit Blut und Perfusionsflüssigkeit abfließen können. Notieren Sie sich die Uhrzeit auf dem Timer. 3 min mit Pufferlösung durchbluten, um das Blut aus dem Kreislaufsystem zu spülen. Während Sie die Nadel noch fest im linken Ventrikel halten, schalten Sie die Peristaltikpumpe aus und schieben Sie das Aufnahmeende des Schlauchs der Peristaltikpumpe auf den 50-ml-Schlauch mit der Fixierlösung. Notieren Sie sich die Uhrzeit auf dem Timer. Schalten Sie die Schlauchpumpe wieder ein und perfundieren Sie 7 Minuten lang mit der Fixierlösung. Schalten Sie die Schlauchpumpe aus. Nehmen Sie die Nadel aus der linken Herzkammer und stecken Sie sie in ein Abfallbecherglas. Legen Sie das Entnahmeende des Pumpenschlauchs in ein Becherglas mit destilliertem Wasser. Schalten Sie die Schlauchpumpe ein und lassen Sie ca. 20 ml Wasser durch den Schlauch und aus der 27G-Nadel in das Abfallbecherglas fließen, um den Schlauch zu reinigen. Achten Sie darauf, dass das gesamte Wasser aus dem Schlauch und der Nadel austritt, bevor Sie die Pumpe ausschalten. 2. Entnahme von Proben für die Elektronenmikroskopie Nach der Perfusionsfixation, ergänzt mit einem anfänglichen externen Fixiermittel von 2 min, bei Stichwunden der Oberschenkelarterie, präparieren Sie vorsichtig den Teil der Halsvene/Oberschenkelarterie, der die Punktionsstelle und den Thrombus enthält (Abbildung 2A). Machen Sie mit einer scharfen Schere einen diagonalen Schnitt über das distale Ende des Gefäßsegments und einen geraden Schnitt über das proximale Ende des Gefäßsegments.HINWEIS: Diese Art der Schnitte hilft, das Gefäß später zu orientieren und die Richtung des Blutflusses im Gefäß zu erkennen. Tauchen Sie das Gefäßsegment in frisches, raumwarmes 4%iges Paraformaldehyd in Natriumcacodylat-Pufferlösung (0,2 M Natriumcacodylat, 0,15 M Natriumchlorid bei pH 7,4) und stellen Sie es 1 h lang bei Raumtemperatur. Übertragen Sie das fixierte Gewebe für 24 h auf 4 °C. Nehmen Sie am nächsten Tag eine 35-mm-Kulturschale mit einer ~5 mm dicken Silikonmatte (im Voraus gemäß den Anweisungen des Herstellers vorbereitet). Gießen Sie genügend Natriumcacodylat-Pufferlösung in die Schale, um das fixierte Venensegment einzutauchen. Übertragen Sie das Gewebe unter einem Lichtmikroskop (~15-fache Vergrößerung) vorsichtig in die 35-mm-Schale mit der Pufferlösung und stecken Sie jedes Ende des Gefäßes mit winzigen Edelstahlstiften und feiner Pinzette an die Silikonmatte. Reinigen Sie das Segment der Halsvene/Oberschenkelarterie vorsichtig mit einer Mikroschere und einer sehr feinen Pinzette.Nur bei Vena jugularis: Entfernen Sie einen der Stifte und schneiden Sie mit der Mikroschere die Gefäßwand gegenüber der Punktions-/Thrombusstelle in Längsrichtung auf. Öffnen Sie das Gefäß vorsichtig und stecken Sie es mit 4 bis 5 Stecknadeln (die jeweils mit einem Drahtschneider in zwei Hälften geschnitten werden) mit der intraluminalen Seite nach oben an die Silikonmatte. Aspirieren Sie die Pufferlösung, ersetzen Sie sie schnell durch 1%ige Paraformaldehydlösung in Natriumcacodylat-Pufferlösung und legen Sie den Deckel auf die Schale. Lassen Sie das Taschentuch zu keinem Zeitpunkt austrocknen. Halten Sie es immer in Flüssigkeit getaucht. Lagern Sie das Gewebe bei 4 °C, bis es Zeit ist, es für die Elektronenmikroskopie zu verarbeiten (Abbildung 2B). Verarbeiten Sie einige der Proben der Punktionswunde der Halsvene/Oberschenkelarterie für die Bildgebung mit SBF-SEM4 und andere für die Bildgebung mit WA-TEM 8,9. Die WA-TEM-Schritte werden im Folgenden ausführlich beschrieben.ACHTUNG: Alle Arbeiten, bei denen Formaldehyd, Propylenoxid,OsO 4 und 2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30) verwendet werden, sind in einem chemischen Abzug durchzuführen. Dabei handelt es sich um gefährliche Chemikalien. Die Exposition gegenüber OsO4 kann zu Erblindung und Tod führen.HINWEIS: Alle Spül- und Fleckenvolumina betragen mindestens das 2-fache des Volumens der Probe. Die 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) kann durch den 0,1 M Natriumcacodylatpuffer ersetzt werden. Während des Fixierungsverfahrens ist es sehr wichtig, die Proben niemals austrocknen zu lassen, da dies die Ultrastruktur erheblich beeinträchtigen würde. Verwenden Sie Polypropylenrohre. 3. Vorbereitung der Probe für die montierte Weitbereichs-Transmissionselektronenmikroskopie (WA-TEM) HINWEIS: Dieser Schritt stellt einen Entscheidungspunkt dar, an dem sich der Prüfer zur Vorbereitung auf WA-TEM verpflichtet. Dieses präparative Verfahren unterstützt SBF-SEM nicht. Bei SBF-REM-Volumen-EM müssen alle Färbungen vor dem Einbetten in Kunststoff durchgeführt werden. UnterPunkt 4 finden Sie ein SBF-SEM-Vorbereitungsprotokoll. Waschen Sie die Gewebeprobe in der 35-mm-Schale 2x mit Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) oder PBS bei Raumtemperatur (RT). Halten Sie die Probe fest, damit Sie die Ausrichtung der Probe durch diese vorbereitenden Schritte verfolgen können. Fixieren Sie mit 0,8 mL 0,05 % Malachitgrün/ 2,5 % Glutaraldehyd/ 0,1 M Natriumcacodylat (pH 6,7 – 7,0) für 20 min auf Eis. Fixiermittel entfernen und Probe 4x für je 5 min mit 0,1 M Natriumcacodylat waschen. 0,1 M Natriumcacodylat entfernen. Postfix mit 0,8 mL 0,8 % K3Fe(CN)6 oder K4Fe(CN)6 / 1,0 % OsO4 K3Fe(CN)6 in 0,1 M Natriumcacodylat. Legen Sie eine Abdeckung über die Schale, um das Licht fernzuhalten (OsO4 ist lichtempfindlich). 20 min bis 1 h bei RT färben. Entfernen Sie das OsO4 und spülen Sie es 4x für jeweils 5 min mit 0,1 M Natriumcacodylatpuffer. Entfernen Sie den Natriumcacodylatpuffer und färben Sie ihn 20 Minuten lang mit 1% Gerbsäure auf Eis. Gerbsäure entfernen und 5 min mit 0,1 M Natriumcacodylatpuffer 1x und 2x für jeweils 5 min mit molekularem destilliertem (DI) Wasser waschen. Mit 0,5 % Uranylacetat (UA) für 1 h RT oder über Nacht bei 4 °C im Dunkeln färben. Entfernen Sie das Uranylacetat und spülen Sie es 5x für jeweils 5 Minuten mit molekularem destilliertem Wasser aus. Schneiden Sie vor dem letzten Waschen und während die Probe noch in DI-Wasser getaucht ist, mit einer Rasierklinge die Silikonmatte um die festgesteckte Probe herum. Heben Sie dieses kleine Stück Silikonmatte aus der Platte und legen Sie es in einen Polypropylenschlauch.HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Probe im Schlauch am Silikonstück festgehalten bleibt. Der Umstieg auf Polypropylenrohre in diesem Schritt ist notwendig, da das in den nachfolgenden Schritten verwendete Propylenoxid das Polystyrol der 35 mm Platten abbaut. Nach Entfernen des letzten Puffers 1x kurz mit 25%igem Ethanol spülen. Entsorgen Sie das 25%ige Ethanol und inkubieren Sie es mit 25%igem Ethanol für 3 Minuten auf Eis. Entfernen Sie das 25%ige Ethanol. 1x kurz mit 50% Ethanol spülen. Entsorgen Sie das 50%ige Ethanol und inkubieren Sie es mit 50% Ethanol für 3 Minuten auf Eis. Entfernen Sie das 50%ige Ethanol und spülen Sie es 1x kurz mit 75% Ethanol aus. Entsorgen Sie das 75%ige Ethanol und inkubieren Sie es mit 75% Ethanol für 3 Minuten auf Eis. Entfernen Sie das 75%ige Ethanol und spülen Sie es 1x kurz mit 95% Ethanol aus. Entsorgen Sie das 95%ige Ethanol und inkubieren Sie es mit 95%igem Ethanol für 3 Minuten auf Eis. Entfernen Sie das 95%ige Ethanol und waschen Sie es 3x, jedes Mal mindestens 10 Minuten, mit 100% Ethanol (200 Proof). Entfernen Sie 100% Ethanol und fügen Sie Propylenoxid (PO) hinzu. 3x je mindestens 10 min spülen, mit PO. Bereiten Sie die Harzmischung wie unten beschrieben vor.Erwärmen Sie die Harzkomponenten auf 60 °C, um sich vollständig zu verflüssigen. Mischen Sie 12,5 mL Embed-218, 7,5 mL Araldite 502 und 27,5 mL DDSA gründlich in einem 50 mL Röhrchen bei 60 °C. Diese Mischung ist 6 Monate bei 4 °C haltbar. Vor Gebrauch auf 60 °C erwärmen. Aliquotieren Sie die erforderliche Menge vor der Verwendung. Betten Sie die Beispiele wie unten beschrieben ein.Geben Sie ein Aliquot der Harzmischung in ein Röhrchen und fügen Sie 20 μl/ml DMP-30-Aktivator hinzu. Durch Drehen bei 60 °C gründlich mischen; Die Farbe sollte dunkler werden. Verdünnen Sie dieses Aliquot des aktivierten Harzes um 50 % in PO und lassen Sie das Harz und das PO vollständig vermischen. Entfernen Sie die letzte PO-Spülung aus dem probenhaltigen Röhrchen und ersetzen Sie es durch das 50%ige Harz/PO-Gemisch, wodurch das Röhrchen fast vollständig gefüllt ist. Drehen Sie die Probe über Nacht bei Raumtemperatur. Mischen Sie am nächsten Tag ein neues Aliquot Harz (1 ml pro Probe) mit 20 μl/ml DMP-30. Legen Sie die Probe in eine Polypropylenschale mit einem kleinen Volumen von 50% Harz/PO-Gemisch aus dem Probenröhrchen unter ein Präpariermikroskop (~6-fache Vergrößerung) und nehmen Sie die Stifte vorsichtig aus dem Gewebe. Übertragen Sie nur das Gewebe in eine andere Polypropylenschale, die eine kleine Menge 100% Harz mit einem DMP-30-Aktivator enthält. Füllen Sie eine Silikoneinbettungsform mit dem 100%igen Harz mit dem DMP-30-Aktivator und legen Sie die Probe vorsichtig in die Form. Die Form in den Ofen schieben und bei 60 °C mindestens 48 h backen. Die vorbereitete Probe ist in Abbildung 2B dargestellt. Durchführung der Bildgebung mit montierter Breitflächen-Transmissionselektronenmikroskopie (WA-TEM) wie in10,11 beschrieben. In Abbildung 3 ist der Prozess von einer ersten Punktion zu einem 3-dimensional gerenderten 1-Minuten-Thrombus dargestellt. Die Aufnahme eines detaillierten Protokolls für die montierte WA-TEM-Elektronenmikroskopie-Bildgebung ist hier nicht enthalten und geht über den Rahmen der vorliegenden Protokolle zur Probenvorbereitung hinaus.HINWEIS: WA-TEM ist eine unterschätzte Fähigkeit der meisten modernen Transmissionselektronenmikroskope mit einem computergesteuerten Tisch. Shareware-Software, die diese Funktionen10,11 unterstützt, ist von der Gruppe von Dr. David Mastronarde, University of Colorado, Boulder (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/, http://bio3d.colorado.edu/imod/.) erhältlich.