العزل السريع للبويضات المرحلة الأولى في الزرد الخالية من الخلايا الحبيبية
Summary
يصف هذا البروتوكول إجراء معدلا لعزل بويضات المرحلة الأولى النظيفة بسرعة في الزرد الخالي من الخلايا الحبيبية ، وبالتالي توفير طريقة ملائمة للبحث الخاص بالبويضات.
Abstract
دراسة تطور البويضة لها آثار كبيرة في علم الأحياء التنموي. تم استخدام الزرد (Danio rerio) على نطاق واسع ككائن نموذجي للتحقيق في عمليات النمو المبكرة من البويضة إلى الجنين. في الزرد ، تحاط البويضات بطبقة واحدة من الخلايا الحبيبية الجسدية. ومع ذلك ، فإن فصل الخلايا الحبيبية عن البويضات يشكل تحديا ، حيث أن تحقيق البويضات النقية أمر بالغ الأهمية للتحليل الدقيق. على الرغم من اقتراح طرق مختلفة لعزل بويضات الزرد في مراحل نمو مختلفة ، إلا أن التقنيات الحالية تقصر في إزالة الخلايا الحبيبية تماما ، مما يحد من دقة تحليل الجينوم الذي يركز فقط على البويضات. في هذه الدراسة ، نجحنا في تطوير عملية سريعة وفعالة لعزل البويضات النقية في المرحلة الأولى في الزرد مع القضاء على تلوث الخلايا الحبيبية. تسهل هذه التقنية التحليل الكيميائي الحيوي والجزيئي ، لا سيما في استكشاف جوانب البنية اللاجينية والجينوم الخاصة بالبويضات. والجدير بالذكر أن الطريقة سهلة الاستخدام ، وتقلل من تلف البويضات ، وتوفر حلا عمليا للبحث والتحليل اللاحق.
Introduction
الزرد هو من بين أهم النظم النموذجية في علم الأحياء التنموي. في السنوات الأخيرة ، استخدمت العديد من الدراسات الزرد كنموذج لدراسة الأحداث البيولوجية الهامة والعمليات التنظيمية من البويضة إلى الجنين. وتشمل هذه العمليات المعقدة لتطور البويضةونضجها 1 ، ووظائف جينات الأم2 ، وتنظيم التحولات بين الأم والزيجوت3 ، وتحليلات omics الشاملة4.
تلعب الخلايا الحبيبية ، وهي الخلايا الجسدية التي تغلف وتغذي البويضة النامية داخل جريب المبيض 5,6 ، دورا محوريا في هذه العملية التنموية. عندما تتطور الخلايا الجرثومية البدائية (PGCs) إلى oogonia ، فإنها تصبح محاطة بطبقة أحادية من الخلايا الحبيبية7. جنبا إلى جنب مع الخلايا thecal الخارجية ، تشكل البويضة والخلايا الحبيبية المحيطة بها جريبا ناضجا8. بالنظر إلى التمييز الأساسي بين الخلايا الجرثومية والخلايا الجسدية ، فإن الحصول على عينة بويضة نقية أمر حتمي ، خاصة بالنسبة للتحليلات المتعلقة بالجينوم.
داخل البنية الجرابية لسمك الزرد ، تظهر الخلايا الحبيبية عادة قطرا يبلغ بضعة ميكرونات فقط8 ، مما يؤكد على الترابط الحميم بين الخلايا الحبيبية والبويضات9. يمثل هذا الارتباط الوثيق تحديا في تحقيق الفصل الكامل بسبب الاختلاف الكبير في كل من عدد وحجم الخلايا الحبيبية مقابل البويضات (مئات الخلايا الحبيبية مقارنة بخلية بيضة واحدة)10,11. حتى الحد الأدنى من التلوث بخلية حبيبية واحدة يمكن أن يعيق التحليلات النهائية التي تستهدف البويضات على وجه التحديد. لذلك ، بالنسبة للدراسات التي تركز على الخصائص الجينومية واللاجينية ، فإن القضاء على الخلايا الحبيبية أمر ضروري.
بالاستفادة من المعايير المورفولوجية المميزة جيدا ، يمكن تمييز البويضات في كل مرحلة بناء على القطر11. يتم تصنيف عملية تكوين البويضة في الزرد إلى خمس مراحل وفقا للمورفولوجيا والنمط النووي11. المرحلة الأولى من البويضات (قطرها 7-140 ميكرومتر) تشمل البويضات من بداية الانقسام الاختزالي إلى المرحلة المبكرة من الانقسام الاختزالي I. بشكل حاسم ، هذه البويضات شفافة ، مما يسمح بمراقبة النواة المركزية من خلال الضوء المرسل (الشكل 1Ai). المرحلة الثانية من البويضات (قطرها 140-340 ميكرومتر) تصبح تدريجيا رغوية وشفافة. مع تضخم البصيلات وانتشار الحويصلات القشرية ، يصبح من الصعب تمييز الحويصلات الجرثومية في المركز12 (الشكل 1Aii). تتراكم البويضات في المرحلة الثالثة (قطرها 340-690 ميكرومتر) تدريجيا فيتلوجينين ، وتصبح البصيلات الطازجة معتمة بشكل متزايد (الشكل 1Aiii). يستمر الانقسام الاختزالي في المرحلة الرابعة من البويضات (قطرها 690-730 ميكرومتر) حيث تدخل الكروموسومات منتصف الانقسام الميوزي الثاني ، حيث تتجمد (الشكل 1Aiv). نضجت بويضات المرحلة الخامسة (قطرها 730-750 ميكرومتر) وجاهزة للإباضة 7,11 (الشكل 1Av).
بناء على الخصائص الفريدة لكل مرحلة من المراحل المذكورة أعلاه ، تم اقتراح طريقة لعزل البويضات من المراحل الأولى إلى الثالثة عن طريق هضم مبيض الزرد باستخدام محلول هضمي يحتوي على كولاجيناز I وكولاجيناز II وهيالورونيداز ، يليه الترشيح من خلال مصفاة خلية محددة الحجم13. ومع ذلك ، في حين أن هذه الطريقة تسمح بالحصول على البويضات في مراحل النمو المختلفة ، إلا أنها تفشل في فصل البويضات والخلايا الحبيبية تماما. اقترح باحثون آخرون أيضا طرقا لفصل الخلايا الحبيبية عن البويضات. ومع ذلك ، تعتمد هذه الطرق في المقام الأول على الأساليب الميكانيكية ، والتي يمكن أن تسبب تلف البويضة ، وتستغرق وقتا طويلا ، وهي غير كافية للحصول على عدد كبير من البويضات للتحليل14،15.
نظرا لقيود الأساليب الحالية ومتطلبات البحث المحددة ، تهدف هذه الدراسة إلى وضع إجراء لفصل البويضات والخلايا الحبيبية تماما والحصول على عدد كاف من بويضات المرحلة الأولى النظيفة للتحليل. بالتوسع في الطريقةالمشار إليها 13 ، نستخدم عازلا محسنا للهضم (انظر جدول المواد) ألطف ويسهل تشتت البويضات وتفكك الخلايا الحبيبية. بعد ذلك ، يتم تمرير البويضات من خلال مصفاة الخلية ، تليها الغسيل والمزيد من الاختيار المجهري ، مما يتيح الحصول على عدد كبير من البويضات النظيفة في المرحلة الأولى.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الدراسة ، طورنا طريقة لعزل بويضات المرحلة الأولى النقية والنظيفة ، باستثناء الخلايا الحبيبية ، لتحليل المصب (خاصة التحليلات الجينومية). بمقارنة هذه الطريقة المعدلة مع الطريقةالمشار إليها 13 ، فإن بويضات المرحلة الأولى التي تم الحصول عليها باستخدام ه?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32170813 و 31871449) وقسم العلوم والتكنولوجيا في سيتشوان (2024NSFSC0651) ، ومشروع 1 · 3 · 5 لتخصصات التميز – صندوق البحوث السريرية ، مستشفى غرب الصين ، جامعة سيتشوان (2024HXFH035). يود المؤلفون أن يشكروا Zhao Wang و Yanqiu Gao من مختبر جراحة الأطفال على تربية الزرد المرتبط بهذا العمل. يود المؤلفون أيضا أن يشكروا جميع المراجعين الذين شاركوا في المراجعة ، وكذلك MJEditor (www.mjeditor.com) لتقديم خدمات تحرير اللغة الإنجليزية أثناء إعداد هذه المخطوطة.
Materials
| Kinger's cell dissociation solution | PlantChemMed | PC-33689 | Kinger's cell dissociation solution can be stored stably at -20 °C after packaging and can be used after thawing at low temperature (4 °C). It can be used directly for dissociating zebrafish ovaries. The optimal temperature is 28.5 °C, for approximately 2-3 hours. The duration can be adjusted according to the specific dissociation conditions, either shortened or extended (https://www.plantchemmed.com/chanpin?productNo=PC-33689). |
| Cell strainers (100 μm ) | Falcon | 352360 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axio Zoom.V16 | |
| Forceps | Dumont | #5 | |
| Glass capillary needle | / | / | Blunted by burning with lighter |
| Hoechst | Yesen | 40732ES03 | |
| Low adsorption pipette tips (10 μl ) | Labsellect | T-0010-LR-R-S | |
| Leibovitz’s L-15 medium medium (with L-glutamine) | Hyclone | SH30525.01 | |
| Ice bucket | / | / | Ice-cold water is used to euthanize zebrafish |
| Incubator | WIGGENS | WH-01 | |
| Juvenile fish | / | / | 5–6 weeks post-fertilization, standard length [SL] of 10–15 mm |
| Plastic dish (35 mm ) | SORFA | 230101 | |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-161 | |
| Tissue Culture Plate (6-wells) | SORFA | 0110006 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Toosl | #15000-00 |
Referenzen
- Qin, J. Y., et al. Unraveling the mechanism of long-term bisphenol S exposure disrupted ovarian lipids metabolism, oocytes maturation, and offspring development of zebrafish. Chemosphere. 277, 130304 (2021).
- Hau, H. T. A., et al. Maternal Larp6 controls oocyte development, chorion formation and elevation. Development. 147 (4), 187385 (2020).
- Cabrera-Quio, L. E., Schleiffer, A., Mechtler, K., Pauli, A. Zebrafish ski7 tunes RNA levels during the oocyte-to-embryo transition. PLoS Genet. 17 (2), e1009390 (2021).
- Liu, Y., et al. Single-cell transcriptome reveals insights into the development and function of the zebrafish ovary. Elife. 11, 76014 (2022).
- Li, C. W., Ge, W. Spatiotemporal expression of bone morphogenetic protein family ligands and receptors in the zebrafish ovary: A potential paracrine-signaling mechanism for oocyte-follicle cell communication. Biol Reprod. 85 (5), 977-986 (2011).
- Zampolla, T., Spikings, E., Rawson, D., Zhang, T. Cytoskeleton proteins F-actin and tubulin distribution and interaction with mitochondria in the granulosa cells surrounding stage III zebrafish (Danio rerio) oocytes. Theriogenology. 76 (6), 1110-1119 (2011).
- Lubzens, E., Young, G., Bobe, J., Cerda, J. Oogenesis in teleosts: How eggs are formed. Gen Comp Endocrinol. 165 (3), 367-389 (2010).
- Song, Y., Hu, W., Ge, W. Establishment of transgenic zebrafish (Danio rerio) models expressing fluorescence proteins in the oocytes and somatic supporting cells. Gen Comp Endocrinol. 314, 113907 (2021).
- Sousa, M. L., et al. Reproductive hormones affect follicular cells and ooplasm of stage I and II oocytes in zebrafish. Reprod Fertil Dev. 28 (12), 1945-1952 (2016).
- Yan, Y. L., et al. Gonadal soma controls ovarian follicle proliferation through Gsdf in zebrafish. Dev Dyn. 246 (11), 925-945 (2017).
- Selman, K., Wallace, R. A., Sarka, A., Qi, X. Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio. J Morphol. 218 (2), 203-224 (1993).
- Wallace, R. A., Selman, K. Ultrastructural aspects of oogenesis and oocyte growth in fish and amphibians. J Electron Microsc Tech. 16 (3), 175-201 (1990).
- Elkouby, Y. M., Mullins, M. C. Methods for the analysis of early oogenesis in zebrafish. Dev Biol. 430 (2), 310-324 (2017).
- Ai, N., Liu, L., Lau, E. S., Tse, A. C., Ge, W. Separation of oocyte and follicle layer for gene expression analysis in zebrafish. Methods Mol Biol. 2218, 1-9 (2021).
- Zhan, C., et al. Explorations of the optimal method for isolating oocytes from zebrafish (Danio rerio) ovary. J Exp Zool B Mol Dev Evol. 330 (8), 417-426 (2018).
- Avma guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. Avma Available from: https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals (2020)
- Phs policy on humane care and use of laboratory animals. Olaw Available from: https://olaw.nih.gov/policies-laws/phs-policy.htm#Introduction (2015)
- Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR J. 53 (2), 192-204 (2012).
