排出不全細菌株と単一コピー遺伝子発現システムを用いた アシネトバクター・バウマニの 多剤排出システムの特性評価
Summary
我々は、 アシネトバクター・バウマニの遺伝子操作された排出不全株に、mini-Tn7ベースの発現系を用いて、排出ポンプ遺伝子の単一コピー染色体相補のための簡単な手順について述べる。この精密な遺伝学的ツールにより、多剤耐性病原体における排出ポンプの特性評価の鍵となる遺伝子発現を制御することができます。
Abstract
アシネトバクター・バウマニは 、抗生物質に対する耐性が広範囲に及ぶため、困難なグラム陰性病原体として認識されています。この耐性の背後にあるメカニズムを理解することは、新しく効果的な治療法の選択肢を設計するために重要です。残念なことに、 A. baumannii のこれらのメカニズムを調査する私たちの能力は、適切な遺伝子操作ツールの不足によって妨げられています。本稿では、染色体mini-Tn7系を利用して、機能的なRND型排出機構を欠く A. baumannii 株の単一コピー遺伝子発現を実現する方法について述べる。高コピー数プラスミド上のRND排出オペロンの存在は、細菌細胞による忍容性が低いことが多いため、単一コピー挿入および誘導性排出ポンプ発現は非常に有利です。さらに、排出感受性を高めた組換えmini-Tn7発現ベクターを代理宿主A . baumannii の染色体に組み込むことで、他の排出ポンプからの干渉を回避することができます。このシステムは、特性不明の細菌排出ポンプの調査だけでなく、これらのポンプを標的とする潜在的な阻害剤の有効性を評価するためにも有用です。
Introduction
アシネトバクター・バウマニは 、すべてのクラスの抗生物質に対する包括的な耐性により、世界保健機関(WHO)の最優先病原体です1。これは、主に入院、負傷、または免疫不全の人々に影響を及ぼす日和見病原体です。 A. baumannii は、排出ポンプ を介して 抗生物質を主に回避しており、最も関連性が高いのは、耐性結節部(RND)ファミリーの輸出業者です2。これらの排出ポンプが機構的にどのように機能するかを理解することで、標的を絞った治療オプションを開発することができます。
細胞プロセスを特異的に区別できる一般的な方法の1つは、遺伝子操作によるものです。しかし、A. baumanniiの遺伝子研究に利用できるツールは限られており、実験デザインをさらに混乱させるために、臨床分離株は、遺伝子操作の選択に日常的に使用される抗生物質に耐性を持つことがよくあります3。排出ポンプを具体的に研究する際に遭遇する2つ目のハードルは、排出ポンプが厳密に規制されており、多くの場合、未知の要因によって規制されているため、機能を正確に分離して単一のポンプに帰属させることが困難であることです4。研究ツールボックスを拡張する必要性を認識し、選択マーカー5,6,7の除去を可能にするFlpリコンビナーゼターゲット(FRT)カセットを組み込んだ、ミニTn7ベースの単一コピー挿入誘導性発現システムを開発しました(図1)。シュードモナス8,9,10のために最初に作成されたこのエレガントなクローニングおよび発現システムを使用して、A. baumanniiのRND排出ポンプ欠損株(ATCC 17978::ΔadeIJK、Δ adeFGH、ΔadeAB:以下、A. baumannii AB258と呼ぶ)にシングルコピー排出ポンプ補体を生成し、11.一度に1つの排出ポンプを研究し、(プラスミドベースの発現システムで一般的に見られるように)高コピー発現で細菌細胞を圧倒しないため、干渉を最小限に抑え、合併症を減らしながら、各排出ポンプの重要な生理学的側面についてよりよく学ぶことができます。
本稿では、mini-Tn7システムを使用して、9日間にわたって実行される一連の単純なステップを通じて、A. baumannii AB258の染色体に目的の欠失遺伝子であるRND排出ポンプadeIJKを補完する方法について説明します7。最初の一連のステップでは、十分に保存されたglmS遺伝子(図3A)の下流の単一のattTn7挿入部位に、mini-Tn7ベースの挿入プラスミド(図2A)にクローニングされた欠失排出ポンプ遺伝子を再導入します。このプロセスは、Tn7駆動の挿入に必要なトランスポザーゼ遺伝子をコードする非複製性ヘルパープラスミド(図2B)によって促進されます。第2のステップでは、切除プラスミド(図2C)を使用して、FRT部位(図3B)に隣接するゲンタマイシン遺伝子をFlpリコンビナーゼ媒介で除去し、マークのない株を作製します。このシステムは、抗生物質耐性に関するRND排出ポンプの本質的な役割と可能な阻害剤を解明するために使用されますが、目的の遺伝子を調べるために使用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
A. baumanniiにおける誘導性単一コピー遺伝子発現系の染色体挿入のこの手順は、技術的には簡単で労働集約的ではありませんが、強調する必要があるいくつかの重要なステップがあります。まず、培地を氷冷水で置き換える際に細胞が壊れやすくなるため、コンピテントセルの調製は可能な限り氷上で行う必要があります。遠心分離ステップは4°Cで行うのが理想的ですが、室温での遠心…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、カナダ自然科学工学評議会からAKへのディスカバリー助成金によって支援されました。図で使用されている回路図は、BioRender.com で作成されています。
Materials
| 0.2 mL PCR tube | VWR | 20170-012 | For colony boil preparations and PCR reactions |
| 1.5 mL microfuge tubes | Sarstedt | 72-690-301 | General use |
| 13-mL culture tubes, Pyrex | Fisher | 14-957K | Liquid culture vessels |
| 6x DNA loading buffer | Froggabio | LD010 | Agarose gel electrophoresis sample loading dye |
| Acetic acid, glacial | Fisher | 351271-212 | Agarose gel running buffer component |
| Agar | Bioshop | AGR003 | Solid growth media |
| Agarose | BioBasic | D0012 | Electrophoretic separation of PCR reaction products; used at a concentration of 0.8–2% |
| Agarose gel electrophoresis unit | Fisher | 29-237-54 | Agarose gel electrophoresis; separation of PCR reaction products |
| Carbenicillin | Fisher | 50841231 | Selective media |
| Culture tube closures | Fisher | 13-684-138 | Stainless steel closure for 13-mL culture tubes |
| Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) set | Biobasic | DD0058 | PCR reaction component; supplied as 100 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP; mixed and diluted for 10 mM each dNTP |
| Dry bath/block heater | Fisher | 88860023 | Isotemp digital dry bath for boil preparations |
| Electroporation cuvettes | VWR | 89047-208 | 2 mm electroporation cuvettes with round cap |
| Electroporator | Cole Parmer | 940000009 | 110 VAC, 60 Hz electroporator |
| Ethidium bromide | Fisher | BP102-1 | Visualization of PCR reaction products and DNA marker in agarose gel |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | VWR | CA-EM4050 | Agarose gel running buffer component |
| Gentamicin | Biobasic | GB0217 | For the preparation of selective media |
| Glycerol | Fisher | G33 | Preparation of bacterial stocks for long-term storage in an ultra-low freezer |
| Incubator (shaking) | New Brunswick Scientific | M1352-0000 | Excella E24 Incubator Shaker for liquid culture growth |
| Incubator (static) | Fisher | 11-690-550D | Isotemp Incubator Oven Model 550D for solid (LB agar) culture growth |
| Inoculation loop | Sarstedt | 86.1562.050 | Streaking colonies onto agar plates |
| Inoculation spreader | Sarstedt | 86.1569.005 | Spreading of culture onto agar plates |
| Lysogeny broth (LB) broth, Lennox | Fisher | BP1427 | Liquid growth media (20 g/L: 5 g/L sodium chloride, 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract) |
| Microfuge | Fisher | 75002431 | Sorvall Legend Micro 17 for centrifugation of samples |
| Mini-centrifuge | Fisher | S67601B | Centrifugation of 0.2 mL PCR tubes |
| Petri dishes | SPL Life Sciences | 10090 | For solid growth media (agar plates): 90 x 15 mm |
| Pipettes | Mandel | Various | Gilson single channel pipettes (P10, P20, P200, P1000) |
| Power supply | Biorad | 1645050 | PowerPac Basic power supply for electrophoresis |
| Primers | IDT | NA | PCR reaction component; specific to gene of interest; prepared at 100 μM as directed on the product specification sheet |
| Sucrose | BioBasic | SB0498 | For the preparation of counterselective media for removal of the pFLP2ab plasmid from transformed A. baumannii |
| Taq DNA polymerase | FroggaBio | T-500 | PCR reaction component; polymerase supplied with a 10x buffer |
| Thermal cycler | Biorad | 1861096 | Model T100 for PCR |
| Toothpicks | Fisher | S24559 | For patching colonies onto agar plates |
| Trizma base | Sigma | T1503 | Agarose gel running buffer component |
| Ultrapure water | Millipore Sigma | ZLXLSD51040 | MilliQ water purification system: ultra pure water for media and solution preparation, and cell washing |
| Wide range DNA marker | Biobasic | M103R-2 | Size determination of PCR products on an agarose gel |
| Wooden inoculating sticks | Fisher | 29-801-02 | Inoculating cultures with colonies from agar plates |
Referenzen
- Prioritization of pathogens to guide research, discovery, research and development of new antibiotics for drug-resistant bacterial infections, including tuberculosis. World Health Organization Available from: https://www.who.int/publications/i/item/WHO-EMP-IAU-2017.12 (2017)
- Kornelsen, V., Kumar, A. Update on multidrug resistance efflux pumps in Acinetobacter spp. Antimicrob Agents Chemother. 65 (7), e00514-00521 (2021).
- Sykes, E. M., Deo, S., Kumar, A. Recent advances in genetic tools for Acinetobacter baumannii. Front Genet. 11, 601380 (2020).
- Kumar, A., Chua, K. L., Schweizer, H. P. Method for regulated expression of single-copy efflux pump genes in a surrogate Pseudomonas aeruginosa strain: identification of the BpeEF-OprC chloramphenicol and trimethoprim efflux pump of Burkholderia pseudomallei 1026b. Antimicrob Agents Chemother. 50 (10), 3460-3463 (2006).
- Kumar, A., Dalton, C., Cortez-Cordova, J., Schweizer, H. P. Mini-Tn7 vectors as genetic tools for single copy gene cloning in Acinetobacter baumannii. J Microbiol Methods. 82 (3), 296-300 (2010).
- Ducas-Mowchun, K., et al. Next generation of Tn7-based single-copy insertion elements for use in multi- and pan-drug resistant strains of Acinetobacter baumannii. Appl Environ Microbiol. 85 (11), e00066-00119 (2019).
- Ducas-Mowchun, K., De Silva, P. M., Patidar, R., Schweizer, H. P., Kumar, A. Tn7-based single-copy insertion vectors for Acinetobacter baumannii. Methods Mol Biol. 1946, 135-150 (2019).
- Schweizer, H. P. Applications of the Saccharomyces cerevisiae Flp-FRT system in bacterial genetics. J Mol Microbiol Biotechnol. 5 (2), 67-77 (2003).
- Choi, K. H., et al. A Tn7-based broad-range bacterial cloning and expression system. Nat Methods. 2 (6), 443-448 (2005).
- Choi, K. H., Schweizer, H. P. Mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nat Protoc. 1 (1), 153-161 (2006).
- Kornelsen, V., Unger, M., Kumar, A. Atorvastatin does not display an antimicrobial activity on its own nor potentiates the activity of other antibiotics against Acinetobacter baumannii ATCC 17978 or A. baumannii AB030. Access Microbiol. 3, 000288 (2021).
- Reyrat, J. M., et al. Counterselectable markers: untapped tools for bacterial genetics and pathogenesis. Infect Immun. 66 (9), 4011-4017 (1998).
- Gay, P., et al. Positive selection procedure for entrapment of insertion sequence elements in gram-negative bacteria. J Bacteriol. 164, 918-921 (1985).
- Kyriakidis, I., Vasileiou, E., Pana, Z. D. Tragiannidis, Acinetobacter baumannii antibiotic resistance mechanisms. Pathogens. 10 (3), 373 (2021).
- Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. CLSI Supplement M100., 31st edn. , (2021).
- Dijkshoorn, L., Nemec, A., Seifert, H. An increasing threat in hospitals: multidrug-resistant Acinetobacter baumannii. Nature Reviews Microbiology. 5, 939-951 (2007).
- Yildirim, S., Thompson, M. G., Jacobs, A. C., Zurawski, D. V., Kirkup, B. C. Evaluation of parameters for high efficiency transformation of Acinetobacter baumannii. Sci Rep. 25 (6), 22110 (2016).
- Thompson, M. G., Yildirim, S. Transformation of Acinetobacter baumannii: electroporation. Methods Mol Biol. 1946, 69-74 (2019).
- Choi, K. H., DeShazer, D., Schweizer, H. P. Mini-Tn7 insertion in bacteria with multiple glmS-linked attTn7 sites: example Burkolderia mallei ATCC 2334. Nat Protoc. 1 (1), 162-169 (2006).
- Jittawuttipoka, T., et al. Mini-Tn7 vectors as genetic tools for gene cloning at a single copy number in an industrially important and phytopathogenic bacteria, Xanthomonas spp. FEMS Microbiol Lett. 298 (1), 111-117 (2009).
- Pérez-Varela, M., Tierney, A. R. P., Kim, J. S., Vázquez-Torres, A., Rather, P. Characterization of RelA in Acinetobacter baumannii. J Bacteriol. 202 (12), e00045 (2020).
- Williams, C. L., et al. Characterization of Acinetobacter baumannii copper resistance reveals a role in virulence. Front Microbiol. 11, 16 (2020).
