Charakterisierung von Multidrug-Efflux-Systemen in Acinetobacter baumannii unter Verwendung eines Efflux-defizienten Bakterienstamms und eines Single-Copy-Genexpressionssystems
Summary
Wir beschreiben ein einfaches Verfahren zur chromosomalen Einzelkopie-Komplementierung eines Efflux-Pumpengens unter Verwendung eines mini-Tn7-basierten Expressionssystems in einen gentechnisch veränderten Efflux-defizienten Stamm von Acinetobacter baumannii. Dieses präzise genetische Werkzeug ermöglicht eine kontrollierte Genexpression, die für die Charakterisierung von Effluxpumpen in multiresistenten Krankheitserregern von entscheidender Bedeutung ist.
Abstract
Acinetobacter baumannii ist aufgrund seiner weit verbreiteten Resistenz gegen Antibiotika als anspruchsvoller gramnegativer Erreger anerkannt. Es ist entscheidend, die Mechanismen hinter dieser Resistenz zu verstehen, um neue und wirksame Therapieoptionen zu entwickeln. Leider wird unsere Fähigkeit, diese Mechanismen bei A. baumannii zu untersuchen, durch den Mangel an geeigneten Genmanipulationswerkzeugen behindert. Hier beschreiben wir Methoden zur Verwendung eines chromosomalen mini-Tn7-basierten Systems, um eine Einzelkopie-Genexpression in einem A. baumannii-Stamm zu erreichen, dem funktionelle RND-Typ-Efflux-Mechanismen fehlen. Einzelkopieninsertion und induzierbare Effluxpumpenexpression sind sehr vorteilhaft, da das Vorhandensein von RND-Efflux-Operonen auf Plasmiden mit hoher Kopienzahl von Bakterienzellen oft schlecht vertragen wird. Darüber hinaus hilft der Einbau rekombinanter mini-Tn7-Expressionsvektoren in das Chromosom eines Surrogat-A . baumannii-Wirts mit erhöhter Effluxempfindlichkeit, Interferenzen durch andere Effluxpumpen zu umgehen. Dieses System ist nicht nur für die Untersuchung uncharakterisierter bakterieller Effluxpumpen wertvoll, sondern auch für die Bewertung der Wirksamkeit potenzieller Inhibitoren, die auf diese Pumpen abzielen.
Introduction
Acinetobacter baumannii ist aufgrund seiner umfassenden Resistenz gegen alle Klassen von Antibiotika ein Krankheitserreger der Weltgesundheitsorganisation mit höchster Priorität1. Es ist ein opportunistischer Erreger, der hauptsächlich hospitalisierte, verletzte oder immungeschwächte Menschen betrifft. A. baumannii entzieht sich Antibiotika weitgehend über Effluxpumpen, wobei die relevanteste die Exporteursfamilie der Resistance-Nodulation-Division (RND)ist 2. Wenn man versteht, wie diese Effluxpumpen mechanistisch funktionieren, kann man gezielte therapeutische Optionen entwickeln.
Eine gängige Methode, um zelluläre Prozesse spezifisch zu unterscheiden, ist die genetische Manipulation. Die für genetische Studien von A. baumannii verfügbaren Werkzeuge sind jedoch begrenzt, und um das experimentelle Design weiter zu verwirren, sind klinische Isolate oft resistent gegen die Antibiotika, die routinemäßig für die Selektion bei genetischen Manipulationen verwendet werden3. Eine zweite Hürde bei der Untersuchung von Ausflusspumpen besteht darin, dass sie streng reguliert werden – oft durch unbekannte Faktoren -, was es schwierig macht, eine einzelne Pumpe genau zu isolieren und ihrer Funktion zuzuordnen4. Angesichts dieser Notwendigkeit, den Forschungswerkzeugkasten zu erweitern, haben wir ein induzierbares Mini-Tn7-basiertes, induzierbares Expressionssystem mit Einzelkopie-Insertion entwickelt, das eine Flp-Rekombinase-Zielkassette (FRT) enthält, die die Entfernung des Selektionsmarkers 5,6,7 ermöglicht (Abbildung 1). Dieses elegante Klonierungs- und Expressionssystem wurde erstmals für Pseudomonas 8,9,10 entwickelt und verwendet, um Einzelkopie-Effluxpumpenkomplemente in einen RND-Effluxpumpen-defizienten Stamm von A. baumannii (ATCC 17978::ΔadeIJK,Δ adeFGH,Δ adeAB: im Folgenden als A. baumannii AB258 bezeichnet) zu erzeugen, den wir11. Wenn man in der Lage ist, eine Effluxpumpe nach der anderen zu untersuchen und die Bakterienzellen nicht mit einer hohen Kopienexpression zu überfordern (wie es im Allgemeinen bei plasmidbasierten Expressionssystemen der Fall ist), kann man die kritischen, physiologischen Aspekte jeder Effluxpumpe mit minimaler Interferenz und reduzierten Komplikationen besser kennenlernen.
Dieser Artikel beschreibt, wie das Mini-Tn7-System verwendet wird, um ein deletiertes Gen von Interesse, die RND-Effluxpumpe adeIJK, durch eine Reihe von unkomplizierten Schritten, die im Laufe von 9 Tagen durchgeführt werden, in das Chromosom von A. baumannii AB258 zu ergänzen7. Die erste Gruppe von Schritten führt die deletierten Effluxpumpengene, die in das mini-Tn7-basierte Insertionsplasmid kloniert wurden (Abbildung 2A), an der einzelnen att-Tn7-Insertionsstelle stromabwärts des gut konservierten glmS-Gens wieder ein (Abbildung 3A). Dieser Prozess wird durch ein nicht-replikatives Helferplasmid (Abbildung 2B) erleichtert, das für die Transposase-Gene kodiert, die für die Tn7-gesteuerte Insertion benötigt werden. Die zweite Gruppe von Schritten verwendet ein Exzisionsplasmid (Abbildung 2C) zur Flp-Rekombinase-vermittelten Entfernung des Gentamicin-Gens, flankiert von FRT-Stellen (Abbildung 3B), um einen unmarkierten Stamm zu erzeugen. Obwohl dieses System verwendet wird, um die wesentlichen Rollen und möglichen Inhibitoren von RND-Effluxpumpen in Bezug auf Antibiotikaresistenz aufzuklären, kann es zur Untersuchung jedes Gens von Interesse verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Auch wenn dieses Verfahren zur chromosomalen Insertion eines induzierbaren Einzelkopie-Genexpressionssystems in A. baumannii technisch einfach und nicht arbeitsintensiv ist, gibt es einige wichtige Schritte, die hervorgehoben werden müssen. Zunächst muss die Präparation der kompetenten Zellen so weit wie möglich auf Eis erfolgen, da die Zellen beim Austausch des Mediums durch eiskaltes Wasser zerbrechlich werden. Idealerweise werden die Zentrifugationsschritte bei 4 °C durchgeführt, aber eine Zentrifugatio…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch einen Discovery Grant des Natural Science and Engineering Council of Canada an AK unterstützt. Die in den Abbildungen verwendeten Schaltpläne werden mit BioRender.com erstellt.
Materials
| 0.2 mL PCR tube | VWR | 20170-012 | For colony boil preparations and PCR reactions |
| 1.5 mL microfuge tubes | Sarstedt | 72-690-301 | General use |
| 13-mL culture tubes, Pyrex | Fisher | 14-957K | Liquid culture vessels |
| 6x DNA loading buffer | Froggabio | LD010 | Agarose gel electrophoresis sample loading dye |
| Acetic acid, glacial | Fisher | 351271-212 | Agarose gel running buffer component |
| Agar | Bioshop | AGR003 | Solid growth media |
| Agarose | BioBasic | D0012 | Electrophoretic separation of PCR reaction products; used at a concentration of 0.8–2% |
| Agarose gel electrophoresis unit | Fisher | 29-237-54 | Agarose gel electrophoresis; separation of PCR reaction products |
| Carbenicillin | Fisher | 50841231 | Selective media |
| Culture tube closures | Fisher | 13-684-138 | Stainless steel closure for 13-mL culture tubes |
| Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) set | Biobasic | DD0058 | PCR reaction component; supplied as 100 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP; mixed and diluted for 10 mM each dNTP |
| Dry bath/block heater | Fisher | 88860023 | Isotemp digital dry bath for boil preparations |
| Electroporation cuvettes | VWR | 89047-208 | 2 mm electroporation cuvettes with round cap |
| Electroporator | Cole Parmer | 940000009 | 110 VAC, 60 Hz electroporator |
| Ethidium bromide | Fisher | BP102-1 | Visualization of PCR reaction products and DNA marker in agarose gel |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | VWR | CA-EM4050 | Agarose gel running buffer component |
| Gentamicin | Biobasic | GB0217 | For the preparation of selective media |
| Glycerol | Fisher | G33 | Preparation of bacterial stocks for long-term storage in an ultra-low freezer |
| Incubator (shaking) | New Brunswick Scientific | M1352-0000 | Excella E24 Incubator Shaker for liquid culture growth |
| Incubator (static) | Fisher | 11-690-550D | Isotemp Incubator Oven Model 550D for solid (LB agar) culture growth |
| Inoculation loop | Sarstedt | 86.1562.050 | Streaking colonies onto agar plates |
| Inoculation spreader | Sarstedt | 86.1569.005 | Spreading of culture onto agar plates |
| Lysogeny broth (LB) broth, Lennox | Fisher | BP1427 | Liquid growth media (20 g/L: 5 g/L sodium chloride, 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract) |
| Microfuge | Fisher | 75002431 | Sorvall Legend Micro 17 for centrifugation of samples |
| Mini-centrifuge | Fisher | S67601B | Centrifugation of 0.2 mL PCR tubes |
| Petri dishes | SPL Life Sciences | 10090 | For solid growth media (agar plates): 90 x 15 mm |
| Pipettes | Mandel | Various | Gilson single channel pipettes (P10, P20, P200, P1000) |
| Power supply | Biorad | 1645050 | PowerPac Basic power supply for electrophoresis |
| Primers | IDT | NA | PCR reaction component; specific to gene of interest; prepared at 100 μM as directed on the product specification sheet |
| Sucrose | BioBasic | SB0498 | For the preparation of counterselective media for removal of the pFLP2ab plasmid from transformed A. baumannii |
| Taq DNA polymerase | FroggaBio | T-500 | PCR reaction component; polymerase supplied with a 10x buffer |
| Thermal cycler | Biorad | 1861096 | Model T100 for PCR |
| Toothpicks | Fisher | S24559 | For patching colonies onto agar plates |
| Trizma base | Sigma | T1503 | Agarose gel running buffer component |
| Ultrapure water | Millipore Sigma | ZLXLSD51040 | MilliQ water purification system: ultra pure water for media and solution preparation, and cell washing |
| Wide range DNA marker | Biobasic | M103R-2 | Size determination of PCR products on an agarose gel |
| Wooden inoculating sticks | Fisher | 29-801-02 | Inoculating cultures with colonies from agar plates |
Referenzen
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